利用流式細胞術鑒定3種李屬植物基因組大小及染色體倍性檢測

摘 要：【目的】研究適合不同李屬資源的FCM檢測體系，估測其基因組大小及倍性，為李屬資源的鑒定、分類及基因組和轉錄組等深入研究提供依據。

【方法】利用FCM對3種常用的細胞核裂解液進行篩選與優化，選取最適宜的裂解液鑒定3種李屬植物進行基因組大小和檢測染色體倍性。

【結果】LB01、Marie’s和WPB 3種裂解液對櫻桃李檢測效果均較好，而WPB裂解液檢測效果最佳；Marie’s和LB01裂解液與歐洲李不匹配，改良的WPB裂解液最適合歐洲李；杏李與LB01裂解液不匹配，WPB裂解液對杏李的裂解效果好于Marie’s裂解液，而改良的WPB裂解液對杏李的裂解效果均最好。櫻桃李和杏李基因組大小范圍分別為491.22～566.40 Mb和514.46～573.83 Mb，歐洲李資源平均基因組大小為1 678.37 Mb。

【結論】櫻桃李和杏李資源均為二倍體，歐洲李資源全部為六倍體，李屬植物每個種內不同品種之間的基因組大小存在一定差異。

關鍵詞：李；流式細胞術（FCM）；染色體倍性；基因組大小

中圖分類號：S188"" 文獻標志碼：A"" 文章編號：1001-4330（2024）07-1673-09

0 引 言

【研究意義】李屬（Prunus）植物在世界上約有19～40個種，其中包括一些中間雜交種［1］，原產自中國和引種至中國栽培多年的主要有9個種和3個變種，其中歐洲李（P.domesitica L.）、櫻桃李（P.cerasifera Ehrh.）和杏李（P.simonii Carr.）是新疆主要栽培種。歐洲李系列優良品種在新疆廣泛栽培，截至2021年栽培面積達4.25×104 hm2［2］。目前，新疆杏李主要分布在阿克蘇地區，櫻桃李主要分布在伊犁哈薩克自治州，其果實多用于加工果醬。新疆李資源種類較多，不同種類在形態特征和生物學特性等具有豐富的多樣性，同一種內的不同品種在部分性狀上表現差異顯著。因此，鑒定李屬不同植物基因組大小和染色體倍性，對李屬植物進化、分類及構建高通量測序文庫等基因組相關的研究提供基礎資料有實際意義。【前人研究進展】測定植物基因組大小的常用方法有孚爾根微顯影法［3］、流式細胞術（Flow Cytometry， FCM）［4］和高通量測序法［5］，植物染色體倍性鑒定多采用染色體觀察法和形態觀察法。FCM可以檢測植物染色體倍性和基因組大小，且檢測成本低而效率高，其主要通過檢測懸浮在液體流中單細胞標記的熒光信號，可以快速而準確的獲取植物基因組大小和染色體倍性，通常以變異系數（Coefficient of Variation，CV）值來評判細胞核裂解效果。目前，該技術已在多種果樹中得到了廣泛應用［6，7］。Ben等［8］檢測了45份野生型和栽培型中國李的基因組大小，并以建立的李的分類地位研究其遺傳變異。孫琪［9］通過染色體核型分析明確了供試的30株歐洲李均為六倍體。楊麗等［10］利用FCM對2份歐洲李和3份杏李資源進行了檢測，確定了其DNA相對含量和染色體倍性?！颈狙芯壳腥朦c】有文獻研究顯示，雖然對中國李和部分歐洲李、杏李品種進行了鑒定，但關于利用FCM鑒定新疆櫻桃李、歐洲李和杏李資源的檢測體系仍不完整，其基因組大小和倍性相關的基礎數據庫也不完備。需建立李屬植物的FCM檢測體系?！緮M解決的關鍵問題】建立李屬植物的FCM檢測體系，并鑒定42份櫻桃李、歐洲李和杏李資源的基因組大小和染色體倍性，為李屬資源的鑒定、分類及基因組和轉錄組等深入研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試的42份李屬種質資源采自新疆農業科學院輪臺果樹資源圃（84°22′E、41°78′Ｎ，海拔906 m），樹齡8～10年生，株行距2 m×4 m，水肥管理良好，園相整齊，植株生長健壯。于2023年6月剪取新梢帶回實驗室水培，摘取幼嫩葉片用于流式細胞試驗，外標選用已完成基因組測序的二倍體碭山梨，其基因組大小為527 Mb［6］。表1

