基于微衛(wèi)星標(biāo)記的雪豹種群結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性

摘 要 掌握雪豹（Panthera uncia）的遺傳多樣性信息對(duì)其保護(hù)和管理有重要意義。對(duì)104只雪豹個(gè)體的組織樣品提取DNA，結(jié)合文獻(xiàn)中提供的70個(gè)雪豹基因分型數(shù)據(jù)，利用9個(gè)微衛(wèi)星多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行遺傳多樣性研究。結(jié)果顯示：當(dāng)樣本量從70個(gè)增加到174個(gè)時(shí)，雪豹種群有分化為2個(gè)種群的趨勢(shì)，即西北部群和中部群；共檢測(cè)到45個(gè)等位基因（Na），中部、西北部2個(gè)種群平均每個(gè)位點(diǎn)Na分別為4. 556和4. 667，平均期望雜合度（He）分別為0. 574和0. 591，平均觀測(cè)雜合度（Ho）分別為0. 517和0. 498。雪豹群體的平均近交系數(shù)（FIS）為0. 137，平均遺傳分化系數(shù)（FST）為0. 067，平均多態(tài)信息含量（PIC）為0. 602，種群間遺傳變異為15. 24%，種群內(nèi)遺傳變異為84. 76%。9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)具有中高程度多態(tài)性，與其他雪豹研究相比，2個(gè)雪豹種群遺傳多樣性處于中等水平，種群間遺傳分化水平處于中等程度，遺傳變異大部分來源于群體內(nèi)部。研究結(jié)果對(duì)全球雪豹的種群結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性研究具有重要意義，也為雪豹未來的科學(xué)保護(hù)提供可靠的遺傳背景。

關(guān)鍵詞：雪豹；種群結(jié)構(gòu)；遺傳多樣性；微衛(wèi)星標(biāo)記

中圖分類號(hào)：Q953

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：2310 - 1490（2024）- 04 - 0699 - 10

DOI：10.12375/ysdwxb.20240402

雪豹（Panthera uncia）是全球廣泛關(guān)注的瀕危物種之一，隸屬于食肉目（Carnivora）貓科（Felidae）豹屬（Panthera）［1］，通常出現(xiàn)在海拔3 000 ～ 4 500 m的區(qū)域，但在海拔900 ～ 1 500 m的戈壁沙漠的北部地區(qū)及海拔高至5 800 m的喜馬拉雅或青藏高原區(qū)域也有活動(dòng)［2］。長期以來，因棲息地喪失、獵物減少、氣候變化以及非法盜獵等因素的影響，雪豹種群持續(xù)下降［3?4］，已被列為國家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物和《中國生物多樣性紅色名錄：脊椎動(dòng)物卷》瀕危（EN）等級(jí)［5?6］。目前，雪豹分布于我國青藏高原及其周邊的12個(gè)國家，是山地生物多樣性的旗艦物種［7］。在中國，雪豹分布在8個(gè)省區(qū)，其棲息地面積占全球雪豹棲息地面積的60%以上，中國在雪豹的物種保護(hù)方面有重要地位［1］。

了解并掌握雪豹的遺傳背景、致危因素及遺傳多樣性水平，對(duì)雪豹的科學(xué)保護(hù)具有重要意義。由于雪豹活動(dòng)的特殊性，樣品采集面臨著諸多挑戰(zhàn)。隨著技術(shù)的發(fā)展，非損傷性遺傳取樣法提供了解決方案，通過收集野生動(dòng)物脫落的毛發(fā)及排泄物等樣品，使用分子標(biāo)記如擴(kuò)增片段長度多態(tài)性［8］、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA［9］、線粒體基因［10］及微衛(wèi)星［11］等，在這些分子標(biāo)記中，微衛(wèi)星因其高度多態(tài)性、選擇中性和共顯性等優(yōu)點(diǎn)，在個(gè)體識(shí)別、遺傳多樣性評(píng)估和種群遺傳結(jié)構(gòu)分析等方面具有廣泛的應(yīng)用前景［12］。

