甜玉米基因Sugary1（Su1)序列的變異分析

摘 要：【目的】研究甜玉米基因Sugary1（Su1）序列，分析核苷酸多態(tài)性及檢驗，研究不同來源甜玉米中的Su1的等位變異位點，為甜玉米的品種改良和提高品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。

【方法】以B73的Su1基因組序列為模板，對170份甜玉米自交系的Su1基因進(jìn)行測序，研究玉米Su1基因序列的多態(tài)性。

【結(jié)果】共有97個核苷酸位點發(fā)生變異，包含85個SNP位點，12個InDel位點。其中，位于編碼區(qū)的SNP位點12個，InDel位點0個；位于非編碼區(qū)的SNP位點85個，InDel位點12個。編碼區(qū)中SNP位點同義突變有5個，非同義突變7個。自交系材料分為76個單倍型，該基因編碼區(qū)序列將自交系材料分為47種單倍型。

【結(jié)論】甜玉米Su1基因經(jīng)歷了明顯的人工選擇。

關(guān)鍵詞：甜玉米；Sugary1；等位變異；中性檢驗；單倍型

中圖分類號：S513；S188"" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A"" 文章編號：1001-4330（2024）07-1605-10

0 引 言

【研究意義】甜玉米（Zea mays L.saccharata Sturt）含有豐富的維生素、氨基酸、礦物質(zhì)和微量元素，以及谷胱甘肽、亞油酸等營養(yǎng)物質(zhì)，是一種高品質(zhì)、高營養(yǎng)的果蔬［1-4］。普通甜玉米可以加工成不同的食品和飲料，如玉米面粉、玉米糖漿、玉米油等［5-6］。甜玉米是受一個或多個隱性基因控制的胚乳突變體，是一種特用型玉米。根據(jù)基因型和胚乳特性不同可分為普通甜玉米Sugary1，（Su1），超甜玉米（Shrunken2，Brittleendosperm1），加強(qiáng)甜玉米（Suguary enchancer1）［1-5］。【前人研究進(jìn)展】Su1基因突變影響普通甜玉米的糖分含量，su1突變體在淀粉合成途徑中失去了功能［6-8］，編碼淀粉脫分支酶，該酶通過切斷α-1，6-糖苷鍵去除了淀粉中部分分枝［9-13］，蔗糖積累變少。普通甜玉米在胚乳乳熟期的總糖量達(dá)到了15.6%，外型呈現(xiàn)透明角質(zhì)狀，有細(xì)小褶皺［14-16］。在su1主要的等位基因中，su1-ref、su1-nc和su1-sw3個等位基因編碼酶蛋白序列中包含單氨基酸替換使蛋白失活［12］。【本研究切入點】目前針對甜玉米Su1基因序列變異多態(tài)性鮮見報道。需分析不同來源甜玉米中Su1的等位變異位點和單倍型分型。【擬解決的關(guān)鍵問題】分析170份甜玉米自交系Su1基因進(jìn)行序列變異，檢測甜玉米自然群體中Su1的變異位點，研究群體材料的單倍型，以輔助甜玉米品種改良。

1 材料與方法

1.1 材 料

選用170份甜玉米自交系作為材料（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種栽培研究所玉米中心提供）。種植于2022年3月在上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院莊行綜合試驗站的大棚內(nèi)。

1.2 方 法

供試玉米幼苗3葉1心時剪取嫩葉，采用改良的CTAB［17］法提取基因組DNA。并用分光光度計檢測DNA濃度、利用瓊脂糖凝膠電泳方法檢測DNA質(zhì)量。在玉米數(shù)據(jù)庫（https：//www.maizegdb.org/），以B73參考基因組的Su1 （Zm00001eb174590）序列為模板，分別獲得各材料的Su1基因序列信息，使用Primer 5.0軟件根據(jù)基因序列設(shè)計引物序列，并在NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）驗證引物的特異性。分段擴(kuò)增各材料的Su1基因，并進(jìn)行一代測序。表1

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用ContigExpress軟件和MEGA 7.0進(jìn)行人工校對和序列變異分析。中性檢驗采用DNAsp軟件［18］進(jìn)行，Tajima’ D［19］檢驗通常被廣泛用于檢測目標(biāo)DNA序列是否符合中性進(jìn)化模型，以確定其在進(jìn)化過程中是否存在非隨機(jī)性。θ和π［20］是核苷酸多態(tài)性分析過程中的常用參數(shù)，其中π被用來衡量同一位點不同序列兩兩之間的差異；而群體突變率則是用θ來衡量。

