栽培大豆中黃13響應(yīng)強(qiáng)光的轉(zhuǎn)錄組分析

摘要：大豆是我國重要的糧油兼用型農(nóng)作物，正常生長(zhǎng)周期為150 d左右，長(zhǎng)達(dá)5個(gè)月的生命周期使得品種選育工作時(shí)間跨度較長(zhǎng)，優(yōu)良品種更新迭代緩慢。對(duì)在正常光照［200 μmol/（m2·s）］和強(qiáng)光［1 000 μmol/（m2·s）］下生長(zhǎng)的中黃13進(jìn)行表型觀測(cè)及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)光處理的大豆植株相比對(duì)照組表現(xiàn)為株高變矮、植株提前23 d開花，76 d成熟，且2組產(chǎn)量無顯著差異。通過轉(zhuǎn)錄組分析共得到8 520個(gè)差異表達(dá)基因，GO注釋分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因主要富集在葉綠體、類囊體中的光合作用系統(tǒng)、脫氫酶及氧化還原酶活性等植物光保護(hù)系統(tǒng)中；KEGG分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因主要富集在碳水化合物代謝、能量代謝、激素信號(hào)傳導(dǎo)、環(huán)境適應(yīng)相關(guān)通路中。挑選可能參與縮短生命周期的關(guān)鍵差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，匹配率為90%，證明轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果具有可靠性，揭示植物在強(qiáng)光條件下可能通過光信號(hào)、激素信號(hào)等通路引起代謝速率的加快，促使大豆提前完成其生命周期而不影響種子收獲。結(jié)果可為進(jìn)一步闡明大豆強(qiáng)光適應(yīng)性及強(qiáng)光調(diào)控大豆生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制提供新見解。

關(guān)鍵詞：栽培大豆；強(qiáng)光響應(yīng)；加速育種；轉(zhuǎn)錄組分析；基因挖掘

中圖分類號(hào)：S565.101" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）13-0039-08

植物生命周期指植物從種子萌發(fā)、開花、結(jié)實(shí)、成熟、植株衰老至死亡的過程，不同植物因?yàn)楦髯赃z傳特性及生長(zhǎng)環(huán)境的不同，生命周期存在差異，在自然條件下，大多數(shù)植物一年只能收獲1～2代［1］。現(xiàn)今氣候、環(huán)境常處于變化之中，極端天氣易發(fā)，加之人口數(shù)量的增加，研究者們正積極選育具有良好抗性及品質(zhì)優(yōu)異的作物品種［2］。在育種過程中植物生命周期是一個(gè)限制性問題，植株生長(zhǎng)至收獲，并經(jīng)過加代獲得純合品種往往需要多年時(shí)間，這大大延長(zhǎng)了育種的時(shí)間線［3］。

植物對(duì)于環(huán)境變化具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，這為實(shí)現(xiàn)室內(nèi)就地加代，加快優(yōu)良品系的培育提供了可能。Watson等于2018年提出快速育種技術(shù)（speed breeding），即通過人工控制光照（光周期、光照度、光質(zhì)構(gòu)成）和溫度等植物生長(zhǎng)環(huán)境因子，促使植物提前開花、快速成熟，并應(yīng)用于中國春小麥、甘藍(lán)型油菜等長(zhǎng)日照作物，實(shí)現(xiàn)一年三代的生長(zhǎng)［4］。

短日照作物大豆［Glycine max （L.） Merrill］是世界第四大糧食作物，在我國已有近5 000年的栽培歷史，現(xiàn)被廣泛栽培于世界各地［5］，在自然條件下其生長(zhǎng)周期為4～5個(gè)月，研究人員曾利用高光照度，結(jié)合12 h短日照以及紅藍(lán)光配比實(shí)現(xiàn)歐洲商業(yè)大豆品種在室內(nèi)1年培育5代［6］。同時(shí)作為光照敏感作物，已有研究表明，大豆對(duì)強(qiáng)光具有較強(qiáng)的適應(yīng)性。紅光下隨著光照度的增加，大豆晝夜節(jié)律相關(guān)基因振蕩曲線會(huì)在短時(shí)間內(nèi)迅速重置，實(shí)現(xiàn)與環(huán)境的同步［7］。但目前對(duì)于大豆如何響應(yīng)強(qiáng)光以及強(qiáng)光調(diào)控其生長(zhǎng)發(fā)育的分子機(jī)制和完整通路知之甚少。

