老年肺腺癌患者分子遺傳學特點分析

【摘要】 目的 利用下一代測序技術（NGS）分析老年肺腺癌患者的分子遺傳學特點及相關性，為靶向治療提供臨床依據。方法 選取2021年1月至2023年12月于山東第一醫科大學附屬省立醫院就診的333例老年肺腺癌患者為研究對象，患者年齡≥65歲，所有患者均經病理組織學確診，數據取自初診治療前的組織標本檢測結果。采用NGS平臺進行多基因突變檢測，對《中華醫學會肺癌臨床診療指南（2023版）》推薦檢測的9種驅動基因，即表皮生長因子受體（EGFR）、間變性淋巴瘤激酶（ALK）、ROS原癌基因酪氨酸蛋白激酶1（ROS1）、鼠類肉瘤病毒癌基因（KRAS）、B-Raf絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（BRAF）、Erb-B2受體酪氨酸激酶2（ERBB2）、Ret原癌基因（RET）、Met原癌基因（MET）、神經營養因子受體絡氨酸激酶（NTRK）以及部分少見突變基因，進行臨床病理學、驅動基因突變狀態等歸納分析。結果 9種驅動基因總陽性率為41.14%（137例），其中EGFR為主要驅動基因，突變頻率為36.04%（120例），其他基因突變頻率為KRAS 15.92%（53例），ERBB2 2.10%（7例），EML4-ALK 1.80%（6例），BRAF 1.50%（5例），MET 1.20%（4例），RET 0.30%（1例）。13種少見突變基因與驅動基因共突變種類集中于EGFR、KRAS、抑癌基因TP53（TP53）三種共突變形式，其中磷脂酰肌醇激酶催化α多肽基因（PIK3CA）、U2小核RNA輔助因子1（U2AF1）以及乳腺癌1號基因（BRCA1）僅以共突變形式出現，人第10號染色體缺失的磷酸酶（PTEN）的共突變形式僅為與EGRF共突變，BRCA1、絲氨酸/蘇氨酸激酶11（STK11）、富AT互作域1A基因（ARID1A）以及N-Ras原癌基因（NRAS）的共突變形式僅為與KARS共突變。通過對癌癥基因組圖譜計劃（TCGA）數據庫中肺腺癌數據進行生物信息學統計分析，13種少見突變基因在腫瘤相關信號通路中正常化富集評分（NES）得分均較高，證明其均參與腫瘤的發生、發展過程。結論 應用NGS檢測的9種驅動基因分子遺傳學數據可以有效地顯示肺腺癌的驅動基因分布及特點，尤其是了解少見突變基因以及共突變基因遺傳學特點將更有利于指導臨床治療。

【關鍵詞】 二代測序；老年；肺腺癌；靶向治療

Molecular genetic characteristics of elderly patients with lung adenocarcinoma

LIU Jue1，2， XU Rui1， SUN Youwei3

（1. Department of Clinical Laboratory， Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong First Medical University， Ji’ nan 250021， China； 2. College of Basic Medicine， Shandong Second Medical University， Weifang 261042， China； 3. Department of Interventional Radiology， Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong First Medical University， Ji’ nan 250021， China）

Corresponding author： SUN Youwei， E-mail： sunyouwei654@163.com

【Abstract】 Objective Using the NGS sequencing data to analyze the molecular genetic characteristics and correlation of elderly lung adenocarcinoma patients， to provide clinical evidence for targeted therapy. Methods 333 elderly （≥ 65-years-old） lung adenocarcinoma patients who were treated at Shandong Provincial Hospital Affiliated to Shandong First Medical University from January 2021 to December 2023 were selected as the study subjects. All patients were confirmed by surgical pathology， and the data were obtained from tissue specimen tissue testing results before initial treatment. Using the NGS platform for multi-gene mutation detection， including the nine driving genes recommended for detection in the“Chinese Medical Association Guideline Clinical Diagnosis and Treatment of Lung Cancer （2023 edition）”. Specifically EGFR， ALK， ROS1， KRAS， BRAF， ERBB2， RET， MET and NTRK， which analyzed the retrospective analysis of patient demographics， clinical pathology， and driving gene mutation status. Results The total positive rate of 9 driving genes was 41.14% （137 cases）， among which EGFR was the main driving gene with a mutation frequency of 36.04% （120 cases）， other mutation frequency genes： KRAS 15.92% （53 cases）， ERBB2 （HER2） 2.10% （7 cases）， EML4-ALK 1.80% （6 cases）， BRAF 1.50% （5 cases）， MET 1.20% （4 cases）， and RET 0.30% （1 case）. The results showed that 13 rare types of co-mutations with driver genes were concentrated in three co-mutation forms such as EGFR， KRAS， and TP53. PIK3CA， U2AF1， and BRCA1 only appeared in co-mutation form， PTEN only showed EGRF co-mutation form， and BRCA1， STK11， ARID1A， and NRAS only showed KARS co-mutation form. Through bioinformatics statistical analysis of lung adenocarcinoma data in the TCGA database， it was found that 13 rare mutated genes had high NES scores in tumor related signaling pathways， indicating their involvement in the occurrence and development of tumors. Conclusions By analyzing the molecular genetic characteristics and mutation gene correlation of elderly lung adenocarcinoma patients， the molecular genetic data of 9 recommended driving genes could reflect the distribution and correlation of driving genes in lung adenocarcinoma. Especially， further understanding of the distribution of rare genes will be more conducive to guiding clinical treatment.