2 "結(jié)果與分析

2.1 Su1基因目的片段擴(kuò)增

研究表明，6對引物覆蓋甜玉米Su1基因的不同區(qū)域。通過普通PCR方法，以B73的基因Su1 （Zm00001eb174590）序列為模板，利用6對引物1-F/1-R，2-F/2-R，3-F/3-R，4-F/4-R，5-F/5-R，6-F/6-R，分別對170份自交系材料的Su1基因進(jìn)行分段擴(kuò)增。圖1

2.2 甜玉米Su1基因的序列變異

研究表明，以玉米自交系B73的Su1基因為參考，檢測170個玉米自交系中Su1的等位變異位點，共得到Su1基因的全長序列7 429 bp，包括5 609 bp的非編碼區(qū)和1 820 bp的編碼區(qū)。非編碼區(qū)的變異位點顯示高于編碼區(qū)，非編碼區(qū)是主要的遺傳變異來源。共有97個核苷酸位點發(fā)生變異，其中包含85個SNP位點和12個InDel位點。其中，位于編碼區(qū)的SNP位點有12個，InDel位點0個，位于非編碼區(qū)的SNP位點有85個，InDel位點有12個。變異頻率最高的第16外顯子區(qū)段，為0.51，在10個區(qū)段未發(fā)現(xiàn)變異位點。表2，表3

所有內(nèi)含子，外顯子的Tajiama’ D值均為正值，內(nèi)含子3、4、14、15、16和17和外顯子17、18達(dá)到了顯著水平（Plt;0.05），內(nèi)含子8、10、11、12的Tajiama’ D的值均為正值且達(dá)到了極顯著水平（Plt;0.01），這些內(nèi)含子區(qū)和外顯子區(qū)序列中大多變異位點具有低等頻率的等位差異存在。Fu與Li的D*測驗和F*測驗結(jié)果與Tajim′s D測驗結(jié)果基本相吻合。內(nèi)含子9、外顯子4、6、7、8、9、11、12、14和15未發(fā)生堿基變化，所以Tajim’s D值為0。在供試群體中，Su1基因經(jīng)歷了明顯的人工選擇。表4

2.3 Su1基因的單倍型

研究表明，從170份材料中共檢測出76個單倍型，攜帶單倍型Hap_10的自交系數(shù)目最多，為46個。有10種單倍型包含兩個及以上的自交系，有160個單倍型僅包含一個自交系。圖2

將供試材料劃分成47種單倍型，自交系在這些單倍型中分布不均勻，其中，HC09包含的單倍型個數(shù)最多，有55個供試自交系，占供試材料的32.4％，是該基因編碼區(qū)主要單倍型。攜帶兩個以上自交系的編碼區(qū)單倍型有14個，僅含有一個供試自交系的單倍型有33個。圖3

在編碼區(qū)的12個SNP變異位點中，有5個為同義突變位點，不能引起編碼蛋白質(zhì)序列的改變；其余7個為非同義突變位點，可以引起編碼蛋白質(zhì)序列的改變。自然群體中Su1基因編碼21種SU1蛋白質(zhì)，長度為606或605或604 aa。序列長度的差異是由于編碼區(qū)一個6 bp的InDel引起的。在47種單倍型中，只有11種單倍型包含2個以上的自交系，其余的只包含1個自交系。第9種單倍型包含55個甜玉米自交系，所占比率超過32.4%。此外，HC01、HC07和HC18也是高頻單倍型。圖4

3 討 論

3.1

研究結(jié)果表明，所有內(nèi)含子，外顯子的Tajiama’ D值均為正值，內(nèi)含子3、4、14、15、16、17和外顯子17、18達(dá)到了顯著水平（Plt;0.05），內(nèi)含子8、10、11、12的Tajiama’ D的值均為正值且達(dá)到了極顯著水平（Plt;0.01），這些內(nèi)含子區(qū)和外顯子區(qū)序列中大多變異位點具有低等頻率的等位差異存在，對于編碼區(qū)的選擇強(qiáng)于其他各個區(qū)段。Fu與Li的D*測驗和F*測驗結(jié)果與Tajim′s D測驗結(jié)果基本相吻合，表明在供試群體中，Su1基因經(jīng)歷了明顯的自然和人工雙重選擇。