栽培大豆中黃13是經(jīng)20多年選育出來的高產(chǎn)高蛋白大豆品種，具有抗?jié)场⒖共　⒛透邷氐葍?yōu)良抗性，是國內(nèi)種植范圍最廣的栽培品種之一［8］。目前廣泛采用的大豆參考基因組Glycine_max_v4.0來源于美國品種Williams 82［9］，2018年中黃13基因組的發(fā)布為更多遺傳變異的發(fā)現(xiàn)提供了參考［10-11］，有利于重要農(nóng)藝性狀基因的挖掘及國產(chǎn)優(yōu)質(zhì)大豆品種的培育。

本研究對(duì)中黃13進(jìn)行不同光照度處理，記錄其表型性狀，并對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，挖掘關(guān)鍵差異表達(dá)基因，探究強(qiáng)光調(diào)控大豆生長(zhǎng)發(fā)育及適應(yīng)性的分子機(jī)制，旨在為縮短植物生長(zhǎng)周期及快速培育優(yōu)良作物品種提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及大豆植株處理

供試大豆品種中黃13購自壽光市海洪種子經(jīng)營(yíng)中心。將中黃13種子點(diǎn)播于32孔穴盤中，每孔 2～3粒，分別放置在正常光照度［200 μmol/（m2·s）］及強(qiáng)光下［1 000 μmol/（m2·s）］進(jìn)行育苗，其他培養(yǎng)條件均保持一致（光—暗周期為12 h—12 h，28 ℃）。待出苗后，選取長(zhǎng)勢(shì)較為一致的單株（處理、對(duì)照各40株）移栽至9 cm×9 cm的方盒中繼續(xù)培養(yǎng)，其中30株用于表型觀測(cè)，10株用于取樣測(cè)序。

1.2 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)

試驗(yàn)于2023年2月16日在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所進(jìn)行。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

于移栽后18 d分別對(duì)2組大豆葉片進(jìn)行取樣，送至北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司進(jìn)行葉片總RNA提取、質(zhì)量檢查及cDNA文庫構(gòu)建，并采用Illumina NovaSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.4 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

轉(zhuǎn)錄組分析流程如下：采用fastp（htftps：//github.com/OpenGene/fastp）對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，HISAT2軟件（https：//daehwankimlab.github.io/hisat2）將clean reads比對(duì)至參考基因組Gmax_ZH13_v2.0（https：//ngdc.cncb.ac.cn/search/？dbId=gwhamp;q=GWHAAEV00000000.1amp;page=1），featureCount（https：//subread.sourceforge.net）統(tǒng)計(jì)比對(duì)到每個(gè)基因的reads數(shù)，根據(jù)FPKM（fragments Per Kilobase of exon model per Million mapped fragments）的計(jì)算公式標(biāo)準(zhǔn)化每個(gè)基因在每個(gè)樣本中的表達(dá)量。

1.5 差異表達(dá)基因的篩選

差異表達(dá)基因（DEG）篩選使用DEseq2（https：//bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html）進(jìn)行（|log2FC|＞１，F(xiàn)DRlt;0.05其中FC即fold change，表示差異表達(dá)倍數(shù)），使用R語言、TBtools、PhotoShop軟件對(duì)上述數(shù)據(jù)分析結(jié)果進(jìn)行可視化分析［12］。

使用NCBI-Blast（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對(duì)中黃13與Williams 82蛋白質(zhì)序列，序列相似度大于80%時(shí)鑒定為同源基因，得到中黃13差異表達(dá)基因。

