基于高通量測序的貴州北部地區紅腿長吻松鼠秋季食性分析

摘 要 紅腿長吻松鼠（Dremomys pyrrhomerus）是一種主要分布于我國的長吻松鼠，但對其生物學和生態學特征鮮有研究報道。為揭示紅腿長吻松鼠的食物種類組成及其取食偏好，運用高通量測序技術對貴州北部地區采集的紅腿長吻松鼠進行食性分析。結果表明：紅腿長吻松鼠所食植物包含4門85科180屬，動物包含3門59科71屬，其中，胡桃科（Juglandaceae）、禾本科（Poaceae）、殼斗科（Fagaceae）、薔薇科（Rosaceae）、鼠李科（Rhamnaceae）和樟科（Lauraceae）等是紅腿長吻松鼠主要的植物性食物，而田螺科（Viviparidae）、蚌科（Unionidae）、劍水蚤科（Cyclopidae）、沼大蚊科（Limoniidae）、管薊馬科（Phlaeothripidae）和螽斯科（Tettigoniidae）等是其主要的動物性食物。此外，不同性別紅腿長吻松鼠的食性具有一定的差異性，雌性紅腿長吻松鼠的食物多樣性均高于雄性，雌性和雄性的植物性食物重疊度較高，而動物性食物重疊度較低。研究結果豐富了黔北喀斯特臺原地區小型哺乳動物的攝食生態學。

關鍵詞：紅腿長吻松鼠；高通量測序技術；食性；貴州北部地區

中圖分類號：Q958. 1

文獻標志碼：A

文章編號：2310 - 1490（2024）- 04 - 0717 - 10

DOI：10.12375/ysdwxb.20240404

掌握野生動物食性是進一步了解物種生物學和生態學特征的基礎內容［1］。通過食性分析不僅可以直接了解動物的食物組成和取食偏好，還能反映動物的生存狀況、營養策略、生境需求和資源利用狀況等信息［2?4］。因此，掌握動物的食性及其生態適應策略，是了解動物與環境之間相互關系、開展種群生態學研究的前提［5?6］。

紅腿長吻松鼠（Dremomys pyrrhomerus）隸屬于松鼠科（Sciuridae）麗松鼠亞科（Callosciurinae）長吻松鼠屬（Dremomys），是廣泛分布于我國南方各省森林的一種晝行性、半樹棲的雜食性小型哺乳動物，其種群量大、適應性強、貯食行為發達，在森林生態系統恢復過程中起著非常重要的作用，是影響森林生態平衡的重要動物之一［7?8］。迄今為止，對于紅腿長吻松鼠的研究主要見于系統發生、物種厘定及紅外相機監測報告等［9?12］，其食性方面尚未見較詳細的報道。食性研究方法的精確性直接關系到該類動物資源科學管理的水平［13］。對嚙齒類動物食性研究的方法多為直接觀察法、解剖法、糞便顯微組織分析法和胃容物分析法等，其中，胃容物分析法是國內外研究嚙齒動物食性的主要方法［5，14］。傳統的胃容物檢測方法形態鑒定的工作強度大，且易受食物類型和消化情況的影響，鑒定結果的效率和準確性較低［15］。相比于傳統的食性形態學分析方法，高通量測序技術具有檢測靈敏、樣本量少和精確度高等優點［16］。目前該技術已逐漸成為分析動物食性的熱門手段之一，被廣泛應用于各種野生動物的食性研究中［17?20］。因此，為準確揭示紅腿長吻松鼠的食性，以黔北地區的紅腿長吻松鼠為研究對象，運用高通量測序技術，分析其食性組成，以期在豐富黔北喀斯特臺原地區小型哺乳動物的攝食生態學認知的同時，為今后深入研究這類物種提供基礎資料。

