復合產香菌株響應面優化及對雪茄煙葉發酵品質的影響

摘要：為探究復合產香菌株對雪茄煙葉揮發性香氣物質的影響，采用同時接菌的發酵方式處理雪茄煙葉，利用魯氏酵母、漢遜酵母J1的產香能力及貝萊斯芽孢桿菌H1對雪茄煙葉大分子物質降解的能力對雪茄煙葉進行發酵。結果表明：三菌發酵相較于兩菌發酵的香氣物質含量更高，且在同時接菌、發酵溫度30℃、碳氮源含量（0.05%異亮氨酸和0.1%葡萄糖）、接菌比例1.5∶0.5∶1（魯氏酵母∶漢遜酵母J1∶貝萊斯芽孢桿菌H1）和初始含水率為34%等條件下發酵雪茄煙葉的揮發性香氣物質含量最高，為730.58 μg/g，且影響雪茄煙葉香氣物質含量的因素順序為初始含水率＞碳氮源含量＞接菌比例。

關鍵詞：產香菌株；響應面優化；混菌發酵；雪茄茄衣

中圖分類號：TS453 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2024）12-0083-07

Compound Aroma-Producing Strains： Response Surface Optimization and Effects on the Fermentation Quality of Cigar Tobacco

ZHANG Tong-tong1，SHAN Yu-le1，HUANG Chen-yi1，YANG Jin-peng2，YU Jun2，CHEN Xiong1，

YANG Chun-lei2，YAO Lan1

（1. School of Life and Health Sciences， Hubei University of Technology， Wuhan 430068， PRC; 2. Hubei Institute of

Tobacco Science， Wuhan 430030， PRC）

Abstract： This study aims to investigate the effects of composite aroma-producing strains on the volatile aroma compounds of cigar tobacco. The composite strains were inoculated simultaneously for the fermentation of cigar tobacco. Specifically， Saccharomyces rouxii and Hansenula J1 capable of producing aroma and Bacillus velezensis H1 capable of degrading macromolecular substances in cigar tobacco were used for fermentation. The results indicated that the three-strain fermentation yielded higher content of aroma compounds than the two-strain fermentation. Under the conditions of simultaneous inoculation， fermentation at 30 °C， 0.05% isoleucine and 0.1% glucose as carbon and nitrogen sources， S. rouxii∶Hansenula J1∶B. velezensis H1 ratio of 1.5∶0.5∶1， and initial moisture content of 34%， the fermentation of cigar tobacco showed the highest content of volatile aroma compounds， which was 730.58 μg/g. The factors influencing the content of aroma compounds in cigar tobacco were ranked in the order of initial moisture content gt; carbon and nitrogen source content gt; strain ratio.

Key words： aroma-producing strains; response surface optimization; fermentation with mixed strains; cigar wrapper

雪茄煙是一種由干燥并經過發酵的煙草卷制而成的煙草制品。雪茄煙因具有獨特香氣、低焦油、高煙堿等特點在我國發展迅速[1]。發酵是雪茄生產加工中的一大重要步驟，對雪茄的眾多內在品質提升效果顯著，發酵方式主要為自然發酵和人工發酵[2]。

人工控制的煙草發酵目前主要利用單一菌種，而使用復合菌種進行發酵的方法相對較少。許多關鍵生物反應僅靠單株細菌無法完成，需要通過2種或2種以上細菌聯合作用才能進行，如混菌發酵。研究表明，混合菌株發酵的產品品質遠遠好于單個菌株發酵[3]。當多個菌種相互結合時，酶活明顯提高，主要由于各種菌種的協同配合，使酶系比例較為和諧，且混合菌株發酵的產酶水平也遠高于單個菌種[4]。

目前在我國現代發酵工業中，多菌種混合發酵主要應用于食品[5-7]、環境保護[8-12]和能源[13-16]等方面。近年來，已有不少微生物發酵煙草提高煙葉質量和香氣的報道[17-19]。帥瑤等[20]使用解淀粉芽孢桿菌GUHP86與GZU03菌種進行復配，研究人工控制混菌發酵對大理紅CL314煙葉品質的影響，結果表明相比單菌發酵和自然發酵，復合菌株發酵對煙葉質量提升有更明顯作用。龍章德等[21]在利用釀酒酵母發酵預處理廣西百色地區B3F煙葉的基礎上，采用混合微生物進一步發酵后，煙葉香氣質、香氣飽滿度均有所增加，煙葉刺激性和雜氣降低。但目前同時接菌方式在雪茄煙葉發酵中的應用鮮少報道。

