破布葉組培快繁技術

關鍵詞：破布葉；組培快繁；種苗；中藥材

0 引言

破布葉（MicrocospaniculataL.）為椴樹科破布葉屬植物，其干燥葉是特色南藥布渣葉，是王老吉、加多寶等涼茶品牌的主要原材料之一，素有“涼茶瑰寶”之美譽。布渣葉微酸，涼，歸脾、胃經，具有消食化滯、清熱利濕功效，還具有抗炎、抑菌等作用[1-3]。布渣葉化學成分較為復雜，目前研究發現其含有生物堿、黃酮、揮發油和有機酸等多種成分[4-6]。破布葉主產于廣東省、海南省、云南省和廣西壯族自治區等地，兩廣地區資源豐富，并且藥用歷史悠久。破布葉的產區較多，各地的藥材質量參差不齊[7-9]。近年來，涼茶等保健產業的不斷發展，對破布葉的市場需求越來越大，破布葉野生資源日益匱乏，人工種植勢在必然。由于破布葉的傳統扦插繁殖成活率低，種子播種發芽率不高，市場對破布葉種苗的需求較大，探索破布葉種苗繁育新技術是有效的途徑和方式。植物組培技術是一種高新生物技術，已成功應用于果樹、花卉、蔬菜、林木和中藥材等種苗產業化，目前開展組培快繁研究的椴樹科植物品種比較多，如紫椴、蒙椴、南京椴等，而關于破布葉的組培快繁研究未見報道[10-14]。本研究通過植物組培快繁技術，培養成完整的破布葉脫毒植株，為破布葉種質資源的保存、優質種苗的產業化及中藥材質量的控制提供一種全新技術體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以破布葉半年生植株為試驗材料，破布葉種子于2021年12月在廣東省茂名市電白區觀珠鎮廣東慧達康制藥有限公司的涼茶示范基地采集，2022年1月在中國科學院華南植物園種質資源圃于沙土內播種，設置遮光度95%黑網遮蓋，30d后發芽，3個月后高15cm帶2～3對對葉幼苗。之后開始對其進行防蟲、防菌、控水預處理，使其體內的含菌量及含水量盡量降低，使外植體材料達到較佳狀態。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體選擇

在播種苗中選擇健壯無病蟲害的破布葉幼苗，切取其幼嫩莖段，長度1.5～2.0cm，切除葉片后用自來水沖洗1h，在超凈工作臺上用紙擦干表面水分備用。

1.2.2 外植體消毒

用75%的酒精擦拭30s后，用無菌水浸泡。放入10%次氯酸鈉溶液中消毒3～7min，無菌水沖洗3遍后用無菌濾紙吸干水分，在超凈工作臺上接種于預設的培養基。

1.2.3 培養基

在不同種類和不同比例基本培養基的基礎上，根據不同培養階段添加不同種類及濃度的生長調節劑，設定不同培養基配方，觀察各預設培養基的培養效果，篩選最適培養基配方。一般情況下，培養基均添加3%蔗糖、0.4%瓊脂，pH值6.0；出根培養基則用0.6%卡拉膠代替0.4%瓊脂。

1.2.4 培養條件

光照強度2000～3000lx，光照時間12h/d，培養溫度（25±1）°C。

2 結果與分析

2.1 不同滅菌時間對外植體滅菌效果的影響

外植體滅菌后接種到預設培養基中，10d后陸續發現污染的外植體，20d后統計結果如表1所示。

由表1可知，次氯酸鈉溶液的滅菌處理時間長短對破布葉外植體的滅菌效果影響很大，隨著滅菌時間的延長，外植體的污染數逐步減少，但同時其死亡芽數也隨之增加。因此，合理設定滅菌時間對外植體處理極為重要，試驗結果表明，當滅菌時間6min時外植體成活率最高，為94%，并且植株保持鮮綠，所萌發側芽狀態正常，如圖1所示。

2.2 不同6-BA濃度對不定芽誘導的影響

將經過消毒步驟后存活的無污染外植體，接種于預設培養基中，經35d培養后，開始產生不定芽。觀察外植體的生長狀況，統計不定芽的誘導數量，計算不定芽誘導率。

由表2可知，在合適的培養基中可以誘導不定芽的形成，6-BA對破布葉不定芽誘導的影響較大，培養基中6-BA含量達到3mg/L時，不定芽出現明顯的玻璃化，而且繁殖率較低，表明高濃度的6-BA會抑制不定芽的誘導。從試驗的培養基效果來看，A4較為合適，其6-BA含量0.5mg/L，不定芽誘導率達92.5%，不定芽鮮綠，葉片展開正常，基部有少量愈傷組織產生，如圖2所示。