1.2 方 法

1.2.1 裂解液及DNA熒光染料的配制

配置好的裂解液用0.22 μm濾膜的真空泵進行抽濾，并置于4℃條件下保存。PI染液配制參照田新民等［11］的配制方法，在PI染液中加入500 μg/mL RNA酶，排除雙鏈RNA對檢測核DNA含量時的干擾，并選用非特異性標記碘化丙啶（PI）作熒光探針。表2

1.2.2 細胞核懸浮液的制備及上機檢測

參照?，摤摰龋?］制備細胞懸浮液流程，稱取0.1 g幼嫩葉片，依次用蒸餾水、去離子水沖洗2～3遍，擦干水，去除葉片主脈后置于預冷的培養皿中，加入2.0 mL預冷的裂解液，在冰浴條件下用刀片垂直向下快速切碎，4℃冷藏條件下放置2 min后，使用500目濾膜一次性過濾至1.5 mL的離心管中， 4℃冷藏條件下孵育5 min。在4℃條件下，1 000 r/min離心5 min。棄上清液至0.1 mL刻度處，分別加入200 μL預冷裂解液和預冷PI染液，輕輕混勻后置于4℃黑暗條件下染色10 min。最后將染色的細胞核懸浮液移至流式細胞儀（BD，美國，Accuri C6）上樣處，設置參數為低流速、FL2熒光通道、收集5 000個細胞核顆粒后，檢測其熒光強度。

1.2.3 細胞核裂解液的優化

選取3種常用的細胞核裂解液分別對櫻桃李、歐洲李和杏李資源進行裂解，比對裂解效果，對WPB裂解液進行優化。參考趙孟良等［15］方法，即在配WPB裂解液過程中，加入2%的PVP-10藥劑，其它步驟不變。

1.2.4 基因組大小及倍性計算

利用參照樣本和待測樣本G0/G1峰的熒光強度值，計算基因組大小和染色體倍性。絕對核DNA含量通常pg為單位，基因組大小多用bp為單位，二者轉換關系為1pgDNA=0.978×103Mp［16］。待測樣本基因組大小和染色體倍性的計算方法［17］。

待測樣基因組大小=參照樣本基因組大小×（待測樣本G0/G1峰平均熒光強度/參照樣本G0/G1峰平均熒光強度）。

待測樣本倍性值（DI）=待測樣本G0/G1峰熒光強度/二倍體參照材料熒光強度。

若DI接近1時，為二倍體；當DI接近2時，為四倍體；當DI接近3時，為六倍體。

1.3 數據處理

使用Cytometer software workspace軟件收集基因組大小和倍性的數據，并用SPSS25.0軟件進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 櫻桃李裂解液的篩選

研究表明，LB01、Marie’s和WPB三種裂解液對櫻桃李制備的樣本主峰窄，收集的粒子數量多而速度快，整體效果較好，但LB01和Marie’s裂解液所制備的樣本普遍存在主峰左側帶有較少背景碎片的現象，LB01制備樣品的背景碎片整體多于Marie’s，WPB裂解液相對而言制備櫻桃李樣品的效果最好。圖1

