長臂猿感染H9N2 亞型禽流感病毒病例報告

摘 要 2022年1月，某動物園同一館舍內飼養的6只長臂猿（Nomascus spp.）先后出現流清涕、咳嗽的癥狀。采集患病長臂猿鼻拭子共6份，利用高通量測序法對樣本進行病原篩查，結果顯示：2份樣本呈AIV陽性，序列組裝結果與H9N2亞型禽流感病毒的相似性最高；采用qPCR法對2份陽性樣本進行H1 ～ H16 基因和N1 ～ N9 基因檢測驗證，發現5號樣本H9 Ct值為31. 35、N2 Ct值為36. 16，6號樣本H9 Ct值為27. 46、N2 Ct值為29. 57，均為陽性。給予患病長臂猿化痰止咳、消炎和控制繼發感染等綜合治療，同時加強飼養環境消毒，患病長臂猿很快康復。

關鍵詞：長臂猿；H9N2；禽流感病毒；高通量測序；qPCR

中圖分類號：S858. 9

文獻標志碼：A

文章編號：2310 - 1490（2024）- 04 - 0873 - 08

DOI：10.12375/ysdwxb.20240420

禽流感是由A 型流感病毒（Avian influenza vi?rus，AIV）引起的一類禽類疾病，也可感染人類和其他哺乳動物。高致病性禽流感病毒（High patho?genic avian influenza virus，HPAIV）能造成禽類的高致病率和高死亡率，人類偶有感染，但一旦感染病死率較高，嚴重危害禽類和人類的生命健康［1?2］。低致病性禽流感病毒（Low pathogenic avian influenzavirus，LPAIV）流行隱匿，可降低家禽產蛋能力、體質量和免疫力，且存在向HPAIV變異的風險，從而帶來疫病傳播擴大的風險［3?4］。H9N2亞型禽流感病毒屬于LPAIV，常引起鳥和豬等動物發病，近年來也有感染人的報道［4］。長臂猿屬于靈長目（Primates）長臂猿科（Hylobatidae），與人親緣關系非常接近，主要分布在東南亞，在我國主要分布在云南和廣西，海南也有分布。長臂猿科所有物種均被列為國家一級重點保護野生動物［5］，是珍稀的野生動物資源。非人靈長類動物自然感染禽流感病毒的病例報告極少。本案例描述了長臂猿自然感染H9N2 亞型LPAIV后的臨床癥狀以及實驗室檢查、診斷和治療過程，以期為靈長類動物流感病毒感染的診療提供臨床參考。

1 發病情況

2021年12月29日，長臂猿群進行了一次物理保定館舍搬遷，當時氣溫變化較大，夜間氣溫為5 ～11 ℃，日間氣溫為15 ～ 19 ℃。2022年1月3日，2只長臂猿出現打噴嚏、流清鼻涕和發抖的癥狀，精神尚可，挑食，排泄正常。1月4日和5日，新增4只長臂猿出現同樣癥狀，先發病的長臂猿開始咳嗽，鼻涕變為灰白色。截至5日，共有6只長臂猿發病，分別是1只南方白頰長臂猿（Nomascus siki）、2只紅頰長臂猿（N. gabriellae）和3只黃白頰混血長臂猿。

2 實驗室檢查結果

2. 1 血液檢查

出現早期癥狀時，采集其中1只長臂猿的靜脈血送廣西壯族自治區民族醫院作血常規檢測，結果顯示白細胞總數為7. 18 × 109/L，淋巴細胞百分比為34. 8%，中性粒細胞百分比為55. 4%，單核細胞百分比為9. 2%；采集后期出現咳嗽癥狀的1只長臂猿靜脈血作血液常規檢查，結果顯示白細胞總數為16. 54 ×109/L，淋巴細胞百分比為22. 3%，中性粒細胞百分比為67. 3%，單核細胞百分比為10. 2%（表1）。

2. 2 病原檢測

對有臨床癥狀的長臂猿采用壓縮籠物理保定，對鼻孔周邊消毒，使用滅菌棉拭子貼鼻孔壁旋轉3周，獲取拭子樣本，置于滅菌的PBS保存液中，置低溫冰箱中保存待檢。共采集患病長臂猿鼻拭子樣本6份，送廣西翰佰爾生物科技有限公司，利用高通量測序結合實時熒光PCR進行流感病毒檢測驗證。

