高效液相色譜法測定壯藥伊血安無糖型顆粒中異綠原酸A和異綠原酸B的含量

摘要：目的：優化伊血安無糖型顆粒檢驗方法，并建立質量標準。方法：采用高效液相色譜法測定制劑中的異綠原酸A、異綠原酸B。結果：建立伊血安無糖型顆粒中的異綠原酸A、異綠原酸B含量測定方法，異綠原酸A在0.023 0～0.735 4 μg內呈良好的線性關系，回收率在98.16%～103.25%，RSDlt;2.0%；異綠原酸B在0.025 3～0.809 3 μg內呈良好的線性關系，回收率在98.83%～102.82%，RSDlt;2.0%。結論：優化了伊血安無糖型顆粒質量標準，含量測定操作方法簡單，準確度高，重現性好，可有效控制本品質量。

關鍵詞：伊血安無糖型顆粒；滇桂艾納香；異綠原酸A；異綠原酸B；含量

滇桂艾納香是伊血安無糖型顆粒的君藥，發揮活血止血作用的主藥材，現代研究資料表明，酚酸類化合物是滇桂艾納香的主要活性成分之一。滇桂艾納香具有活血、止血、利水的功效，而滇桂艾納香的止血活性［1］成分為乙酸乙酯提取物中的酚酸類化合物，說明異綠原酸A、異綠原酸B與滇桂艾納香止血功效密切相關。本研究以異綠原酸A、異綠原酸B作為伊血安無糖型顆粒中滇桂艾納香的指標性成分，完善伊血安無糖型顆粒質量標準，為更好地監控和評價伊血安無糖型顆粒質量提供科學依據。

1儀器與試藥

1.1儀器

十萬分之一電子分析天平（XS205，瑞士Mettler Toledo公司）；數控超聲波清洗器（KQ5200E型，昆山市超聲儀器有限公司）；數顯恒溫水浴鍋（HH-S6，江蘇金怡儀器科技有限公司）；高效液相色譜儀：Waters 1525二元梯度泵、Waters 2489型紫外檢測儀、Waters 2707自動進樣器、Breeze2色譜工作站；色譜柱：大連依利特C18柱（5 μm，4.6×250 mm）、Waters Xbridge-C18柱（5 μm，4.6×250 mm）和ECOSIL ODS-C18柱（5 μm，4.6×250 mm）。

1.2試劑與試藥

異綠原酸A（純度＞98%、RFS-Y06801911011，供含量測定用，成都瑞芬思生物科技有限公司）；異綠原酸B（純度≥98%、DST 210625—037，供含量測定用，樂美天醫藥/德思特生物技術有限公司）；滇桂艾納香對照藥材（批號121647—201602，中國食品藥品檢定研究院）；伊血安無糖型顆粒（批號：220809、220810、220811、220812、220813、220814、220815、220816、220401、200301、220116），陰性對照樣品，均由廣西萬壽堂藥業有限公司提供；甲醇、乙腈、磷酸為色譜純，水為超純水。

2含量測定

2.1色譜條件

色譜柱：Waters Xbridge-C18柱（5 μm，4.6×250 mm）；流動相：乙腈0.1%磷酸水溶液（13∶87）；柱溫：25 ℃；最大檢測波長：330 nm；進樣量：10 μL；理論板數按異綠原酸A峰計算不低于3 000。

2.2溶液的制備

稱取已研成細粉的伊血安無糖型顆粒0.5 g，精確稱定質量，置于具塞錐形瓶中，精確加入60%的甲醇溶液50 mL，稱定質量，置于超聲儀中超聲處理（功率320 W，頻率80 kHz）30 min，取出放冷至室溫，再稱定質量，用60%甲醇溶液補足減失的質量，振搖使均勻，過濾，濾液用微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

分別取異綠原酸A、異綠原酸B對照品適量，加甲醇制成20 μg/mL的混合對照品溶液。

取缺滇桂艾納香的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法進行提取制成陰性供試品溶液。

2.3專屬性試驗

取“2.2”項下供試品溶液進行測定，記錄色譜圖。結果顯示，異綠原酸A和異綠原酸B的含量測定均不受溶劑、其他藥材等因素干擾，表明方法專屬性良好。

2.4線性關系考察［2］

取適量異綠原酸A、異綠原酸B配制成6種不同濃度的混合對照品溶液進行測定，記錄峰面積，分別以進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，得回歸方程Y1=3 229 409.863 5X1+6 523.860 7（R2=1）；Y2=3 420 779.135 1X2+9 302.333 3（R2=0.999 68）。

結果表明，異綠原酸A和異綠原酸B進樣量分別在0.023 0～0.735 4 μg和0.025 3～0.809 3 μg范圍內峰面積線性良好。

2.5精密度試驗

分別取“2.2”項下供試品溶液，分別進樣6次，記錄峰面積，計算RSD值。

結果顯示，供試品中異綠原酸A和異綠原酸B峰面積的RSD分別為1.66%和1.24%（n=6），表明該方法精密度良好。

2.6穩定性試驗［3］

取伊血安無糖型顆粒（批號：220813），制備成供試品溶液，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h時進行測定，計算RSD值。