在前期的試驗中發現，漢遜酵母J1處理雪茄煙葉后，可使雪茄煙葉水果氣味活性值提高，添加魯氏酵母可以使雪茄煙葉香氣更豐富，而貝萊斯芽孢桿菌H1具有降解淀粉、蛋白質、果膠、纖維素和木質素的能力，將大分子物質降解為小分子物質后，對改善雪茄煙葉刺激性有促進作用。筆者以實驗室保藏的菌株為試驗菌株，通過利用貝萊斯芽孢桿菌H1菌株[22]與2株產香酵母（漢遜酵母J1和魯氏酵母）共同處理雪茄煙葉[23]，探究復合微生物發酵對雪茄煙葉揮發性香氣物質含量的影響，以及為不同接菌方式在雪茄煙葉中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗品種、試劑與儀器 （1）試驗材料為雪茄煙茄衣品系CX–012中部煙葉，產自2022年湖北省恩施州煙草站種植。試驗菌株包括貝萊斯芽孢桿菌H1、漢遜酵母J1和魯氏酵母，均保藏于湖北工業大學生命科學與健康工程學院實驗室。

（2）主要試劑包括二氯甲烷、酵母提取物、葡萄糖、蛋白胨、瓊脂和NaCl，均為分析純，源自國藥集團化學試劑有限公司。

（3）主要儀器包括AL104型電子分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；YXQ–75SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器，SPX–150D型恒溫生化培養箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠）；PE–28型pH計[梅特勒–托利多儀器（上海）有限公司]；CJ–2D型無菌操作臺（天津市泰斯特儀器有限公司）；Agilent 7890b氣相色譜–質譜聯用分析儀（GC–MS，安捷倫科技有限公司）。

1.1.2 菌株及培養基 （1）酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YEPD）培養基，即酵母提取物粉末10 g/L、葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、瓊脂20 g/L，115℃滅菌20 min。

（2）LB液體培養基，即酵母提取物5 g、蛋白胨10 g、NaCl 10 g、瓊脂20 g和去離子水1 000 mL，

pH值7.0～7.2，121℃滅菌20 min。

（3） LB 固體培養基：即酵母提取物5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L、含有瓊脂20 g/L，pH值7.0～7.2，121℃滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同發酵方式對雪茄煙葉香氣成分的影響 為探究不同發酵方式對雪茄煙葉香氣成分的影響，進行不同接菌方式、不同營養物質含量配比和不同煙葉初始含水率的對比試驗[24]。將煙葉回潮至適當水分后切成煙絲，每個試驗處理取煙絲100 g，設置酵母+細菌試驗組或單菌試驗組（用量按煙葉重量計，下同），即10%酵母+10%細菌，或單菌菌株接種量20%，均與0.25%異亮氨酸和0.5%葡萄糖混合，加入無菌水充分溶解制成接種液。將接種液均勻噴灑在煙絲上，平衡水分2 h后，將煙葉裝入密封袋分別于溫度30或37℃、濕度80%的恒溫恒濕箱發酵6 d，各試驗組所噴施的微生物、發酵條件、接菌方式如表1所示。發酵結束后，60℃烘干制樣。

1.2.2 單因素試驗 （1）探究營養物質添加量對雪茄煙葉揮發性香氣物質含量的影響。將葡萄糖+異亮氨酸組合與10%貝萊斯芽孢桿菌菌株H1、10%漢遜酵母J1、10%魯氏酵母充分混合后，加入無菌水制成接種液，其中設置葡萄糖+異亮氨酸組合為A1（0.05%+0.025%）、A2（0.1%+0.05%）、A3（0.3%+