2.3 不同基本培養基對不定芽生長的影響

在培養過程中發現，破布葉的不定芽即使在低濃度6-BA培養基中仍然會出現不同程度的玻璃化、黃葉、掉葉現象，推測可能是基本培養基需要調整。因此，在同一激素水平，設置多個不同種類、不同比例的基本培養基進行對照試驗，結果如表3所示。

由表3可知，不同基本培養基由于營養含量不同，所以對不定芽生長有較大影響。營養含量過低（如1/2N6、1/4N6）會使不定芽無法誘導，甚至會導致原材料的死亡；營養含量過高（如WPM、1/2WPM）則會導致原材料營養失衡，雖然誘導出不定芽，但出現黃葉、掉葉，最后甚至死亡。因此，適當的營養含量對不定芽的生長起重要的作用。本研究基本培養基為1/4MS，其營養含量最適合破布葉的不定芽生長。

2.4 不同植物生長調節劑對不定芽繼代增殖的影響

將獲得的叢生不定芽進行分切，使得每個不定芽0.8～1.2cm，每一叢芽保留有3～5個不定芽。以1/4MS為基本培養基，加上0.5mg/L的6-BA，再配以不同濃度的GA3和NAA，進行繼代增殖，重復3次，每次轉移周期35d。觀察不定芽的誘導情況，統計增殖系數及破布葉不定芽的生長狀況。

由表4可知，NAA濃度過高會引起破布葉不定芽的玻璃化，適當濃度的NAA有壯芽的作用。此外，NAA和GA3適量配合使用，能使繼代芽生長青綠壯盛，如圖3所示。B6培養基1/4MS+0.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA+0.1mg/LGA3，為破布葉不定芽繼代增殖的最佳培養基，增殖系數達3.3。

2.5 生長調節劑NAA、IBA對出根誘導的影響

以1/4MS為基本培養基，培養基凝固劑將4%瓊脂改為6%卡拉膠，將高3cm左右的合適單芽接種到添加不同濃度的NAA、IBA組合的生根培養基中。培養7～15d，根點發生，培養15～20d根系發生，長成完整的植株。在培養室中培養35d后，統計破布葉的生根率。

由表5可知，在1/4MS為基本培養基的基礎上添加不同濃度的IBA，對破布葉的誘導生根有明顯的作用，IBA添加的濃度過高會抑制根點的形成，濃度過低無法誘導根系的形成。同樣，適量的NAA也能促進破布葉的根系誘導。誘導出根最適宜的培養基為C6：1/4MS+1.0mg/LIBA+0.1mg/LNAA，其出根時間只有12d、平均發根數達2.6條、生根率達93.1%，如圖4所示。

2.6 組培苗煉苗及移栽

將破布葉生根瓶苗放至溫室苗圃內，保持合適的溫度、光照，進行煉苗7～10d，使其適應瓶外的自然環境。

將完成煉苗的破布葉生根小苗的根部用清水清洗干凈，移栽至混合基質（泥炭∶珍珠巖∶蛭石=2∶1∶1）中，澆透定根水。移栽后7d內用遮光率95%的黑網遮蔭，保持75%濕度，溫度控制在28°C以下。10d后，可掀開黑網，保持通風及其土壤濕潤，待組培小苗長出新葉，即移栽成活，如圖5所示。試驗結果顯示，破布葉組培小苗移栽成活率98%。

3 結束語

布渣葉是嶺南特色中藥材，具有藥用和食用價值，為涼茶的主要原材料之一，是國內中藥材市場上的常銷產品，市場需求量大，但由于長時期是野生采收，質量參差不齊。栽培種植又缺乏規范的技術規程，種子種苗來源雜亂，質量不高。本研究采用植物組織培養技術實現破布葉種苗的規模化生產，其組培技術指標為外植體處理成功率94%、繁殖系數3.3、生根率93.1%及移栽成活率98%。破布葉組培種苗生產技術于2024年2月獲得國家發明專利授權[15]，其成功應用為破布葉較大規模栽培種植奠定了良好的技術基礎，將促進嶺南特色中藥材布渣葉產業化的形成，實現涼茶產業的可持續發展。