目前，通過采集雪豹糞便獲得遺傳信息，并使用微衛(wèi)星分子標(biāo)記對(duì)雪豹群體遺傳多樣性進(jìn)行了較廣泛的研究，已經(jīng)覆蓋中國、蒙古國和印度等9 個(gè)國家［13?20］。有研究推測(cè)全球雪豹應(yīng)分為3個(gè)亞種，西部亞種（P. uncia uncia）分布于天山山脈、帕米爾高原、喀喇昆侖山脈和喜馬拉雅山脈西段等；中部亞種（P. u. uncioides）分布于青藏高原和喜馬拉雅山中東段；北部亞種（P. u. irbis）分布于阿爾泰山脈和蒙古國南部戈壁［16］。綜合以上研究，與豹屬其他物種相比，雪豹的遺傳多樣性處于較低水平［1］，但雪豹的遺傳多樣性及亞種劃分可能因樣本采集位置及數(shù)量受限而導(dǎo)致結(jié)果差異。因此，本研究進(jìn)一步擴(kuò)大雪豹的采樣范圍及數(shù)量，以獲得更準(zhǔn)確的遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，為未來的雪豹種群劃分及遺傳學(xué)保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)樣本

以東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)植物檢測(cè)中心實(shí)驗(yàn)室在執(zhí)法鑒定和行業(yè)監(jiān)管中采樣得到的104個(gè)雪豹個(gè)體組織樣本（101個(gè)來源于四川西部、西藏和青海等地，3個(gè)來自蒙古國進(jìn)境執(zhí)法檢查）為研究對(duì)象，將其置于密封袋中，-20 ℃保存。由文獻(xiàn)［16］獲得70個(gè)已知來源地的3個(gè)雪豹種群微衛(wèi)星基因分型數(shù)據(jù)。

1. 2 DNA 提取

使用AxyPrep Genomic DNA Miniprep Kit（Axy?gen，美國）試劑盒按說明書對(duì)104個(gè)雪豹組織樣本進(jìn)行DNA 提取。使用1. 0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度，用紫外分光光度計(jì)儀器（Implen，德國）測(cè)定DNA濃度，并置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 PCR 擴(kuò)增

根據(jù)雪豹已有研究成果［16］，選用9對(duì)微衛(wèi)星引物（PUN1157、PUN82、PUN100、PUN8972、PUN1283、PUN80、PUN1270、PUN272、PUN44）用于肌肉樣本DNA的擴(kuò)增（表1）。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件與文獻(xiàn)［16］一致。取3 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1. 0%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，其中成功擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物用ABI 3730XL測(cè)序儀（Applied Biosystems Inc，美國）進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)，得到等位基因大小。以上實(shí)驗(yàn)，除DNA提取外，均由北京六合華大基因科技有限公司完成。

1. 4 數(shù)據(jù)處理

利用9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)分別對(duì)70個(gè)文獻(xiàn)中的樣本和合并104個(gè)樣本后的全部樣本（174個(gè)）進(jìn)行種群結(jié)構(gòu)分析。主成分分析（principal component analy?sis，PCA）使用R 3. 2. 4的adegenet 1. 2. 4包［21］。種群結(jié)構(gòu)分析使用Structure 2. 3. 4軟件［22］中的貝葉斯聚類方法，K 值1 ～ 8，每個(gè)K 值計(jì)算15次并確定最佳K值［23］。使用GenAlEx 6. 5［24］統(tǒng)計(jì)3個(gè)群體的等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因（Ne）、觀測(cè)雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、香農(nóng)信息指數(shù)（I）、近交系數(shù)（FIS）和群體遺傳分化系數(shù)（FST）。使用PowerMarker 3. 25［25］統(tǒng)計(jì)遺傳多態(tài)性信息含量（PIC）以及個(gè)體間的Nei’s遺傳距離。基于174個(gè)雪豹樣本間Nei’s遺傳距離，使用MEGA11 軟件［26］的個(gè)體鄰接法（neighborjoining，NJ）構(gòu)建聚類樹。使用Arlequin 3. 5. 2. 2 軟件［27］進(jìn)行分子方差分析（analysis of molecular vari?ance，AMOVA）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 PCR 擴(kuò)增結(jié)果

用9對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)104個(gè)雪豹樣本DNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲得長度在100 ～ 150 bp的擴(kuò)增條帶，擴(kuò)增條帶清晰，大小一致（圖1），可以用于后續(xù)多態(tài)性分析。

2. 2 種群結(jié)構(gòu)

從圖2A可知，9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)可將70個(gè)已知樣本數(shù)據(jù)按照3個(gè)雪豹種群清晰分開，表明這些微衛(wèi)星位點(diǎn)具有較高的靈敏度。