2. 2. 1 高通量測序

使用病原核酸提取試劑盒（廣州美基生物科技有限公司，中國），根據說明書的操作步驟提取病原總核酸。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測病原總核酸完整性，使用NanoDrop分光光度計檢測核酸純度，并用Qubit 2. 0 Fluorometer（Themo Fisher Scientific，USA）與ssDNA Quantitation Assay Kit 試劑盒（Q10212，Themo Fisher Scientific，USA）對核酸濃度進行精確定量。樣本檢測合格后，每個樣本取用2 μg核酸，使用建庫試劑盒NEBNext Ultra DNA Library Prep Kitfor Illumina（New England Biolabs，USA），根據TruSeqDNA Sample Preparation Guide（Illumina，15026486Rev. C）方法與流程進行文庫制備，制庫流程：使用Covaris 超聲波破碎儀將DNA 片段隨機打碎為約350 bp的片段，然后進行DNA片段篩選、末端修復、修復末端加入堿基A、加測序接頭引物、文庫純化和PCR 擴增富集。文庫構建完成后，使用Qubit 2. 0Fluorometer （Themo Fisher Scientific， USA）與ssDNAQuantitation Assay Kit 試劑盒（Q10212，Themo FisherScientific，USA）初步定量。將文庫稀釋至1 ng/μL，隨后使用Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technolo?gies，USA）檢測文庫的insert size。當文庫insert size符合預期后，使用Bio-Rad KIT iQ SYBR GRN試劑盒（iQ SYBR Green Supermix，BIO-RAD，USA）在Bio-Rad CFX 96 熒光定量PCR 儀器（Bio-Rad CFX-96，BIO-RAD，USA）上進行qPCR，對文庫的有效濃度進行準確定量，要求文庫有效濃度大于3 nmol/L，以保證文庫質量。文庫質量檢測合格后，根據測序所需數據量匯集文庫，將文庫加入Illumina NovaSeq 6000測序平臺測序，測序策略為雙端150 bp，測序數據量為每個樣本20 G。數據下機后進行數據質控、組裝、基因預測及豐度分析和物種注釋及功能數據庫注釋等宏病毒組分析。

測序結果5號樣本和6號樣本呈AIV陽性，5號樣本AIV 覆蓋度為17%，6 號樣本AIV 覆蓋度為100%。序列組裝結果顯示，5號樣本得到核輸出蛋白/非結構蛋白（nuclear export protein/nonstructuralprotein1，NEP/NS1）表達基因的不完整序列；6 號樣本得到堿性聚合酶1/堿性聚合酶2-F2（polymerasebasic 1/polymerase basic 2-F2，PB1/PB2-F2）、堿性聚合酶2（polymerase basic 2，PB2）、酸性聚合酶（poly?merase acid，PA）、血凝素（hemagglutinin，HA）、核蛋白（nuclear protein，NP）、神經氨酸酶（neuraminidase，NA）、基質蛋白1/基質蛋白2（matrix protein 1/matrixprotein 2，M1/M2）和NEP/NS1 八個表達基因片段的不完整序列，命名HA 基因序列為NC_004908. 1，NA基因序列為NC_004909. 1。

2. 2. 2 qPCR驗證

根據高通量測序的分析結果選取流感病毒陽性樣本，利用High Pure Viral RNA Kit劑盒（No. 11828665001，Roche，瑞士）提取RNA病毒，然后通過Prime?Script Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit with gDNAEraser試劑盒（RR047A，TaKaRa，日本）反轉錄生成cDNA，利用甲流分型檢測試劑盒H1 ～ H16 和N1 ～N9（碩世生物，中國江蘇）進行qPCR檢測。結果顯示，5號樣本H9 Ct值為31. 35，N2 Ct值為36. 16；6號樣本H9 Ct值為27. 46，N2 Ct值為29. 57。判為5號和6號樣本為H9N2陽性，其他分型結果均為陰性。

2. 2. 3 基因序列分析

使用NCBI的BLAST工具分析基因相似性，將6號樣本各基因片段序列分別在NCBI上用BLAST工具比對序列相似性，與各基因片段序列相似性最高的毒株信息見表2；將5號樣本NEP/NS1 基因片段序列在NCBI上用BLAST進行序列相似性比對，與該基因片段序列相似性最高的毒株信息見表3。

在NCBI核酸基因數據庫中選取參考毒株的基因序列，使用MEGA6. 0，采用最大相似法，設置Boot?strap replications值為1 000，構建HA 基因和NA 基因系統進化樹。結果顯示，NC_004908. 1與A/chicken/China/FY110/2022（H9N2）株和A/chicken/China/JN35/2021（H9N2）株的HA 基因遺傳距離最近，與A/turkey/Wisconsin/1/1966（H9N2）株的遺傳距離最遠（圖1）；NC_004909. 1與A/chicken/China/KM216/2022（H9N2）株和A/chicken/China/KM212/2022（H9N2）株的NA 基因遺傳距離最近，與A/turkey/Wisconsin/1/1966（H9N2）株的遺傳距離最遠（圖2）。