【Key words】 Next generation sequencing； Elderly patients； Lung adenocarcinoma； Targeted therapy

肺癌作為在中國所有惡性腫瘤中新發病例占第一位的惡性腫瘤，其致死人數占惡性腫瘤致死人數的比例達23.9%［1］，晚期肺癌患者的整體5年生存率約為20%［2］。目前肺腺癌在肺癌中占比已達40%，超越肺鱗癌成為最常見的非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）［3］。據統計，65歲及以上老年肺癌患者在肺癌群體中的占比已經超過2/3，且呈逐年升高的趨勢［4］。由于老年患者各器官儲備功能下降及并發癥增多，對臨床治療的耐受性差，盡管靶向治療可能帶來的生存期增加不如其他治療方法顯著，但仍能為老年肺癌患者帶來明顯的益處［5］。肺癌臨床診療指南明確指出組織學診斷后需保留足夠組織進行分子生物學檢測進而指導治療［6］。中國60%的肺腺癌患者具有已知的致癌基因突變，不同地區和種族間表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）突變頻率也存在顯著差異［7］。通過對老年肺腺癌患者分子遺傳學特點進行預測分析，結合以臨床標本為主體的分子遺傳學數據更能夠反映肺腺癌的驅動基因分布特點，尤其是加深對少見基因分布的了解，將為指導臨床診療提供更有價值的選擇。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2021年1月至2023年12月于山東第一醫科大學附屬省立醫院就診的333例老年肺腺癌患者為研究對象，患者年齡≥65歲，所有患者均經病理組織學檢查確診為原發性肺腺癌且臨床影像學資料完整；數據取自初診治療前組織標本的檢測結果。排除標準：① 臨床隨訪資料不完整者；② 術前進行過新輔助化學治療（化療）者；③ 合并其他惡性腫瘤、嚴重感染、肝功能不全、凝血障礙者。本研究經山東第一醫科大學附屬省立醫院醫學倫理委員會批準（批件號：2024-289），患者均已簽署知情同意書。

1.2 方 法

收集患者的一般資料、影像學及病理檢查結果。采用下一代測序技術（next generation seque-ncing，NGS）平臺進行多基因突變檢測，包括但不限于《中華醫學會肺癌臨床診療指南（2023版）》［6］推薦檢測的9種驅動基因，即EGFR、間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶1（Ros oncogene 1，ROS1）、Kirsten鼠類肉瘤病毒癌基因同源物（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS）、鼠類肉瘤濾過性毒菌致癌同源體B1（B-Raf proto-oncogene，BRAF）、Erb-B2受體酪氨酸激酶2（Erb-B2 receptor tyrosine kinase 2，ERBB2）、Ret原癌基因（Ret proto-oncogene，RET）、MET原癌基因（Met proto-oncogene，MET）、神經營養因子受體絡氨酸激酶（neuro trophin receptor kinase，NTRK）。回顧性收集患者的臨床病理學、驅動基因突變狀態等資料。