全部樣本的PCA結(jié)果顯示：101個(gè)樣本與文獻(xiàn)［16］中的中部樣本聚集在一起，3個(gè)樣本與文獻(xiàn)［16］中的北部樣本聚集在一起，與樣本來源地相符（圖2B）；同時(shí)相對(duì)于中部樣本，西部樣本與北部樣本呈現(xiàn)出聚集的趨勢(shì)。為排除地理標(biāo)簽對(duì)PCA分析的影響，去除地理標(biāo)簽限制后繪制的PCA結(jié)果顯示：整體數(shù)據(jù)主要分為2個(gè)聚類群（圖2C），即西部與北部種群數(shù)據(jù)并為一個(gè)群體，中部種群數(shù)據(jù)并為一個(gè)群體。

基于PCA 結(jié)果，對(duì)雪豹的種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。由圖3A可知，對(duì)于70個(gè)已知樣本，當(dāng)K = 3時(shí)，中部、西部和北部種群祖先成分呈不同結(jié)構(gòu)，與文獻(xiàn)［16］中的結(jié)果基本一致。174個(gè)樣本的分析結(jié)果顯示：當(dāng)K = 2和K = 3時(shí)，兩種結(jié)果均體現(xiàn)出西部種群和北部種群祖先成分具有一致性（圖3B，C），且當(dāng)K = 2時(shí)，ΔK 呈現(xiàn)最大值（圖3D）。結(jié)果表明，雪豹分為2個(gè)種群具有一定的合理性。

此外，基于70個(gè)樣本和174個(gè)樣本的Nei’s遺傳距離分別構(gòu)建了NJ聚類樹（圖4）。70個(gè)樣本的聚類樹顯示（圖4A），西部與北部個(gè)體混合在一支，中部個(gè)體主要分為兩支；174 個(gè)樣本的聚類樹顯示（圖4B），西部與北部大部分個(gè)體仍主要聚集在一支，不過一部分中部個(gè)體與西部個(gè)體混在一支。雖然兩個(gè)NJ聚類樹均存在少量個(gè)體的混合穿插，但均表明西部與北部個(gè)體的遺傳距離較近，也支持雪豹西部與北部種群并為一個(gè)群體。

2. 3 遺傳多樣性分析

首先分析全部樣本的總體遺傳多樣性，共識(shí)別出45個(gè)Na。由表2可知，所有微衛(wèi)星位點(diǎn)的Na平均值為4. 611（3. 500 ～ 7. 500）；Ne 平均值為2. 587（1. 655 ～4. 124）；I 平均值為1. 079（0. 707 ～ 1. 468）；Ho 平均值為0. 508（0. 271 ～ 0. 679）；He 平均值為0. 583（0. 396 ～ 0. 756）；FIS平均值為0. 137，其中PUN82為負(fù)值，其余8個(gè)位點(diǎn)為正值；FST平均值為0. 067（0. 010 ～0. 179）；PIC平均值為0. 602（0. 411 ～ 0. 787）。結(jié)果表明，9個(gè)位點(diǎn)均呈現(xiàn)中高程度的遺傳多樣性，其中3個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)為中度多態(tài)性（0. 25 lt; PIC lt; 0. 50），分別為PUN44、PUN1283和PUN82，其余位點(diǎn)均為高度多態(tài)性位點(diǎn)（PIC gt; 0. 50），遺傳多樣性較豐富。

中部群和西北部群的遺傳多樣性結(jié)果顯示（表3）：9 個(gè)位點(diǎn)在2 個(gè)種群中檢測(cè)到3 ～ 8 個(gè)Na，其中PUN1270位點(diǎn)檢測(cè)的Na數(shù)量最多，PUN1283、PUN80和PUN82位點(diǎn)檢測(cè)到的Na數(shù)量最少；中部和西北部2個(gè)種群的平均Na分別為4. 556和4. 667；平均Ne分別為2. 548和2. 626；平均Ho分別為0. 517和0. 498；平均He分別為0. 574和0. 591。哈迪溫伯格平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示：在中部種群中，PUN44和PUN82兩個(gè)位點(diǎn)不符合哈迪溫伯格平衡；西北部種群中PUN44、PUN1157、PUN1270、PUN1283、PUN8972 和PUN82六個(gè)位點(diǎn)偏離哈迪溫伯格平衡（表4）。

2. 4 微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳分化

AMOVA結(jié)果顯示，在雪豹2個(gè)種群中，種群間的遺傳變異占15. 24%，種群內(nèi)的遺傳變異占84. 76%（表5），表明變異大部分發(fā)生在種群內(nèi)部，種群之間的遺傳變異所占比例較小，同時(shí)也表明2個(gè)雪豹種群間的基因交流較少，大部分的變異來源于群體內(nèi)部。