0.15%）、A4（0.5%+0.25%）和A5（0.7%+0.35%）。將接種液均勻噴灑在100 g雪茄煙絲上使其最終含水率為30%，平衡水分后放入30℃恒溫恒濕培養箱發酵6 d。對照為未加營養物質處理（CKA1不接菌只加水，CKA2不加碳氮源只接菌），其余處理均與試驗組相同。

（2）探究菌種接種比例對雪茄煙葉揮發性香氣物質含量的影響。將0.1%葡萄糖和0.05%異亮氨酸，分別與不同比例的魯氏酵母、漢遜酵母J1、貝萊斯芽孢桿菌H1充分混合后加入無菌水制成接種液，其中，設置三菌發酵魯氏∶漢遜∶貝萊斯比例為B1（0.5∶1.5∶1）、B2（1∶1∶1）、B3（1.5∶0.5∶1）、B4（1.75∶0.25∶1），及雙菌發酵W1（漢遜酵母∶貝萊斯=2∶1）和W2（魯氏酵母∶貝萊斯=2∶1）。接種液均勻噴灑在100 g雪茄煙絲上使其最終含水率為30%，平衡水分后放入30℃恒溫恒濕培養箱發酵6 d。對照為未加微生物處理（CKB1不接菌不添加營養物質，CKB2不接菌添加營養物質），其余處理均與試驗組相同。

（3）探究初始含水率對雪茄煙葉揮發性香氣物質含量的影響。將0.1%葡萄糖和0.05%異亮氨酸與接種比例1.5∶0.5∶1（魯氏酵母∶漢遜酵母J1∶貝萊斯芽孢桿菌菌株H1）充分混合后，加入無菌水制成接種液。均勻噴灑在100 g雪茄煙絲上使其最終含水率為26%、30%、34%和38%，平衡水分后分別放入30℃恒溫恒濕培養箱發酵6 d。對照為未加微生物處理（即空白組），其余處理均與試驗組相同。

1.2.3 微生物平板計數 對接種到雪茄煙葉中的微生物進行稀釋平板涂布試驗，將微生物接種至其相應的固體培養基上（酵母涂布接種至YEPD培養基上，細菌接種至LB固體培養基上），放置于恒溫培養箱中進行培養，每隔12 h觀察微生物生存狀態。

1.2.4 響應面分析優化試驗 在單因素試驗基礎上，以碳氮源含量、接菌比例、初始含水率為因素，設計三因素三水平的響應面分析方法，以煙葉揮發性香氣物質總量為響應值，研究煙葉最佳發酵方案[25]。

1.2.5 同時蒸餾萃取（SDE）煙草揮發性香氣物質 參照Yao等[24]的方法進行測定，取烘干后的煙葉粉末 0.25 g，加入25 mL萃取液（1%醋酸和2%乙醇）震蕩1 h后，使用連續流動分析儀對過濾后的上清液進行化學成分測定。

1.3 數據分析

運用Design軟件對數據進行二次多項擬合進行回歸分析，求得雪茄煙葉發酵最優工藝條件。

2 結果與分析

2.1 不同發酵方式對雪茄煙葉香氣物質含量的影響

由表2可以看出，處理6揮發性香氣物質含量最高，為562.67 μg/g；其次是處理11揮發性香氣含量，為559.02 μg/g；排第3的為處理2，香氣含量為519.08 μg/g；漢遜酵母J1在37℃條件下發酵后（處理5、7、8、12和14）香氣物質含量均較低，且通過稀釋平板涂布試驗發現漢遜酵母J1在37℃發酵的后幾天幾乎沒有存活，這可能是因為37℃不適于漢遜酵母J1的生長。通過平板涂布發現魯氏酵母在30和37℃均可以存活，因此綜合考慮，后續單因素和響應面優化混菌試驗將采用同時接菌方式、30℃發酵6 d的發酵條件。