1 研究區概況

研究對象采自貴州省北部遵義市綏陽縣的旺草鎮（28°13′—28°19′ N，107°9′—107°13′ E）。采樣地位于貴州寬闊水國家級自然保護區的中心區域。寬闊水國家級自然保護區是黔北喀斯特臺原區及其周邊峽谷區森林生態系統保存最好、生物多樣性最豐富的區域之一，海拔650 ～ 1 762 m，屬亞熱帶季風性氣候，常年氣溫較低，云霧多，日照少，具有低緯度山地濕潤性氣候特點，年均氣溫11. 7 ～15. 2 ℃，年降水量1 300 ～ 1 350 mm，相對濕度超過80%。地貌為典型的喀斯特臺原地貌，土壤以黃棕壤和黃壤為主。保護區水熱條件良好，森林植被主體為光葉水青岡（Fagus lucida）林與常綠闊葉樹種構成的落葉常綠闊葉混交林，優勢植被群落主要以殼斗科（Fagaceae）、樟科（Lauraceae）和杜鵑花科（Erica?ceae）等為主［11］。區內珍稀瀕危動植物資源十分豐富，分布有黑葉猴（Trachypithecus francoisi）、紅腹錦雞（Chrysolophus pictus）、南方紅豆杉（Taxus wallichianavar. mairei）和珙桐（Davidia involucrata）等國家重點保護野生動植物；其他生物資源也十分豐富，保護區現已記錄高等植物、浮游植物、脊椎動物、節肢動物和軟體動物等生物資源近4 000種，同時，保護區內也廣泛種植糧食作物，如水稻、玉米和大豆等［21］41-47，［22］。

2 研究方法

2. 1 野外樣本采集

于2022年秋季（9—11月）在黔北綏陽縣旺草鎮北部林區的3個不同斑塊（圖1）采用籠捕法共獲取12只紅腿長吻松鼠成年個體。研究已通過貴州大學動物實驗倫理委員會的審查（批件號：EAE-GZU-2020-7011）。樣本經CO2氣體處死后，進行常規生物學測量（性別、體質量、體長、前足長、后足長、頭長和尾長），隨后立即解剖，取胃置于5%的福爾馬林溶液中固定［23］，放入冰箱-80 ℃保存，以備后續DNA的提取。測定的樣本信息見表1。

2. 2 胃容物基因組DNA 的提取

根據E. Z. N. A. Soil DNA kit（D5625-01）說明書對紅腿長吻松鼠胃內容物進行DNA 抽提，配制1. 2% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質量，并用NanoDrop2000超微量分光光度計測定DNA濃度和純度。

2. 3 目的基因片段的PCR 擴增與測序

分別選用線粒體COI和葉綠體rbcL 鑒定動植物性食物。葉綠體rbcL 基因擴增使用引物Z1aF（5′-ATGTCACCACCAACAGAGACTAAAGC-3′）和hp2R（5′-CGTCCTTTGTAACGATCAAG-3′）。線粒體COI基因擴增使用引物intF（5′-GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC-3′）和COI jgHCO2198（5′-TANACYTCNGGRTGNCCRAARAAYCA-3′）。PCR反應總體系25. 00 μL，其中包括5 × reaction buffer 5. 00 μL，5 × GC buffer 5. 00 μL，dNTP（2. 5 mmol/L）2. 00 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各1. 00 μL，DNA 模板2. 00 μL，ddH2O 8. 75 μL，Q5 DNA Polymerase 0. 25 μL。擴增rbcL 和COI 基因片段反應程序：98 ℃預變性2 min；98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環；72 ℃再延伸5 min，10 ℃保存。PCR擴增產物用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用DNA純化磁珠（Vazyme VAHTSTM DNA Clean Beads）對PCR擴增產物純化回收。將PCR擴增回收產物進行熒光定量，熒光試劑為Quant-iT PicoGreen dsDNA AssayKit，定量儀器為Microplate Reader（BioTek，FL ×800）。按照每個樣本的測序量需求，對各樣本按相應比例混合，然后送上海派森諾生物科技股份有限公司測序。

2. 4 數據處理與分析

首先檢測原始下機數據的質量，通過質量初篩的原始序列按照index和barcode信息，進行文庫和樣本劃分，并去除barcode 序列。使用Vsearch（v2. 13. 4）軟件去引物、拼接、質量過濾、去重和去嵌合體獲得高質量序列。應用QIIME2軟件對序列按照97% 的序列相似度歸并和操作分類單元聚類分析，產生OTU表并與Silva數據庫（Release132，http：//www. arb-silva. de）、Greengenes數據庫（Release13. 8，http：//greengenes. secondgenome. com）比對分類分析。

使用QIIME2軟件獲取各樣本在科屬分類水平上的食物組成和相對豐度（relative abundance，RA），揭示紅腿長吻松鼠的食性組成。在進行食性分析時，采用相對豐度和出現頻率（frequency of occur?rence，FO）兩個指標綜合評估紅腿長吻松鼠食物構成［24］。為比較雌、雄紅腿長吻松鼠食物組成的差異，使用物種豐富度Chaol指數、Ace指數以及物種多樣性Shannon指數、Simpson指數，計算食物組成的α 多樣性。采用Mann-Whitney U 檢驗比較紅腿長吻松鼠食物組成α 多樣性的性別差異，顯著性水平α =0. 05，用SPSS 26. 0軟件統計分析。采用主坐標分析（principal co-ordinates analysis，PCoA），選擇Bray-Curtis距離算法開展不同性別紅腿長吻松鼠的β 多樣性分析，分析在R 4. 3. 0中實現。