1.6 差異表達(dá)基因qRT-RCR驗(yàn)證

選取10個(gè)關(guān)鍵差異表達(dá)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）驗(yàn)證，利用Primer 5軟件設(shè)計(jì)定量引物，引物序列見表1。使用南京諾唯贊生物科技股份有限公司反轉(zhuǎn)試劑盒對(duì)測(cè)序公司返樣RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；熒光定量試劑為TOYOBO SYBR GreenⅠ，qRT-PCR程序：95" ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸45 s，39個(gè)循環(huán)；內(nèi)參基因選用Actin11［13］；設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，3次技術(shù)重復(fù)，使用2-ΔΔCT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 強(qiáng)光處理下中黃13表型

如圖1所示，強(qiáng)光處理下，中黃13生長(zhǎng)發(fā)育至成熟進(jìn)程明顯加快，生命周期縮短，其中到達(dá)3葉期（V1）階段的平均時(shí)間為9 d，第21天開始開第1朵花（R1），第29天莢果開始發(fā)育（R3），達(dá)到成熟（R7）的最快時(shí)間為76 d，相較對(duì)照組各階段分別提前6、23、21、28 d（圖2-a），其中開花時(shí)間、成熟時(shí)間與對(duì)照組相比有顯著差異（圖2-b），生命周期明顯縮短。其他表型性狀相關(guān)測(cè)定結(jié)果如表2所示。強(qiáng)光下生長(zhǎng)的大豆雖然植株變矮（圖1-e），但產(chǎn)量與對(duì)照并無明顯差異。

2.2 中黃13響應(yīng)強(qiáng)光轉(zhuǎn)錄組分析

2.2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)處理

取對(duì)照組和強(qiáng)光處理組三葉期葉片各3個(gè)樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，將原始測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾得到干凈序列（clean reads）。對(duì)每個(gè)樣本的reads數(shù)、堿基數(shù)目、Q20、Q30及HISAT2比對(duì)率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果（表3）顯示，整體測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量良好，可用于后續(xù)分析。

2.2.2 差異表達(dá)基因鑒定及富集分析

本研究共鑒定出8 520個(gè)差異表達(dá)基因，其中有2 915個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，5 605個(gè)基因下調(diào)表達(dá)（圖3）。

GO注釋分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因主要富集在葉綠體、類囊體中的光合作用系統(tǒng)上以及植物適應(yīng)光脅迫的光保護(hù)機(jī)制上，如光捕獲，脫氫酶、氧化還原酶、蛋白質(zhì)激酶活性的調(diào)節(jié)，對(duì)紫外線（UV）的反應(yīng)等（圖4）。KEGG富集分析結(jié)果顯示，差異表達(dá)基因主要富集在碳水化合物代謝、能量代謝、激素信號(hào)傳導(dǎo)、環(huán)境適應(yīng)相關(guān)通路上（圖5）。

2.2.3 強(qiáng)光下光系統(tǒng)相關(guān)通路富集

強(qiáng)光會(huì)導(dǎo)致植物光系統(tǒng)Ⅰ（PSⅠ）和光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）能量分配比例失衡，觸發(fā)植物多種光保護(hù)機(jī)制［14］，其中保護(hù)酶會(huì)清除葉綠體產(chǎn)生的過量活性氧（ROS），減輕植物體內(nèi)氧化損傷。轉(zhuǎn)錄組分析（圖6）發(fā)現(xiàn)，中黃13在強(qiáng)光處理下，1個(gè)脫氫酶基因ndhB表達(dá)量上調(diào)和1個(gè)還原性輔酶Ⅱ（NADPH）硫氧還蛋白還原酶NTRC基因表達(dá)量下調(diào)［15-16］。此外，葉綠體活動(dòng)相關(guān)基因，如捕光復(fù)合物葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因LHCB1-6、葡萄糖激酶基因GLK1在強(qiáng)光下表達(dá)量均下調(diào)，而參與葉綠素的合成、葉綠體發(fā)育等活動(dòng)的細(xì)胞分裂素反應(yīng)因子CGA1的表達(dá)量顯著上調(diào)，說明大豆可通過在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控相應(yīng)基因的表達(dá)而適應(yīng)光強(qiáng)變化。