3 討論

3. 1 雪豹種群遺傳結(jié)構(gòu)

關(guān)于雪豹群體或亞種的劃分一直存在爭議。最早在2015年，Riordan et al.［28］根據(jù)模型分析雪豹種群的連通性，建議將雪豹分為南、北2個(gè)地理種群。在2017 年，Kitchener et al.［29］在對(duì)貓科動(dòng)物重新分類時(shí)沒有采納該意見，依然判斷全球雪豹為1個(gè)種群。同年，Janecka et al.［16］基于33個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，對(duì)70個(gè)雪豹糞便樣本進(jìn)行基因分型，結(jié)合遺傳結(jié)構(gòu)和地理隔離，支持將全球雪豹分為3個(gè)亞種。本研究利用9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，先后對(duì)文獻(xiàn)［16］中70只雪豹個(gè)體數(shù)據(jù)和174只個(gè)體數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到了不同的種群結(jié)構(gòu)。70只雪豹數(shù)據(jù)的種群結(jié)構(gòu)與文獻(xiàn)［16］結(jié)果相近（圖2A，圖3A），支持雪豹3個(gè)群體的劃分。但是，在174個(gè)樣本的結(jié)果中，西部群體和北部群體接近，形成一個(gè)群體，與中部種群相對(duì)應(yīng)（圖2B、C）；種群結(jié)構(gòu)上也支持了2個(gè)群體的劃分（圖3B、C，圖4）。出現(xiàn)這樣的變化，可能歸因于Janecka et al.［16］研究的樣本量較小、地理覆蓋不全，進(jìn)而放大了小群體之間的差異。當(dāng)樣本量增大時(shí)，西部群體和北部群體逐步聚集。實(shí)際上，Janecka et al.［16］的研究結(jié)果也支持這一觀點(diǎn)，例如，在其小樣本分析中，雖然都存在少量混合，但北方群體的蒙古國西部群（15個(gè)樣本）和南部群（17個(gè)樣本）形成了2個(gè)不同的集群（文獻(xiàn)［16］圖2i）；中部群體也分成了2個(gè)群體（文獻(xiàn)［16］圖2g），青海地區(qū)群（北部和南部，共11個(gè)樣本）與西藏地區(qū)群（含不丹和尼泊爾，共13 個(gè)樣本）。Senn et al.［30］也認(rèn)為Janecka et al. 的研究缺乏足夠的樣本量，不足以支持3個(gè)亞種的劃分。兩個(gè)NJ聚類樹也支持北部與西部群體并為一個(gè)群體，聚類樹上少量個(gè)體的混合穿插，可能與群體間的基因流動(dòng)有關(guān)，也可能與微衛(wèi)星位點(diǎn)數(shù)量偏少、精度不夠有關(guān)。因此，本研究認(rèn)為目前的研究結(jié)果不支持Jan?ecka et al. 雪豹3個(gè)亞種的劃分，支持將雪豹按照2個(gè)群體劃分，即中部群和西北部群。在地理上，雪豹中部群體與北部、西部群體也存在一定的阻隔。雪豹中部群體，在北方有戈壁沙漠與北部群體相隔［1］，南部有喜馬拉雅山脈與其南麓相隔，西部有塔克拉瑪干沙漠、塔里木盆地和南部的喀喇昆侖山脈等［31］，也可能阻隔了其與西部群體的交流。不過，相對(duì)于中部樣本（125個(gè)），西部（16個(gè)）和北部（33個(gè)）的樣本數(shù)量仍較少，樣本數(shù)量不平衡可能影響了研究結(jié)果。

3. 2 雪豹種群遺傳多樣性

遺傳多樣性水平可以反映物種的進(jìn)化潛力［32］，能為物種現(xiàn)狀評(píng)估和保護(hù)提供重要信息［33］。目前，使用微衛(wèi)星標(biāo)記的方法對(duì)雪豹種群進(jìn)行遺傳多樣性研究，樣本范圍覆蓋了9個(gè)國家，樣本數(shù)共達(dá)到211只，但單次研究中每個(gè)地區(qū)有效的樣本采集數(shù)量不超過30只［1］，而且關(guān)于雪豹群體遺傳多樣性的不同研究結(jié)果出現(xiàn)了一定的波動(dòng)。