2.2 混菌發酵煙葉條件優化

2.2.1 碳氮源含量對煙葉香氣物質含量的影響 將不同濃度的營養物質與菌體混合而成的接種液均勻噴灑在煙葉上，放入溫度30℃、濕度80%的恒溫恒濕箱中發酵6 d。發酵結果如表3所示，CKA1處理僅加水，因此揮發性香氣物質的含量并不高；CKA2處理由于沒有額外添加營養物質，其揮發性香氣物質含量也較低，可能是由于煙葉中營養物質較少，不足以滿足菌株生長導致菌株大量死亡所致。A2處理的揮發性香氣物質含量最高，可能是營養物質的濃度適宜菌株生長，在生長代謝中產生的酶將大分子物質分解成小分子物質，以及發酵過程中生化反應使香氣物質含量增加；碳氮源含量升高但揮發性香氣物質含量呈下降趨勢，可能是濃度太高抑制菌株生長[26-27]。

2.2.2 接種比例對煙葉香氣物質含量的影響 將不同接種比例的混合液分別均勻的噴灑在煙葉上，放入溫度30℃、濕度80%恒溫恒濕箱中發酵6 d。由表4可知，雙菌發酵的煙葉揮發性香氣物質含量較三菌發酵煙葉低，說明有益菌種越豐富可以提高煙葉品質，可能三菌發酵更有利于揮發性香氣物質的形成。B3處理條件下揮發性香氣物質含量最高，說明魯氏∶漢遜∶貝萊斯=1.5∶0.5∶1時菌種之間可能存在協調或共生的作用，是最佳的混菌配比。在其他混菌比例條件下煙葉致香成分總量均有所下降。綜合考慮，選擇混菌比例為1.5∶0.5∶1進行后續優化試驗。

2.2.3 初始含水率對煙葉香氣物質含量的影響 若雪茄煙葉水分過低，會降低微生物的生長和酶的活性；若煙葉水分過高，則使發酵煙葉容易結塊，發酵后顏色變深，且含水率較高的煙葉容易發霉[28-29]。由表5可知，煙葉含水率為34%時，揮發性香氣物質含量達到最大值，隨著含水率上升，揮發性香氣物質含量呈逐漸下降的趨勢，可能是水分超過34%后，一方面不利于酵母和細菌生長，可能影響菌種的代謝；另一方面也容易引起煙葉霉變[30]，說明發酵含水率宜低不宜高，故選擇發酵最佳初始含水率為34%。

2.3 中心組合-響應面優化發酵工藝

以煙葉揮發性香氣物質含量總量為響應值，在單因素預試驗結果的基礎上設計三因素三水平試驗，試驗因素水平見表6，試驗設計及結果見表7。由表7可知，方案2是單因素試驗中得出的最佳設計，揮發性香氣物質含量最高。在0.1%葡萄糖、0.05%異亮氨酸，接種比例為1.5∶0.5∶1（魯氏∶漢遜∶貝萊斯），溫度30℃的條件下雪茄煙葉揮發性香氣物質含量達到731.84 μg/g，顯著高于其他方案。

運用Design Expret 1.0.0.7軟件對表7的數據進行二次多項擬合，得到響應值與各因素之間的回歸方程：y=728.36-2.91×A-0.21×B+3.28×C-1.12×AB-0.32×AC-2.39×BC-56.65×A2-28.06×B2-31.61×C2。香氣物質含量回歸模型系數及顯著性檢驗結果見表8。

對表8中的回歸模型進行分析，模型P值＜0.000 1（極顯著），失擬項P值=0.192 7（不顯著），說明模型可靠，擬合情況較好，同時試驗方法也可靠，隨機誤差是實驗誤差為主要來源。該模型的決定系數R2=0.994 99，表明預測值與實際值之間具有高度相關性。校正系數R2

Adj=0.988 3，說明試驗可靠性良好，擬合度較好。表明此模型方程可靠，用該方程進行分析和預測，預測值與實際測定值之間相關性較高。單因素A、B、C的F值分別為3.950、0.021和5.010，因此單因素對感官的影響順序為C（初始含水率）＞A（碳氮源含量）＞B（接菌比例）。碳氮源含量（A）、接菌比例（B）與初始含水率（C）3個因素交互作用對雪茄煙葉揮發性香氣物質含量影響響應見圖1。根據各因素之間的三維響應面圖形觀察各因素間交互作用的強弱，也可以反映出各個交互作用對響應值的影響強弱。等高線圖中曲線越陡，影響越顯著；曲線越平順，影響越微弱。三維響應面圖的形狀變化表示響應值的變化。