3 結果

3. 1 OTU 劃分與分類地位鑒定

分別選取紅腿長吻松鼠葉綠體rbcL 基因片段、線粒體COI基因片段，對其胃內容物的植物組成和動物組成進行組分分析鑒定。在植物鑒定中，從12個樣品中共獲得目的片段1 487 702 條，樣本序列為86 849 ～ 153 085條，平均長度280 bp，以97%相似度進行聚類共得到721個OTU。在動物鑒定中，共從12個樣品中獲得目的片段979 575條，樣品的序列數最低為51 165條，最高為121 604條，平均長度320 bp，按97%相似度進行聚類得到859個OTU。

3. 2 紅腿長吻松鼠食物組成

紅腿長吻松鼠的食性較為復雜，剔除自身序列和無法鑒定且數量較少的序列優化篩選后，將其食物來源分為植物性食物和動物性食物。

從植物性食物成分上看，從12只紅腿長吻松鼠個體的胃內容物樣品中，共鑒定植物種類4門42目85科180屬。在科水平上（圖2），相對豐度 gt; 1%的植物科有11個，分別為胡桃科（Juglandaceae）、禾本科（Poaceae）、殼斗科、薔薇科（Rosaceae）、鼠李科（Rhamnaceae）、樟科、柳葉蘚科（Amblystegiaceae）、獼猴桃科（Actinidiaceae）、山茱萸科（Cornaceae）、樺木科（Betulaceae）和菊科（Asteraceae），其中以胡桃科、禾本科和殼斗科為主要的植物性食物，分別占比27. 45%、16. 67% 和11. 92%，植物性食物的出現頻率均較高，其中胡桃科、禾本科、殼斗科、薔薇科、樟科和樺木科的出現頻率為100%，而菊科、楊梅科（Myricaceae）和榿葉樹科（Clethraceae）出現頻率為75%。

在屬水平上（圖3），相對豐度 gt; 10%的植物為胡桃屬（Juglans）、栗屬（Castanea）和白茅屬（Impe?rata），相對豐度分別為27. 28%、11. 84%和10. 67%。棗屬（Ziziphus）、玉蜀黍屬（Zea）、栒子屬（Cotoneas?ter）、山胡椒屬（Lindera）、Sarmentypnum、懸鉤子屬（Rubus）、獼猴桃屬（Actinidia）、山茱萸屬（Cornus）和鵝耳櫪屬（Carpinus）也是紅腿長吻松鼠的主要采食屬。出現頻率最高的屬為胡桃屬、栗屬、白茅屬、山胡椒屬、青錢柳屬（Cyclocarya）和樺木屬（Betula），出現頻率均為100%。

從動物性食物成分上看，共鑒定出攝食的動物種類分屬于3個門，分別為軟體動物門（Mollusca）、節肢動物門（Arthropoda）和脊索動物門（Chordata），包括24目59科71屬。在科水平上（圖4），無脊椎動物是紅腿長吻松鼠最常見的食物種類，相對豐度排在前10 位的動物為田螺科（Viviparidae）、蚌科（Unionidae）、劍水蚤科（Cyclopidae）、沼大蚊科（Li?moniidae）、管薊馬科（Phlaeothripidae）、螽斯科（Tetti?goniidae）、裳夜蛾科（Erebidae）、溞科（Daphniidae）、眼蕈蚊科（Sciaridae）和象甲科（Curculionidae），相對豐度分別為4. 26%、4. 14%、3. 46%、2. 97%、2. 18%、1. 61%、1. 50%、1. 47%、1. 39%和1. 27%。動物性食物的出現頻率均較低，其中出現頻率最高的為劍水蚤科，占比58. 33%，而田螺科、蚌科、螽斯科、搖蚊科（Chironomidae）、蚊科（Culicidae）和果蠅科（Drosophi?lidae）的出現頻率僅為33. 34%。