所有患者均經常規病理組織學確診，用于檢測的樣本中均含有腫瘤組織且腫瘤細胞占比不低于20%，腫瘤基因組DNA檢測的樣本室溫存放。基因組DNA提取采用Qiagen公司FFPE組織DNA提取試劑盒（QIAamp DNA FFPE Tissue Kit），嚴格按照說明書操作。DNA樣品滿足A260/A280值為1.9±0.1且不低于1.7，質量濃度≥10 ng/μL，于-20 ℃貯存使用。DNA樣本進行核酸破碎后進行末端修復及純化，連接測序接頭后進行預文庫擴增，通過探針雜交方式進行文庫富集，富集后文庫進行擴增及純化，使用文庫計算軟件2.1.4調整文庫濃度進行變性后上機測序，通過Illumina（NextSeq 550/NovaSeq 6000）、Ion Torrent平臺進行多種驅動基因檢測，操作方法和數據分析均遵循檢測平臺指南要求。

Illumina平臺生物信息學分析使用bel2fastq 2.19將bcl文件轉化成fastq文件，Trimmomatic-0.36去除建庫過程中引入的接頭序列以及低質量堿基片段。采用bwa 0.7.10和GATK 3.2-2將fastq文件中的堿基序列比對至hg19（GRCh37）人類參考基因組上生成bam文件并排序。利用varscan 2.3.9分析樣本中點突變和插入缺失突變，factera 1.4分析樣本中重排/融合。應用ANNOVAR 20150617和snpEff 4.2對鑒定出的點突變、插入缺失和基因重排/融合進行HGVS.格式和COSMIC數據庫注釋。

Ion Torrent平臺生物信息學分析用BaseCaller進行堿基識別和堿基信息統計，使用TMAP完成測序結果及其與人類參考基因組序列hg19（GRCh37）的比對，出具比對后的BAM文件和芯片中所有樣本的數據統計信息。使用variantCaller和北京泛生子基因科技有限公司人類8基因突變聯合檢測數據分析軟件對數據進行變異分析和結果注釋。

1.3 統計學方法及生物信息學分析

采用SPSS 27.0進行數據處理。計數資料以n（%）表示，組間比較采用χ 2檢驗或Fisher確切概率法，以P < 0.05為差異有統計學意義。繪圖采用WPS Office及RStudio 4.1.1中的R語言包。突變基因的生物信息學分析使用癌癥基因組圖

譜（The Cancer Genome Atlas Program，TCGA）數據庫（https： //www.cancer.gov/ccg/research/genome-sequencing/tcga），京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析使用DAVID生物信息數據庫（https： //david.ncifcrf.gov/），使用R 4.3.0的ggplot2包對突變信息進行表達譜差異分析，應用pheatmap包繪制基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GESA）熱力圖。所有的統計分析和圖形繪制均嚴格遵循了相關軟件和R語言包的使用說明和推薦設置，確保結果的準確性和可重復性。

2 結 果

2.1 老年肺腺癌患者驅動基因分布

本研究的333例老年肺腺癌患者占2021年1月

至2023年12月就診選擇NGS測序肺癌患者總量的38.50%，指南推薦檢測的9種驅動基因總陽性率為41.14%（137/333），其中EGFR為主要驅動基因，突變頻率為36.04%（120/333），EGFR基因以19外顯子缺失突變40.83%（49/120）和21外顯子L858R突變30.83%（37/120）為其常見突變形式，其余包括20外顯子插入突變5.00%（6/120）及其他多種形式突變23.33%（28/120）。突變基因突變率由高至低依次為KRAS突變15.92%（53/333），ERBB2突變/擴增2.10%（7/333），EML4-ALK融合1.80%（6/333），BRAF突變1.50%（5/333），MET擴增1.20%（4/333），RET突變0.30%（1/333）。在這些少見驅動基因中，以典型驅動基因突變形式為主，占比分別為KRAS G12C 4.20%（14/333），EML4-ALK融合1.50%（5/333），BRAF V600E 0.90%（3/333），MET擴增0.30%（1/333），MET-14外顯子跳躍0.30%（1/333），見圖1。

2.2 老年肺腺癌患者驅動基因事件與臨床特征之間的關系

本研究納入的患者中，男195例、女138例；65～80歲111例，80歲以上22例；TNM分期為Ⅰ期112例、Ⅱ期108例、Ⅲ期85例、Ⅳ期28例；吸煙患者151例，無吸煙史患者182例。老年肺腺癌患者驅動基因突變狀態與TNM分期有關（P =