2.2.4 植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與提前成熟

光照可以控制激素合成途徑或激活激素誘導(dǎo)下游的調(diào)控通路［17］。在光照誘導(dǎo)下，赤霉素（GA）途徑上的赤霉素合成抑制因子GA2ox基因表達(dá)量下調(diào)［18］，其上游基因STF1表達(dá)量呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)［19］，下游基因DELLA表達(dá)量下調(diào)，而參與調(diào)控葉片衰老［20］的DELLA基因負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子WRKY6表達(dá)量顯著上調(diào)，且經(jīng)過qPCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)量呈現(xiàn)多倍差異（圖7-f）；生長(zhǎng)素途徑中由一些SAGs（senescence-associated genes）編碼的SAUR36也呈現(xiàn)表達(dá)量上調(diào)趨勢(shì)［21］；此外蕓苔素內(nèi)脂基因BZR1表達(dá)量下調(diào)［22］。這些激素信號(hào)通路中基因的表達(dá)變化可能與強(qiáng)光下大豆提前進(jìn)入衰老及種子成熟階段有關(guān)。

2.2.5 光周期途徑基因差異表達(dá)與開花表型

光周期途徑是調(diào)控植物開花和成熟的主要途徑之一，包括光信號(hào)的接收、傳遞及反應(yīng)3個(gè)部分，筆者所在課題組研究發(fā)現(xiàn)，在強(qiáng)光條件下光周期途徑上關(guān)鍵基因呈現(xiàn)出差異表達(dá)現(xiàn)象。HY5基因在強(qiáng)光下表達(dá)量上調(diào)，植物成花和生物鐘節(jié)律關(guān)鍵因子GmGI、GmLUX1、GmCOL1a及新型多效性基因TOE4b在強(qiáng)光下表達(dá)量明顯下調(diào)［23-26］。以上基因表達(dá)的差異可能與強(qiáng)光下中黃13提前開花有關(guān)。

2.3 表型關(guān)聯(lián)的差異表達(dá)基因qRT-PCR驗(yàn)證

對(duì)“2.2”節(jié)中的差異表達(dá)基因進(jìn)行可視化聚類分析（圖6），并從相關(guān)通路中選取10個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，其中9個(gè)基因與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致，1個(gè)基因相反，準(zhǔn)確率為90%，證明轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果具有可靠性。圖4和圖7-a、圖7-b、圖7-c揭示，大豆在強(qiáng)光環(huán)境下會(huì)引起葉片內(nèi)光系統(tǒng)基因的差異表達(dá)；與此同時(shí)，KEGG富集分析結(jié)果表明，植物激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑上的相關(guān)基因表達(dá)量存在顯著差異（圖5，圖7-d、圖7-e、圖7-f）。前人研究表明，這些激素信號(hào)通路參與調(diào)控植物開花及葉片衰老，可能與大豆在強(qiáng)光下提前開花、成熟，生命周期縮短有關(guān)；此外，一些光周期途徑上的基因雖不在GO、 KEGG分析顯著富集范圍內(nèi)，但是它們也存在表達(dá)差異（圖7-g、圖7-h、圖7-i、圖7-j）。

3 討論與結(jié)論

本研究中強(qiáng)光下大豆生長(zhǎng)至收獲的時(shí)間基本與前人的研究結(jié)果［6］一致。本研究進(jìn)一步表明， 適度強(qiáng)光會(huì)引起大豆光系統(tǒng)發(fā)生一系列反應(yīng)，可能導(dǎo)致生物量積累速度產(chǎn)生差異，生物量積累到達(dá)閾值后，在植物激素的參與下， 大豆提前衰老，從而大大縮短生命周期。本研究挖掘到的差異表達(dá)基因信息可為后續(xù)基因功能驗(yàn)證提供參考，且可結(jié)合幼胚離體培養(yǎng)、分子標(biāo)記輔助選擇等生物技術(shù)手段進(jìn)一步縮短育種年限，解決育種周期長(zhǎng)、優(yōu)良品種更新慢等種業(yè)面臨的問題［27-28］。