2.2 "歐洲李裂解液的篩選及優化

研究表明，LB01和Marie’s裂解液制備的歐洲李樣品懸浮液均呈現單側峰，即碎片峰，LB01產生的主峰不明顯，而Marie’s產生的主峰值較低，LB01的裂解效果較Marie’s差，上述裂解液與歐洲李材料不匹配。WPB裂解液制備的歐洲李樣品懸浮液雖然呈現單側峰，但其主峰窄而峰值較高，CV值多在5%以內。改良的WPB對大多數歐洲李樣品的懸浮液并未產生單側峰，僅在主峰左側呈現較少背景碎片，裂解過程中收集的粒子速度快而數量多，裂解效果最好。圖2

2.3 杏李裂解液的篩選及優化

研究表明，LB01裂解液制備的杏李樣品懸浮液產生的信號峰均為單側峰，主峰不明顯，裂解效果差，該裂解液不適合杏李材料。Marie’s和WPB制備的懸浮液產生的主峰效果較好，CV值均在5%范圍內，但二者制備的懸浮液中摻雜有較少雜質，并且Marie’s收集的粒子數量較少。改良的WPB裂解液制備的懸浮液出峰效果最好，收集的粒子數量多而速度快，可以檢測出絕大多數杏李品種的基因組大小和倍性關系。圖3

2.4 不同李屬植物的基因組大小和倍性的檢測

研究表明，42份李屬種質資源平均峰值的CV值均低于5%，結果可信；19份櫻桃李資源的基因組大小為491.22～566.40 Mb，熒光通導值與參照樣本的比值為0.93～1.08，全部為二倍體；17份歐洲李資源的基因組大小為1 616.50～1 737.97 Mb，熒光通導值與參照樣本的比值為3.07～3.30，均為六倍體；6份杏李資源的基因組大小為514.46～573.83 Mb，熒光通導值與參照樣本的比值為0.97～1.09，全部為二倍體。櫻桃李、歐洲李和杏李每個種內不同品種之間的基因組大小存在一定差異，其中吉歐2紅櫻桃李和吉歐58早熟紅櫻桃李在櫻桃李資源中差異最顯著，歐洲李資源中極早熟1號、MY-O2013-2分別與總統差異最顯著，杏李中風味皇后和味厚差異最顯著。表3

3 討 論

3.1

植物幼嫩葉片相比于植物的根尖［18］、花粉［19］、成熟葉片［20］等材料，幼嫩葉片的檢測效果最好。研究選用3種李屬資源植物的幼嫩葉片進行了檢測，其變異系數CV值均低于5%，符合木本植物CV值的合格范圍［21］，檢測效果較好。此外，過多的葉片用量由于自身天然熒光物（葉綠素）的影響也可造成試驗結果誤差［22］。

3.2

王利虎等［22］對6種常用裂解液的主要配方及所適用于不同植物的范圍進行了歸納整理，認為WPB裂解液為歐洲李的最佳解離液［23］。研究發現，WPB、LB01和Marie’s 3種不同裂解液對櫻桃李大部分樣本的裂解效果均較好，同時也發現同一種裂解液可能也適用于多種不同的植物，此類現象與王利虎等［22］歸納整理的結果相一致，而WPB裂解液對櫻桃李的裂解效果更好。Marie’s和LB01 2種裂解液與歐洲李不匹配，而WPB裂解液在解離歐洲李樣品時主峰效果較好，但單側峰較大；LB01裂解液與之不匹配，WPB裂解液對杏李的裂解效果好于Marie’s裂解液。改良的WPB裂解液對歐洲李和杏李的裂解效果均最好，因為歐洲李、杏李幼嫩葉片中富含酚類和多糖等粘性物質，而增加PVP的含量對消除酚類和多糖等物質起到了較好的作用。趙孟良等［15］對比添加PVP含量對菊芋的檢測效果時，發現增加PVP的用量后對3種不同電壓下的菊芋雜峰均減少。此外，李雯雯等［20］研究發現，單一的裂解液種類對新疆野杏的解離效果較差，改良的MgSO4-LB01混合裂解液最適合新疆野杏，是否混合裂解液在歐洲李和杏李等李屬植物中也同等適用，有待進一步研究。