0.025），而與性別、年齡及其吸煙史無關（P均 > 0.05），見表1。

2.3 驅動基因共突變及互斥突變比例分析

333例老年肺腺癌患者的所有驅動基因中，肺腺癌經典的共突變比例分別為EGFR-TP53 35.83%（43/120），KRAS-TP53 37.74%（20/53），EGFR-EGFR 9.16%（11/120）；另外還存在EGFR-KRAS互斥突變6例。

2.4 少見突變基因分布及共突變分析

本研究除了分析推薦檢測的9種驅動基因外，還對檢測到的目前暫無對應推薦靶向藥但可能具有一定臨床意義的變異基因進行統計。333例老年肺腺癌患者中，少見突變基因突變率由高到低依次為PIK3CA 6.01%（20例）、CTNNB1 3.90%（13例）、MLH1 3.60%（12例）、APC 3.60%（12例）、SMAD4 2.70%（9例）、PTEN 2.10%（7例）、NF1 2.10%（7例）、SMARCA4 2.10%（7例）、CDKN2A 1.50%（5例）、NRAS 1.20%（4例）、RB1 1.20%（4例）、U2AF1 0.90%（3例）、ARID1A 0.90%（3例）、BRCA1 0.60%（2例）、STK11 0.60%（2例），其余僅檢出1例突變的基因未列出，見圖2。與驅動基因共突變種類主要集中于與EGFR、KRAS、TP53三種基因的共突變形式，值得注意的是PIK3CA、U2AF1以及BRCA1僅以共突變形式出現，PTEN的共突變形式僅以與EGRF共突變出現，BRCA1、STK11、ARID1A以及NRAS的共突變形式僅以與KARS共突變出現，見表2。

2.5 少見突變基因分析

通過對TCGA數據庫中肺腺癌數據進行生物信息學統計分析，肺腺癌樣本（n = 483）與對照組（n = 59）共突變的13種少見突變基因轉錄本存在較大差異，證明在肺腺癌中這些基因也存在相應的轉錄水平調控，見圖3。進一步通過GSEA對TCGA數據庫肺腺癌標本中這13種基因進行差異表達程度排序，并對每個基因子集進行標準化，得到標準化富集得分（normalized enrichment scores，NES），通過熱力圖更加直觀地展現各基因分布狀態及差異性。NES分值較高者集中于細胞周期調控及核苷酸修復等核酸代謝過程，以及非小細胞癌、結直腸癌等實體瘤和慢性粒細胞白血病、急性髓系白血病等非實體瘤信號通路中，證明13種少見突變基因均參與腫瘤的發生、發展過程，且在核苷酸突變過程中發揮作用，見圖4。

3 討 論

研究數據統計表明，70歲是NSCLC患者診斷的中位年齡，診斷時年齡小于50歲的患者不足5%。45歲以前確診的男性和女性肺癌患者發病率分別僅為1.69%和1.52%［8］。青年肺腺癌患者突變率及突變豐度均較高，結果顯示在70～75歲患者中ALK融合發生率最低，但在青年患者中表現出升高趨勢［9-10］。不同于青年肺腺癌患者主要以ALK融合為常見基因突變形式的特點［11］，隨著年齡的增加，腫瘤突變負荷和KRAS、MET、CDKN2A、PIK3CA等基因的突變頻率逐漸升高，而ALK、ROS1、RET重排發生率則下降［9］，與本研究發現少見突變基因頻率升高一致。在NSCLC患者中比較2組年齡段不同患者的同一基因分子特征時也發現，EGFR 19DEL在低齡組頻率更高，EGFR L858R更多在高齡組出現［12］。本研究結果顯示，EGFR和KRAS兩種基因在老年肺腺癌患者中為占比較高（51.96%）的主要突變形式，兩者突變的頻率因種族而異，與前期研究結果一致，體細胞突變多出現在腫瘤的早期階段，與腫瘤發生關系更為密切，且兩者之間往往是相互排斥的，KRAS突變可造成EGFR-酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKI）的耐藥發生［13］。但入組患者中未檢出ROS1和NTRK的突變形式，可能為檢測樣本的不同導致檢測結果存在一定的差異，需要進一步擴大樣本量加以證實。考慮到不同地區和種族間的突變頻率差異顯著，本研究納入的333例老年肺腺癌患者檢測到驅動基因總陽性率為44.14%，低于既往報道的整體人群肺腺癌患者的靶向致癌驅動基因突變率（64%）［14］。這揭示了老年肺腺癌患者與年輕患者相比具有不同的分子特征［15-16］，兩者可能具有不同的腫瘤發生機制。雖然肺腺癌可采用多種治療手段，但老年肺腺癌患者基因突變類型與青年患者具有差異，部分基因突變位點目前沒有靶向藥物，治療效果仍然不佳，對于老年肺腺癌患者的檢測仍是以常見的基因突變表型檢測為主。本研究為老年肺腺癌患者提供了罕見基因突變與共突變形式的研究依據，后續應進行基因突變表型及治療預后的研究，使老年肺腺癌患者能夠得到更為精準有效的診斷及治療，從而增加生存獲益。