為應(yīng)對(duì)強(qiáng)光，植物進(jìn)化出有效的光保護(hù)系統(tǒng)。在中黃13轉(zhuǎn)錄組分析富集結(jié)果中，光系統(tǒng)途徑上關(guān)鍵基因的表達(dá)表現(xiàn)出對(duì)強(qiáng)光的響應(yīng)。已有研究證明，在強(qiáng)光下，煙草ndhB突變體更易積累過多活性氧［29］，而光合系統(tǒng)中的捕光復(fù)合體LHCB1可以捕獲光能，并將多余的光能轉(zhuǎn)化為熱量，以此保護(hù)植物免受光損傷［30］，對(duì)于平衡PSⅠ和PSⅡ及碳固定具有重要作用；轉(zhuǎn)錄因子GLKs可調(diào)控葉綠體的發(fā)育及分化，有助于整合光合效率并提升作物產(chǎn)量［31］。研究表明，強(qiáng)光下大豆可通過清除過多ROS、減少光的吸收、耗散多余光能及改變系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄組和代謝組等途徑來適應(yīng)強(qiáng)光，保護(hù)自身生長(zhǎng)、存活及繁殖。

光照、葉綠體和植物激素之間存在密切聯(lián)系。光照可觸發(fā)植物激素信號(hào)傳導(dǎo)，植物激素可以調(diào)節(jié)葉綠體的發(fā)育及豐度［32］。受強(qiáng)光誘導(dǎo)的植物激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑主要包括油菜素內(nèi)酯（BRs）、細(xì)胞分裂素（CKs）、生長(zhǎng)素和赤霉素（GA）途徑等。在關(guān)鍵基因的篩選中，與對(duì)照相比，BZR1、STF1、GA2ox7a、DELLA等在強(qiáng)光下都存在表達(dá)差異。

此外，在強(qiáng)光下中黃13表現(xiàn)出提前開花、成熟現(xiàn)象。植物開花途徑包括光周期途徑、春化途徑、自主調(diào)節(jié)途徑及赤霉素途徑。在光周期途徑中，GI基因調(diào)控植物的生物鐘節(jié)律及開花；敲除GmLUX1、GmLUX2基因會(huì)導(dǎo)致大豆的極度晚花；TOE4b基因直接抑制大豆成花素基因FT2a和FT5a的轉(zhuǎn)錄，使大豆延遲開花［23-26］。植物激素同時(shí)也是植物成花轉(zhuǎn)變的重要因素。赤霉素途徑中的DELLA蛋白被認(rèn)為是開花位點(diǎn)FT的負(fù)調(diào)控因子［33］。以上關(guān)鍵基因在強(qiáng)光下的表達(dá)變化均符合大豆提前開花的趨勢(shì)，表明中黃13在強(qiáng)光下可通過光信號(hào)與激素的協(xié)同作用調(diào)控開花。特別地，HY5基因在光保護(hù)及開花中都具有重要作用。HY5在強(qiáng)光下可以通過結(jié)合花色素MYB75，刺激花青素的合成，促進(jìn)ROS的清除［34］，并且HY5也可以與藍(lán)光/UV-B受體CRY1協(xié)同參與植物光形態(tài)建成［35］。

最后，植物激素與環(huán)境共同調(diào)控植物成熟及葉片衰老，其中涉及WRKYs類轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)調(diào)控，如WRKY6在赤霉素途徑中受到DELLA蛋白的負(fù)調(diào)控［20］，并在生長(zhǎng)素調(diào)控途徑中，可以直接結(jié)合一部分SAGs正向調(diào)控葉片衰老，在經(jīng)歷強(qiáng)光時(shí)，葉片衰老速度加快，以減少地上葉片生物量，使得植物順利繁殖［21］。

綜上，通過對(duì)強(qiáng)光下栽培大豆品種中黃13表型及轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序分析，挖掘到植物響應(yīng)強(qiáng)光并調(diào)控其開花及成熟的關(guān)鍵差異表達(dá)基因，為進(jìn)一步研究大豆強(qiáng)光適應(yīng)性分子機(jī)制、縮短育種周期、加快培育優(yōu)質(zhì)大豆品種提供理論支持。

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