結果顯示，異綠原酸A和異綠原酸B的峰面積RSD值為2.26%和0.94%（n=5），表明供試品溶液在10 h內基本穩定。

2.7重復性試驗

取同一批伊血安無糖型顆粒（批號：2208013）適量，研細，分別取6份樣品，按“2.2”項下方法進行提取、測定，計算供試品溶液中異綠原酸A和異綠原酸B的平均質量分數及RSD值。

結果顯示，供試品中異綠原酸A和異綠原酸B平均質量分數分別為1.041 0 mg/g和1.810 2 mg/g，RSD值分別為2.47%和0.92%，表明方法重復性良好。

2.8加標回收率試驗

取已測知含量的伊血安無糖型顆粒（批號220813，異綠原酸A質量分數為1.041 0 mg/g、異綠原酸B質量分數為1.798 8 mg/g）各0.25 g，共6份。分別取0.34 mL異綠原酸A（質量濃度為0.766 mg/mL）和0.54 mL異綠原酸B（質量濃度為0.842 mg/mL）加入樣品中，混勻，制備成供試品溶液進行測定，記錄峰面積，并計算加標回收率。結果顯示，異綠原酸A加標回收率為98.16%～103.25%，RSD 1.82%；異綠原酸B加標回收率為98.83%～102.82%，RSD 1.31%。

2.9耐用性試驗

取伊血安無糖型顆粒（批號：220813）適量，制備成供試品溶液，分別考察Waters Xbridge-C18柱（5 μm，4.6×250 mm），ECOSIL ODS-C18柱（5 μm，4.6×250 mm），大連依利特C18柱（5 μm，4.6×250 mm）測定異綠原酸A、異綠原酸B的含量。結果顯示，異綠原酸A、異綠原酸B含量的相對標準偏差的RSD分別為2.28%和2.02%，表明耐用性好。

3討論

3.1指標成分選擇

滇桂艾納香為伊血安無糖型顆粒中的君藥，是發揮活血止血作用的主藥材之一，主要含有酚酸類、黃酮類、甾醇類、多糖類及揮發性成分等化學成分［4］，其主要活性成分為酚酸類化合物，主要包括原兒茶酸、原兒茶醛、咖啡酸、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C等。蘇宏娜等研究推測異綠原酸A和異綠原酸B是滇桂艾納香的主要化學成分和活性成分，兩個化合物為同分異構體，都具有抗血小板聚集、抗菌、消炎的作用［5］。同時，采用LC-MS分析滇桂艾納香的化學成分。故本研究將異綠原酸A和異綠原酸B作為HPLC定量的研究指標成分。

3.2檢測波長的選擇

用紫外可見分光光度計在200～400 nm進行掃描，異綠原酸A、異綠原酸B在330 nm處均有最大吸收，根據測定結果，以330 nm為檢測波長時測定干擾最小，故將檢測波長定為330 nm。

3.3提取溶劑的選擇

考察了30%甲醇、60%甲醇、甲醇和無水乙醇對供試品中異綠原酸A、異綠原酸B的提取效率。結果表明，60%甲醇溶液提取效率最高，故選擇60%甲醇溶液為提取溶劑。

3.4提取方法的選擇

考察了60%甲醇作為溶劑超聲1 h、回流提取1 h和浸提過夜對供試品中異綠原酸A、異綠原酸B的提取效率。結果表明，用超聲提取效率最高，故選擇超聲為提取方式。

3.5提取時間的選擇

考察了超聲15 min、30 min、60 min、90 min和120 min對供試品中異綠原酸A、異綠原酸B的提取效率。結果表明，超聲提取60 min提取率最高，但與提取30 min得到的含量相差不大，故為了節約時間，選擇提取時間為30 min。

4結論

針對伊血安無糖型顆粒中的滇桂艾納香，建立異綠原酸A和異綠原酸B的HPLC定量測定方法，實驗操作簡單、陰性無干擾、專屬性強，重現性好，可用于伊血安無糖型顆粒的質量控制。

參考文獻：

［1］寧小清，李耀華，談遠鋒，等.不同采收月份壯藥白花九里明中3種化學成分含量測定［J］.中國中藥雜志，2011，36（12）：16231625.

［2］林雀躍，張榮林，甘勇強，等.壯藥材滇桂艾納香及其易混品種東風草和高艾納香比較研究［J］.中國藥事，2020，34（2）：169183.

［3］姜建萍，王美琪，馬雯芳，等.基于多種分析模式構建壯藥滇桂艾納香HPLC指紋圖譜［J］.中藥材，2018，41（1）：124128.

［4］姜建萍，王美琪，馬雯芳，等.HPLC-DAD波長轉換法同時測定不同產地滇桂艾納香中4種成分的含量［J］.中國實驗方劑學雜志，2018，24（3）：7276.

［5］蘇宏娜，李學學，楊正明，等.壯藥材滇桂艾納香的研究進展及其質量標志物的預測分析［J］.中草藥，2022，53（7）：22552267.