3.3

FCM的鑒定效率高于染色體計數法［24-26］。試驗研究利用FCM檢測結果表明，19份櫻桃李資源均為二倍體，與前人研究結果一致［27］，17份歐洲李資源均為六倍體，6份杏李資源均為二倍體，與吳麗萍等［28］研究結果一致，但研究的歐洲李資源的基因組大小與吳麗萍等［28］研究結果存在一定差異，原因是與歐洲李不同品種間的差異有關。研究還發現，同一品種的基因組大小存在一定差異，此類現象張俊環等［29］也有過報道，其原因主要與所選擇的儀器設備、外標植物和測定方法等不同有關［28］。

4 結 論

歐洲李和杏李最適宜的解離液為改良的WPB裂解液；利用FCM鑒定的櫻桃李和杏李資源均為二倍體，其基因組大小范圍分別為491.22～566.40 Mb和514.46～573.83 Mb，而歐洲李資源全部為六倍體，平均基因組大小為1 678.37 Mb。鑒定3種李屬資源基因組大小和染色體倍性。

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Identification of genome size and chromosomal ploidy of

three prunus species by flow cytometry

WANG Yatong1， GUO Jingjing1， YANG Fenfen1， NIU Yingying1， ZHANG Shikui2，

FAN Guoquan2， WANG Shangdong2， GENG Wenjuan1

（1. College of Horticulture， Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830052， China; 2. Luntai Fruit Tree Germplasm Resource Nursery， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences， Luntai Xinjiang 841600， China）

Abstract：【Objective】 To explore FCM detection system suitable for different Prunus resources， estimate their genome size and ploidy， and provide basis for the identification， classification， genome and transcriptome of Prunus resources.

【Methods】" Three commonly used nuclear lysates were screened and optimized by FCM， and the most suitable lysates were selected to detect the genome size and chromosome ploidy of three plum plants.

【Results】 LB01， Marie's and WPB lysates were all effective in the detection of P.simonii Carr.， and WPB lysates was the best. The two lysates Marie's and LB01 did not match with P.domestica L.， and the improved WPB lysate was the most suitable for P.simonii Carr. and LB01 lysate did not match， WPB lysate had better cracking effect on P.simonii Carr. than Marie's lysate， and the improved WPB lysate had the best cracking effect on P.simonii Carr. The two lysates Marie's and LB01 did not match with P.domestica L.， and the improved WPB lysate was the most suitable for P.domestica L.. The P.simonii Carr. and LB01 lysate did not match， WPB lysate had better cracking effect on P.simonii Carr. .than Marie's lysate， and the improved WPB lysate had the best cracking effect on P.simonii Carr. With genome sizes ranging from 491.22 to 566.40 Mb and 514.46 to 573.83" Mb， respectively， with an average genome size of 1，678.37 Mb.

【Conclusion】" The identified germplasm resources of P.cerasifera Ehrh. and P.simonii Carr. were all diploid， while the P.domestica L. germplasm resources were all hexaploid， the genome size of different varieties in each species of Prunus genus is different.

Key words：plum; flow cytometry（FCM）; chromosomal ploidy; genome size

Fund project：Basic Scientific Research Project for Colleges and Universities of Xinjiang Uygur Autonomous Region （XJEDU2022Z005）

Correspondence author：GENG Wenjuan （1983-）， female， from Altay， Xinjiang，Ph. D.， professor， research direction： fruit germplasm resources and cultivation physiology， （E-mail） gwj0526@163.com

收稿日期（Received）：

2024-01-13

基金項目：

新疆維吾爾自治區高校基本科研業務費科研項目（XJEDU2022Z005）

作者簡介：

王亞銅（1993-），男，寧夏隆德人，博士研究生，研究方向為果樹種質資源與分子育種，（E-mail）wyt012129@163.com

通訊作者：

耿文娟（1983-），女，新疆阿勒泰人，教授，博士，碩士生/博士生導師，研究方向為果樹種質資源與栽培生理，（E-mail）gwj0526@163.com