3.2

楊澤峰等［21］對104個玉米自交系的Dbf1基因進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在編碼區(qū)平均120 bp有1個SNP。Ching等［22］使用序列變異分析對36個玉米自交系進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在非編碼區(qū)，每31 bp會出現(xiàn)一個SNP；而在編碼區(qū)，每124 bp會出現(xiàn)一個SNP。研究發(fā)現(xiàn)在編碼區(qū)1 749 bp有12個SNP，平均每146 bp中有1個SNP。與前人研究相比編碼區(qū)的SNP變異頻率略高，可能因為試驗研究的群體較楊澤鋒等［22］的群體大。

4 結(jié) 論

甜玉米Su1基因的全長序列在170個甜玉米自交系中共發(fā)現(xiàn)85個SNP位點和12個InDel位點。該基因的編碼區(qū)含有12個SNP，其中7個為非同義突變位點，并編碼6種Su1基因蛋白質(zhì)。在供試的玉米群體中，該基因經(jīng)歷了明顯的人工選擇。

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Variation analysis of sweetness gene Sugary1 （Su1）

sequence in Sweet corn

YANG Caixia1，2， GU Wei2，3， GUAN Yuan2，3， QU Jingtao2，3，

DANG Dongdong2，3，WU Penghao1， ZHENG Hongjian2，3

（1." College of Agronomy， Xinjiang Agricultural University， Urumqi， 830052， China; 2 .Institute of Crop Breeding and Cultivation， Shanghai Academy of Agricultural Sciences/CIMMYT-China Special Maize Research Center， Shanghai 201403， China; 3.Shanghai Special Maize Engineering Technology Research Center， Shanghai 201403， China）

Abstract：【Objective】 The Sugary1 （Su1） gene of sweet corn was analyzed by nucleotide polymorphism analysis and neutral test， and the allelic variation sites of Su1 in sweet corn from different sources were analyzed， which provided a theoretical basis for variety improvement and quality improvement of sweet corn.

【Methods】 In order to illustrate the sequence polymorphism of maize gene Su1， the Su1gene in 170 sweet corn inbred lines was sequenced， using the genomic sequence of B73 as the reference.

【Results】" Analysis showed that 97 nucleotide sites were mutated， including 85 SNPs sites and 12 InDels locus. Among them， there were 12 SNPs loci and 0 InDel in the coding region， 85 SNPs loci and 12 InDels in the non-coding region. There were 5 synonymous mutations at SNP site and 7 non-synonymous mutations in the coding region. The inbred lines were divided into 76 haplotypes according to the full-length sequence of Su1 gene， and 47 haplotypes were divided into 47 haplotypes according to the coding region of the gene.

【Conclusion】" The Su1 gene had undergone obvious artificial selection.

Key words：sweet corn; Sugary1; allelic variation; neutral test; haplotype

Fund projects： Science and Technology Plan Project of Shanghai Municipal Commission of Science and Technology＂Nutritional and Healthy Functional Germplasm Innovation and Breeding of New Varieties of Fresh＂（20392000400）; Shanghai Science and Technology Agricultural Technology Innovation Project＂Creation of haploid-inducing lines in glutinous maize and application to engineering breeding＂（2022-02-08-00-F01190）

Correspondence author： WU Penghao（1984-）， male， from Xinjiang，professor，research direction： maize genetic breeding，（E-mail）craie788@126.com

ZHENH Hongjian（1973-）， male， from Shandong， researcher， research direction： maize genetic breeding，（E-mail）hjzh6188@163.com

收稿日期（Received）：

2023-12-17

基金項目：

上海市科學(xué)技術(shù)委員會科技計劃項目“鮮食玉米營養(yǎng)、健康功能種質(zhì)創(chuàng)新與新品種選育”（20392000400）; 上海市科技興農(nóng)項目“糯玉米單倍體誘導(dǎo)系的創(chuàng)制及工程化育種應(yīng)用”（2022-02-08-00-F01190）

作者簡介：

楊彩霞（1997-），女，重慶人，碩士研究生，研究方向為玉米遺傳育種，（E-mail）yangcx4760@163.com

通訊作者：

吳鵬昊（1984-），男，新疆人，教授，研究方向為玉米遺傳育種，（E-mail）craie788@126.com

鄭洪建（1973-），男，山東人，研究員，研究方向為玉米遺傳育種，（E-mail）hjzh6188@163.com