在屬水平上（圖5），相對豐度排在前10位的為石田螺屬（Sinotaia）、Polymera、矛蚌屬（Lanceolaria）、簡管薊馬屬（Haplothrips）、劍水蚤屬（Cyclops）、溫劍水蚤屬（Thermocyclops）、Homoeocera、溞屬（Daph?nia）、遲螽屬（Lipotactes）和Nodularia，相對豐度分別為4. 25%、2. 97%、2. 89%、2. 18%、2. 01%、1. 42%、1. 41%、1. 31%、1. 25%和1. 25%。出現頻率較高的為劍水蚤屬、大鼠屬（Berylmys）、簡管薊馬屬和溞屬，出現頻率分別為50. 00%、50. 00%、41. 67% 和41. 67%。

3. 3 紅腿長吻松鼠食物組成多樣性的性別差異

紅腿長吻松鼠胃容物樣品的α 多樣性指數（Chao1、ACE、Shannon和Simpson）計算結果顯示，雌雄紅腿長吻松鼠的食物多樣性存在一定的差異（表2）。雌性紅腿長吻松鼠的Chao1、ACE、Shannon 和Simpson指數均高于雄紅腿長吻松鼠，其中，植物性食物的各項指標均呈顯著性差異。雌性和雄性紅腿長吻松鼠的動物性食物的α 多樣性指數差異并不顯著（表2）。基于Bray-Curtis距離算法的PCoA分析結果顯示（圖6），不同性別紅腿長吻松鼠胃容物樣品食物組成存在一定的重疊，植物性食物的重疊度較高，動物性食物的重疊度較低，均未呈現顯著差異。

4 討論

4. 1 紅腿長吻松鼠食性特征

本研究利用高通量測序技術首次系統報告了貴州北部地區紅腿長吻松鼠的食性。結果顯示，紅腿長吻松鼠具有極為豐富多樣的食譜，攝食對象涵蓋種子植物、苔蘚植物、節肢動物、軟體動物和浮游動物等多個生物類群，紅腿長吻松鼠展現了較為典型的雜食性特征。與其他使用傳統形態學進行松鼠科動物食性的研究［25?27］相比較，本研究食性分析結果獲得了分辨率更高的動植物食物圖譜。從具體植物性食物成分上看，胡桃科、禾本科和殼斗科等植物是紅腿長吻松鼠最主要的秋季食物種類，主要原因是這些植物資源易獲取，產量大，取食成本低。本研究采樣地位于寬闊水保護區，該區域植被類型主要為中亞熱帶常綠落葉闊葉混交林，殼斗科和樟科為主要植物種類，并伴有胡桃科、薔薇科和禾本科等植物，光葉水青岡、茅栗（Castanea seguinii）、胡桃楸（Juglans mandshurica）和黑殼楠（Lindera mega?phylla）等植物在研究區內分布廣且數量多［21］27-30。這些分布較多的植物為紅腿長吻松鼠提供了豐富的食物來源。植物蛋白質、脂肪、纖維素及其他營養成分對嚙齒動物的行為和生理都有不同程度的影響，一般來說，動物通常會選擇營養含量高的食物［28］。適口性也是影響動物食性的一個十分重要的因素［29］。本研究結果發現，在紅腿長吻松鼠食物組成中薔薇科和獼猴桃科植物亦占有較大的比例，可能是這類植物營養豐富，同時具有較好的適口性，使得它們成為紅腿長吻松鼠秋季主要食物選擇之一。有研究表明，許多松鼠會盜食農作物（玉米、小麥等）［30?31］。在本研究中，也檢測到一定豐度的禾本科的玉蜀黍屬、稻屬（Oryza）等植物，說明紅腿長吻松鼠有盜食作物的行為，而本次采樣時間也正值當地玉米、水稻等農作物成熟的時期。本研究發現，紅腿長吻松鼠攝食植物中的Sarmentypnum 屬目前在我國只有云南省有記錄，而貴州地區暫無分布記錄。這可能是當前對該屬物種缺乏研究，相關報道較少，也可能是物種注釋的問題，采用97%序列相似度標準進行物種歸并分析，可能影響了高通量測序在某些物種鑒別方面的精準度，導致對該屬的分類辨識不夠清晰，被歸并到近緣屬種。在攝食動物性食物中，也存在類似現象。