2.4 驗證試驗

通過軟件Design Expert.V 8.0.6.1求解方程得出最優工藝條件，即碳氮源添加量為0.05%異亮氨酸+0.1%葡萄糖，接種比例為魯氏∶漢遜∶貝萊斯=1.5∶0.5∶1，初始含水率33.6%。最佳工藝條件下雪茄煙葉香氣物質含量理論值為728.26 μg/g。在實際發酵過程中，考慮到實際操作可行性，將煙草發酵的最佳發酵條件調整為碳氮源添加量0.05%異亮氨酸+0.1%葡萄糖、接菌比例魯氏∶漢遜∶貝萊斯=

1.5∶0.5∶1，初始含水率34%。在此最優發酵條件下進行3次平行試驗，還做了3組對照試驗，分別是：處理1僅加水自然發酵、處理2僅加菌發酵、處理3僅加營養物發酵、處理4為最佳發酵條件，揮發性香氣物質含量見表9。最優發酵條件下雪茄煙葉香氣物質含量為730.58 μg/g，實際值與理論值差異不大，充分證明該模型的準確性與實用性。

3 討論與結論

發酵是雪茄制作過程中的一個關鍵環節，它通過消除煙氣的粗糙感、降低辣味、排除雜質并提升香氣，從而顯著提升雪茄的口感和品質。由于發酵方式不同優勢菌群也不同會導致煙葉品質差異較大。自然發酵通常周期長且不穩定，因此通過添加外源微生物來增加發酵體系中優勢菌數量，能提高發酵效率和改善煙葉品質[17]。研究采用同時接菌的發酵方式處理雪茄煙葉，利用魯氏酵母、漢遜酵母J1的產香能力及貝萊斯芽孢桿菌H1對雪茄煙葉大分子物質降解的能力對雪茄煙葉進行發酵，結果表明三菌混合發酵后的雪茄煙葉揮發性香氣物質含量較兩菌發酵高。以揮發性香氣物質含量為指標，采用響應面優化法對碳氮源含量、接菌比例、初始含水率進行優化，結果表明，采用同時接菌方式，接菌比例（魯氏 ∶ 漢遜 ∶ 貝萊斯）為1.5∶0.5∶1，添加碳氮源（0.05%異亮氨酸+0.1%葡萄糖），初始含水率為34%，發酵溫度30℃，發酵濕度80%的條件下，雪茄煙葉中揮發性香氣物質含量最高，為730.58 μg/g。

顯著性分析結果表明，影響雪茄煙葉香氣物質含量的因素順序為：初始含水率＞碳氮源含量＞接菌比例。

參考文獻：

[1] 丁靜怡，余君，楊春雷，等. 酵母發酵煙草花蕾提取物對雪茄煙葉發酵的影響[J]. 河南農業科學，2024，53（7）：168-180.

[2] 劉方玉，高強，付沙，等. 雪茄煙葉發酵工藝及其微生物技術研究進展[J]. 安徽農業科學，2023，51（14）：18-21，24.

[3] 龍章德，薛云，李季剛，等. 一種復合微生物制劑及其制備方法和應用：CN113073062B[P]. 2023.03.31.

[4] 何臘平，帥瑤，陶菡. 一種產多酶的雙菌制劑的制備及其應用方法：CN109797117A[P]. 2019-05-24.

[5] 馬寧原，姚凌云，孫敏，等. 基于GC-IMS和HS-SPME-GC-MS分析不同發酵方式對黃桃酒香氣成分的影響[J].食品科學，2023：1-15.

[6] 孔祥君，任同同，許維娜. 混合菌株順序發酵對葡萄酒質量的影響[J]. 中外葡萄與葡萄酒，2020（6）：34-39.

[7] 吳堯，鄧杰，張芮，等. 異常威克漢遜酵母與釀酒酵母不同接種方式對鴨梨酒品質的影響[J]. 食品與發酵工業，2023，49（15）：69-76.

[8] 徐長征. 農業有機廢棄物資源化利用對環境保護的影響及策略研究[J]. 數字農業與智能農機，2024（6）：58-60.

[9] 許惠蘭. 當前畜禽糞污處理與資源化利用面臨的問題及建議[J]. 畜牧業環境，2024（12）：38-40.