多態(tài)信息含量是表示微衛(wèi)星位點(diǎn)變異程度高低、衡量基因片段多態(tài)性的一個(gè)指標(biāo)［34］，包括低度多態(tài)性位點(diǎn)（PIC lt; 0. 25）、中度多態(tài)性位點(diǎn)（0. 25 0. 50）［35］。本研究使用的9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中，不存在低度多態(tài)性位點(diǎn)，適用于雪豹遺傳學(xué)分析。全部雪豹群體在9個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上檢測(cè)到的Na 為3 ～ 8，Ne 為1. 655 ～4. 124，在其他雪豹研究中，Na為2. 571 ～ 6. 286［13?20］，Ne為2. 031 ～ 2. 800［16，20］，本研究結(jié)果與已有研究結(jié)果基本一致。本研究結(jié)果中Na 和Ne 的數(shù)值范圍更大，可能與樣本量大有關(guān)。此外，Na值均大于Ne，表明等位基因分布不均勻，存在差異，可能受到群體間潛在的近親繁殖或遺傳漂變等因素的影響，未來種群也存在等位基因丟失以及遺傳多樣性下降的風(fēng)險(xiǎn)。

雜合度是衡量群體遺傳多樣性程度最重要的指標(biāo)之一，數(shù)值越大代表種群間遺傳多樣性越豐富。此前關(guān)于雪豹的遺傳多樣性研究中，不同調(diào)查群體的Ho在0. 371 ～ 0. 887，He在0. 330 ～ 0. 781［13?20］。本結(jié)果中，中部和西北部2 個(gè)雪豹群體的Ho 分別為0. 517和0. 498，He分別為0. 574和0. 591，與此前的研究結(jié)果相比，處于中等水平，可能是樣本量增大之后得到了更接近于雪豹整體實(shí)際情況的結(jié)果。在這些研究中，周蕓蕓等［19］在青海2個(gè)縣以及甘肅阿克塞縣調(diào)查的雪豹遺傳多樣性偏高（平均Ho為0. 843，平均He為0. 759），可能歸因于樣本量小而產(chǎn)生的差異。通過雜合度數(shù)值，與豹屬其他物種［1］相比，雪豹的遺傳多樣性較低。

結(jié)果中所有位點(diǎn)的FIS 平均值為0. 137，遠(yuǎn)低于巴基斯坦地區(qū)雪豹的FIS 平均值（0. 38）［18］。可能歸因于在巴基斯坦進(jìn)行雪豹樣本采集的5個(gè)地區(qū)相距較近，而且該國雪豹分布范圍較小、數(shù)量較少［7］，因此，可能加劇了群體內(nèi)部近親繁殖的概率。當(dāng)種群數(shù)量擴(kuò)大時(shí)，近交系數(shù)下降，表明在更大的雪豹分布區(qū)中，雪豹的近交程度可能沒有達(dá)到更高的水平。相比于近交程度較低的大熊貓（Ailuropoda melano?leuca）（種群平均FIS為0. 081）［12，36］和近交程度很高的華南虎（Panthera tigris amoyensis）（0 lt; FIS lt; 0. 42）［12，37］，雪豹種群近交程度偏低。

以上分析中，不同研究得到的雪豹遺傳多樣性指標(biāo)存在著一定的波動(dòng)，這可能受到樣本數(shù)量及采樣范圍大小的影響，當(dāng)樣本量大、地理來源更廣時(shí)，得到的結(jié)果可能更接近于實(shí)際情況。不過局部小樣本量的研究，對(duì)當(dāng)?shù)匮┍》N群的保護(hù)管理也具有一定的指導(dǎo)意義。

本研究利用174只雪豹個(gè)體9個(gè)位點(diǎn)的微衛(wèi)星數(shù)據(jù)，對(duì)雪豹種群結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性進(jìn)行分析，現(xiàn)有的結(jié)果支持將雪豹?jiǎng)澐譃?個(gè)群體，即中部群體和西北部群體。與其他雪豹有關(guān)研究相比，這2個(gè)種群的遺傳多樣性處于中等水平，近交水平也較低（低于Aruge et al.［18］的研究），略高于大熊貓。本研究通過大樣本微衛(wèi)星數(shù)據(jù)對(duì)全球雪豹的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，對(duì)雪豹的種群劃分和遺傳多樣性提供了更全面的數(shù)據(jù)支持，對(duì)雪豹的遺傳多樣性研究和指導(dǎo)保護(hù)實(shí)踐具有重要意義。

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基金項(xiàng)目：國家林業(yè)和草原局機(jī)關(guān)業(yè)務(wù)委托項(xiàng)目（HFW220200050）