從動物性食物成分上看，共鑒定出攝食的動物種類包括無脊椎動物（軟體動物、節肢動物）和脊索動物。無脊椎動物被紅腿長吻松鼠頻繁采食，是其最主要的動物性食物來源。值得注意的是，多個樣本中檢測到一定豐度的貝類動物，可能與食物的可獲得性有關。采樣地靠近水庫，有大量貝類動物，且采樣時間剛好處于水庫的枯水期會有許多貝類擱淺在水庫周邊，且體型較大的貝類的脂肪含量比其他類群高。選擇資源量豐富且易獲得的食物意味著取食容易，即在覓食過程中以最小的能量投入獲取最大的收益，這種取食策略符合最優覓食選擇［32］。很多研究已經證實：昆蟲是松鼠科動物最重要的動物性食物資源之一，在山西蘆芽山國家級自然保護區，巖松鼠（Sciurotamias davidianus）胃內容物中約10%為昆蟲［30］；金志民等［26］在我國黑龍江林區通過解剖觀察北松鼠（Sciurus vulgaris）和花鼠（Tamias sibiri?cus）胃內容物研究其食性時，也發現它們頻繁取食昆蟲。在本研究中，沼大蚊科、管薊馬科、螽斯科和裳夜蛾科等昆蟲類動物也是紅腿長吻松鼠的主要取食對象。此外，引物還擴增出了劍水蚤科等浮游動物序列，這類動物體型細小，大多數用肉眼看不見，傳統形態學方法難以鑒定，而高通量測序技術有不受消化作用限制且有極高的靈敏度和準確性的優點，能夠以更高的檢出率鑒別出傳統形態學食性分析方法難以鑒別出的食物種類。Bradley［33］對美國西部地區羚羊地松鼠（Ammospermophilus leucurus）的食性研究發現，嚙齒類動物美洲黃鼠（Spermophilus te?reticaudus）和食蝗鼠（Onychomys torridus）等的遺骸全年都在其胃中被發現；周宏力等［25］也在小興安嶺地區松鼠的糞便中發現含有鼠類毛樣及小型動物骨骼。本研究在部分樣品中也檢測到鼠科（Muridae）動物的存在，說明紅腿長吻松鼠會捕食一些小型脊椎動物，此外還檢測到大量紅腿長吻松鼠自身DNA序列，這些序列可能是取樣時刮到了其胃內壁組織，導致在后續DNA提取中被大量檢出；另外可能是在DNA提取的過程中，自身基因對試驗結果的影響。類似的研究結果也在Deagle et al.［34］及徐靜靜等［15］的研究中被發現。總而言之，紅腿長吻松鼠食性主要依賴于環境中食物的豐富度、種類及可利用程度，其食性也會隨著生境可獲得資源的不同而有所調整。

4. 2 雌雄紅腿長吻松鼠食物組成多樣性差異

不同性別動物的食性差異反映動物在不同生長階段上對營養的不同需要［35］。α 多樣性分析發現，不同性別紅腿長吻松鼠的食性總體相似而在種類組成上略有差異，雌性的植物性食物的豐富度和多樣性均高于雄性，動物性食物的豐富度亦如此。筆者解剖樣本時發現有妊娠情況，說明秋季是紅腿長吻松鼠的繁殖季，雌性為了在相對較小的領域內維持生長和繁殖的高能量消耗被迫拓寬食譜，也有可能是競爭不敵雄性而導致擴大范圍尋找食物，所以雌性樣本的食物組成多樣性更為豐富。

本研究初步揭示了黔北地區紅腿長吻松鼠的食物種類組成，為該物種營養生態學研究積累了重要的基礎數據。同時，也證實了高通量測序技術在嚙齒類動物食性研究中的可行性，為今后同類動物的食性研究提供了方法借鑒。當然，與傳統方法相比，高通量測序技術也存在一些不足之處：第一，高通量測序可能鑒定出額外的食物分類單元，因為其難以區分食物是被直接攝食進入腸胃中，還是動物的二級進食帶入導致被檢出［17］；第二，高通量測序結果也會受到多種因素的影響，如DNA的提取、PCR的擴增、引物的選擇、序列分類學分配以及參考數據庫的完善程度等［36］。因此，想要更準確全面地解析動物食性特征，仍需與傳統的胃含物分析等多種食性研究方法相結合。即便如此，基于高通量測序的食性研究的分類精度遠遠比傳統的顯微組織法高，在一定范圍內是一種既高效又精確的食性研究方法。由于樣本采集區域面積和野外數據積累時間有限，本研究尚無法全面反映紅腿長吻松鼠的食性及其季節變化，將在后續工作中繼續加強更長時間跨度和地理尺度的數據積累，從而獲得更加準確全面的紅腿長吻松鼠食物組成信息。

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基金項目：國家自然科學基金項目（32060307）