腫瘤發生過程是一個不斷累積基因突變的過程，驅動基因的共突變患者對靶向治療應答率和預后也逐漸受到重視［17］。本研究發現的少見突變基因中PIK3CA、U2AF1以及BRCA1僅以共突變形式出現，其中PTEN的共突變形式僅為與EGRF共突變，BRCA1、STK11、ARID1A以及NRAS的共突變形式僅為與KARS共突變，與前期研究結果發現STK11的失活發生在三分之一的KRAS突變的肺腺癌中結果一致［18］，KRAS通常與TP53、SKT11等腫瘤抑癌基因發生共突變，與其腫瘤特征及生物學行為有關［19］。上述研究表明這些少見突變基因參與了老年肺腺癌腫瘤發生、發展各個階段。本研究老年肺腺癌患者的GESA結果顯示，PIK3CA、U2AF1、BRCA1、MLH1、SMAD4、APC、NF1等中檢出的少見突變基因在腫瘤轉錄水平上與對照組存在明顯差異，證明其在腫瘤發生過程中有更顯著的生物學意義。前期研究結果表明，驅動基因共突變會對不同患者的靶向治療及化學治療產生不同效果，其中研究較為深入的TP53共突變已被證實是肺癌靶向治療效果差的重要因素［20-22］。老年肺腺癌患者中出現TP53共突變對靶向治療有負向作用，TP53與EGFR或KRAS的共突變在NSCLC中可能與靶向藥物耐藥和生存期較短有關［23-24］，EGRF與TP53共突變時采用靶向治療結合化學治療的效果更好［25］。本研究中，少見突變基因多以共突變形式出現，且經GESA發現其功能集中于細胞周期調控及核苷酸修復等途徑，進一步證明了共突變可能通過細胞功能和通路的失調以及肺腺患者發生小細胞肺癌轉化從而對靶向藥物產生原發性或繼發性耐藥，因此聯合化療、抗血管生成治療可能是有驅動基因共突變檢出的肺腺癌患者更有價值的治療選擇。

老年肺癌患者由于機體功能減弱、合并多種基礎疾病，藥物的耐受性和療效均會受到影響，作為可以覆蓋各種變異形式及用于血液樣本檢測的NGS技術越來越被廣泛應用于臨床后，利用其優勢獲得的這些少見的共突變或互斥突變基因的遺傳信息，值得臨床進一步參考研究。前期研究發現利用NGS技術檢測血液樣本中的ctDNA對NSCLC術后輔助治療起到一定的指導作用，術后輔助治療可以改善ctDNA陽性患者的無進展生存期［26］。利用NGS技術對NSCLC術后復發、輔助化療、靶向治療及免疫治療等過程中的ctDNA的動態監測，不僅可以比影像學更早預測腫瘤復發、指導術后輔助治療開展，還能密切監測靶向治療的預后及耐藥性變化［27］，對于接受靶向治療的老年患者更能從中獲益。在目前中國老齡化進程不斷推進且老年肺腺癌暫無統一標準治療方案的前提下，早期癌癥追蹤時選擇ctDNA測序以檢測致癌驅動因素并追蹤耐藥突變，可評估腫瘤隨著時間的推移以及可能在不同轉移部位發生的動態克隆進化，為進一步的治療方案提供重要基因遺傳信息［28-29］。

綜上所述，靶向治療是老年肺腺癌患者的安全有效治療手段，老年患者與年輕患者TKI治療效果及生存獲益基本相同，但不良事件的發生率會顯著增加。老年肺腺癌患者的突變譜有其特點，與年輕患者存在一定差異［30］，通過NGS技術識別新的驅動基因突變，能夠擴大受益于靶向治療的人群，更好地了解靶向治療耐藥性的機制，為臨床治療提供新的解決方案［31］。

參 考 文 獻

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（責任編輯：林燕薇）