3 診斷、治療和防控

3. 1 診斷

與王曉佳等［6］對長臂猿血液的常規檢測結果相比，在本案例早期發病長臂猿的血液中單核細胞百分比略微升高，白細胞總數、中性粒細胞百分比和淋巴細胞百分比均在正常范圍內；而在疾病后期出現咳嗽癥狀長臂猿的血液中白細胞總數和中性粒細胞百分比均略微升高。高通量測序法和實時熒光定量PCR 法檢測病原的結果提示患病長臂猿鼻咽處有H9N2 亞型禽流感病毒定植，診斷本群長臂猿為H9N2亞型禽流感病毒引起的流感。

3. 2 治療措施

以抗炎、化痰止咳和防止繼發感染為治療原則對癥治療。在治療上，給予小兒氨酚磺那敏顆粒1包/只（1包小兒氨酚磺那敏顆粒含對乙酰氨基酚125. 0 mg，馬來酸氯苯那敏0. 5 mg，人工牛黃5. 0 mg），鹽酸氨溴索片60 mg/只，小兒麻甘顆粒2. 5 g/只，頭孢克肟顆粒50 mg/只，連喂7 d；咳嗽嚴重的長臂猿加服利肺片2片/次，2次/d，連喂10 d。

3. 3 防控

對該群長臂猿原地隔離，飼養間出入口設置消毒墊，每4 h更換1次消毒液。對患病長臂猿專人專養，飼養人員做好個人防護，作業時戴好帽子、口罩和手套，穿戴工作服和靴子。同棟館舍其他飼養間相對隔離，其他作業人員不得進入患病長臂猿飼養間，做好個人防護。館舍出入口設置消毒墊，每4 h更換1次消毒液，將掃把、刷子、垃圾鏟、料盆和水盆等生產用具嚴格分開。在治療期間，該棟館舍所有飼養員不得進入其他館舍，防止病毒擴散，飼養館舍地面、飼養籠用84消毒液按1∶100噴灑消毒，飼養間內室空間每天用白醋按7 mL/m3的濃度進行空氣熏蒸消毒，連續消毒1周。加強飼養管理，館舍配置多個小太陽保暖器提升空間溫度，白天適時通風換氣，供給豐富多樣的水果，增加鵪鶉蛋等高蛋白質食物的供給頻次，提高患病長臂猿營養攝入和機體免疫力。經過10 d的治療和防控，群體內未再出現新病例，發病的6只長臂猿全部康復。

4 討論

從臨床癥狀和實驗室檢查結果可知，本案例是一起由H9N2亞型禽流感病毒引起的流感。Paung?pin et al.［7］對自由放養的672只食蟹猴（Macaca fas?cicularis）進行AIV 監測，發現自由放養的食蟹猴存在AIV自然感染；Zhang et al.［8］建立H9N2亞型禽流感病毒感染獼猴（M. mulatta）的動物模型表明，H9N2可以引起非人靈長類動物與人類流感相似的癥狀，可以引起包括肺炎在內的呼吸系統疾病，非人靈長類感染H9N2亞型禽流感病毒后的病癥比季節性流感病毒嚴重，但比感染HPAIV的癥狀輕。本案例的長臂猿自然感染H9N2 亞型禽流感病毒后癥狀較輕，主要是流涕和咳嗽，未引起明顯的發熱和嚴重的肺炎，也未引起大范圍的感染、傳播以及猿—人傳播，符合低致病性禽流感的特征。

與一般的低致病性禽流感相似，長臂猿感染H9N2亞型禽流感病毒后一般7 ～ 10 d臨床癥狀會消失。研究人員對本案例患病長臂猿進行常規對癥治療和預防繼發感染的同時，做好了環境消毒和增強營養供給，保證水合狀態，以提高機體免疫力，最終10 d后全部康復。在治療過程中，使用頭孢克肟顆粒能夠有效控制流感過程繼發的細菌感染；使用小兒氨酚黃那敏能有效減少流感早期引起的流涕、咽喉腫痛和頭痛發熱等癥狀；使用鹽酸氨溴索能促進痰液的稀釋和排出；使用小兒麻甘顆粒能平喘止咳，利咽祛痰。利肺片主要成分是百部、百合、五味子、枇杷葉、白及、牡蠣、甘草、冬蟲夏草和蛤蚧，對頑固性肺炎有驅癆補肺，鎮咳化痰的作用，對久咳難愈的病例有較明顯的治療作用。