[10] 孫紅美. 生態環境保護技術在固體廢物處理及利用中的應用[J]. 水上安全，2024（11）：85-87.

[11] 張宗文，盛月慧，高曦，等. 基于水環境保護的污泥處理技術應用分析[J]. 山西化工，2024，44（2）：224-225，235.

[12] 韋廣鑫，張丹，曾凡坤，等. 響應面法優化混菌發酵野木瓜果酒產酯工藝的研究[J]. 釀酒科技，2016（6）：97-101，107.

[13] 魏國香. 混菌發酵餐廚垃圾產乙醇最佳方式及其動力學探究[D]. 廣州：華南農業大學，2018.

[14] 羅邯予，李正，樸海燕，等. 污泥處理與資源化虛擬仿真實驗的設計與實踐[J]. 造紙技術與應用，2024，52（2）：60-65.

[15] 許青，王璐，黨靜，等. 蘭州市農業有機廢棄物資源化利用現狀及對策[J]. 農業科技與信息，2024（5）：67-70.

[16] 蘇本營，周美華，李晶，等. 農業廢棄物生產環保酵素及其應用研究進展[J]. 北方園藝，2024（8）：119-125.

[17] 王志，陳雄，王實玉，等. 擬康氏木霉和白腐菌混菌發酵處理稻草秸稈的研究[J]. 可再生能源，2009，27（2）：36-39.

[18] 賈云，胡婉蓉，呂晉雄，等. 雪茄煙葉發酵過程中微生物群落及功能微生物分析[J]. 輕工學報，2023，38（1）：71-78，89.

[19] 時向東，張曉娟，汪文杰，等. 雪茄外包皮煙人工發酵過程中香氣物質的變化[J]. 中國煙草科學，2006，27（1）：1-4.

[20] 帥瑤，陶菡，田運霞，等. 復合菌種發酵煙葉產酶及揮發性風味物質變化[J]. 河南農業科學，2020，49（10）：162-175.

[21] 龍章德，蘇贊，李季剛，等. 一種改善廣西百色地區煙葉品質的混合微生物發酵技術[J]. 輕工學報，2021，36（5）：59-66.

[22] 黃晨奕，張彤彤，余君，等. 貝萊斯芽孢桿菌在改善雪茄煙葉品質中的應用[J]. 湖南農業科學，2023（4）：82-89.

[23] YAO L，HUANG C Y，DING J Y，et al. Application of yeast in plant-derived aroma formation from cigar filler leaves [J]. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology，2022，10：1093755.

[24] YAO L，DING J Y，ZHANG T T，et al. Heterogeneity changes of active bacterial community on cigar filler leaves after fermentation based on metagenome [J]. Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，2023，87（9）：1056-1067.

[25] LI D Y，HUANG C Y，MAO Y H，et al. Screening of cellulase-producing bacteria and their effect on the chemical composition and aroma quality improvement of cigar wrapper leaves [J]. BioResources，2022，17（1）：1566-1590.

[26] 郭文龍，丁松爽，劉路路，等. 翻堆對初次發酵過程中雪茄茄芯

煙葉質量變化的影響[J]. 南方農業學報，2021，52（2）：365-373.

[27] 蔡文，吳鑫穎，張倩穎，等. 高斯芽孢桿菌產中性蛋白酶條件優化及其對煙葉發酵的影響[J]. 食品與發酵科技，2022，58（3）：92-98，118.

[28] ZHOU J X，CHENG Y，YU L F，et al. Characteristics of fungal communities and the sources of mold contamination in mildewed tobacco leaves stored under different climatic conditions [J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2022，106（1）：131-144.

[29] PAN Z X，MUNIR` S，LI Y M，et al. Deciphering the Bacillus amyloliquefaciens B9601-Y2 as a potential antagonist of tobacco leaf mildew pathogen during flue-curing [J]. Frontiers in Microbiology，2021，12：683365.

[30] 宋雯，陳曦，余君，等. 初始含水率和菌群演替在雪茄煙葉發酵產香中的作用[J]. 湖南農業科學，2023（7）：82-88.

（責任編輯：肖彥資）