HA蛋白是AIV表面重要的糖蛋白，其功能結構域的改變會導致AIV 的致病力和宿主特異性的改變。AIV致病性和毒力強弱的關鍵因素是其HA蛋白裂解位點的氨基酸序列，AIV的宿主特異性與HA蛋白受體結合位點的氨酸殘基有著密切的關系；NA蛋白是AIV另一種重要糖蛋白，在病毒復制與病毒從細胞逸出中具有重要功能，與病毒毒力和跨物種傳播的能力相關，在同一宿主身上同時感染多種亞型AIV容易發生流感病毒基因的重組［9?13］。本案例采用高通量測序對樣本進行病原檢測AIV呈陽性，采用qPCR進行病原驗證，證實這是一起由H9N2亞型低致病性禽流感病毒引起的感染。由于實驗條件限制，未能開展病毒培養及更深一步的研究，該毒株的致病力是否發生改變，以及其是否具備跨物種傳播的能力尚不明確。H9N2亞型禽流感病毒屬于低致病性禽流感病毒，感染鳥類的報道較多，1998年以來陸續有H9N2亞型禽流感病毒感染人的報道，說明H9N2對人類健康的威脅不可忽視［3，10?11］。本案例首次發現H9N2亞型禽流感病毒也可自然感染長臂猿，說明H9N2亞型禽流感病毒宿主范圍仍具有很大的不確定性，其跨物種傳播的能力值得繼續關注和研究。

本案例長臂猿能自然感染H9N2 亞型禽流病毒，與飼養管理比較粗放和針對該亞型流感病毒的免疫措施缺失有關。同棟飼養物種較多，有猴科（Cercopithecidae）、靈貓科（Viverridae）等多種動物；外運動場臨時放養孔雀（Pavo spp.），有多種候鳥到運動場覓食；館舍臨近開放性水禽飼養湖，每年都有多種候鳥在湖中小島停留，部分成為留鳥。這種粗放型飼養模式大大增加了長臂猿與病原體接觸的機會。該動物園每年春秋兩季均對飼養的鳥禽進行H5 亞型和H7 亞型高致病性禽流感疫苗的接種免疫，但園內所有物種均未接種低致病性禽流感疫苗。有研究表明，季節性流感疫苗接種對H9N2的交叉保護較低［14］，H5亞型和H7亞型高致病性禽流感疫苗對H9N2的交叉保護作用較低［15］，使得低致病性禽流感病毒感染園內動物的可能性大大提高。越來越多的研究表明，H9N2亞型禽流感病毒HA 基因第226位氨基酸突變為亮氨酸時更易于與哺乳動物的唾液酸SAɑ2-6Gal 結合，PA-356R、PB1-K557E 和PB2-E627K 等突變可增強病毒對哺乳動物的適應性［10，16］。因此，筆者推測該群長臂猿感染的H9N2亞型禽流感病毒可能來源于園內候鳥。據張官婷等［16］統計，人感染H9N2流感病毒的疫情多發生在冬春季節，每年10月至次年3月報道的病例最多，H9N2禽流感病毒感染人后癥狀輕，易自愈，往往被人們忽略。在平時飼養作業和對外展出過程中，長臂猿有與人類直接或間接接觸的機會。本群長臂猿感染H9N2 亞型禽流感病毒的時間為1 月，不排除同期H9N2 在人間隱性感染的可能，該群長臂猿感染H9N2亞型禽流感病毒也有可能來源于人。該群長臂猿感染H9N2亞型禽流感病毒發生在搬遷之后，搬遷應激、新環境應激和溫差變化大等都是感染發病的主要誘因。

為防止該群長臂猿再次感染禽流感病毒，應將其與其他物種分開飼養，遠離候鳥集中地，減少接觸禽流感病毒的機會。對園內飼養的禽鳥接種H9N2亞型禽流感疫苗，嘗試開展長臂猿科接種H9N2亞型禽流感疫苗效果研究，提高園內禽類和長臂猿對H9N2亞型禽流感病毒的抵抗力。近年來，一些新發或再發人獸共患病在世界范圍內廣泛流行，野生動物在人獸共患病的發生和傳播過程中發揮了重要作用［17］，開展H9N2亞型禽流感病毒本底調查，摸清園內物種攜帶和感染情況，對全園的禽流感防控具有重要意義，對社會具有重要的公共衛生意義。

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基金項目：廣西野生動物救護與疫源疫病監測專題研究項目（GXZTYJXM202101）