LC-MS/MS法對血栓通注射液中皂苷成分快速定量分析

【摘要】目的：建立LC-MS/MS方法快速測定血栓通注射液中5種皂苷成分。方法：色譜柱為BEH C18（2.1mm*100mm，1.8μm），流速為0.400mL/min，流動相為乙腈-水，洗脫方式為梯度洗脫，柱溫為30℃，進樣量為2μL；采用多重反應監測模式（MRM）下負離子掃描方式，離子源為ESI-。結果：人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd及三七皂苷R1在濃度范圍內線性關系良好，R2>0.999，定量限在0.34～1.45ng/mL；低、中、高3種濃度水平加樣回收率在90.59%～104.10%，相對標準偏差為1.27%～4.29%；進樣精密度為1.80%～2.64%。結論：本研究成功建立血栓通注射液中5種皂苷成分LC-MS/MS定量分析方法，方法操作簡單，準確度和精密度良好，并完成不同廠家不同批次血栓通注射液中5種皂苷成分測定。

【關鍵詞】LC-MS/MS；血栓通注射液；人參皂苷Rg1；人參皂苷Rb1；人參皂苷Re；人參皂苷Rd；三七皂苷R1

LC-MS/MS method for rapid quantitative analysis of saponin components in Xueshuantong injection

ZHANG Xiaojun1， FU Huihui2

1.Guangdong Leiyunshang Pharmaceutical Co.， Ltd， Yunfu， Guangdong 527300， China； 2.Yunfu Traditional Chinese Medicine Hospital， Yunfu， Guangdong 527300， China

【Abstract】Objective：To establish a LC-MS/MS method for rapid determination of five saponin components in Xueshuantong injection. Methods：The chromatographic column was BEH C18 （2.1mm * 100mm，1.8 μm），with a flow rate of 0.400 mL/min，the mobile phase was acetonitrile water，the elution method was gradient elution，the column temperature was 30℃，and the injection volume was 2μL；Adopting the negative ion scanning method under multiple reaction monitoring mode （MRM），and the ion source was ESI-.Results：The linear relationship between ginsenoside Rg1，ginsenoside Rb1，ginsenoside Re，ginsenoside Rd，and noto ginsenoside R1 was good within the concentration range，with R2>0.999，and the quantification limits of the five saponin components were from 0.34 to 1.45 ng/mL；The recovery rates of the five saponin components at low，medium，and high concentration levels ranged from 90.59% to 104.10%，and the relative standard deviation was from 1.27% to 4.29%；The precision of injection were between 1.80% and 2.64%.Conclusion：This study successfully established a LC-MS/MS quantitative analysis method for five saponin components in Xueshuantong injection.The method is simple to operate，with good accuracy and precision，and has been used to determine the five saponin components in different batches of Xueshuantong injection from different manufacturers.

【Key Words】LC-MS/MS； Xueshuantong injection； Ginsenoside Rg1； Ginsenoside Rb1； Ginsenoside Re； Ginsenoside Rd； Notoginsenoside R1

血栓通注射液是以三七總皂苷為主要成分的中藥注射液[1-2]。目前，血栓通注射劑主要成分采用是HPLC法檢測[3]，此方法檢測技術簡單，但分析時間較長，常規檢測分析效率低。LC-MS/MS為藥物分析領域的先進檢測技術，具有專屬性強、靈敏度高、檢測時間短等特點[4]。本文成功建立了一種高效率、高靈敏度的血栓通注射液中5種皂苷成分LC-MS/MS測定方法。

1儀器與試藥

1.1 儀器與試劑

Waters TQ/S高效液相串聯質譜儀（Waters），百萬分之一電子天平（上海梅特勒），乙腈為色譜純（德國Merck公司），水為純凈水（娃哈哈股份有限公司）。

1.2材料

人參皂苷Rg1（批號：110703-201913）、人參皂苷Rb1（批號：110704-202021）、人參皂苷Re（批號：110754-202125）、人參皂苷Rd（批號：110704-202124）、三七皂苷R1（批號：110745-201918），上述對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。6批血栓通注射液收集于當地醫院藥房，其中S1～3、S4～6分別為廠家A、廠家B。

2 方法

2.1分析方法

2.1.1色譜條件

色譜柱：BEH C18（2.1mm*100mm，1.8μm），流速為0.400mL/min，以乙腈為流動相A，以水溶液為流動相B，洗脫程序見表1；柱溫：30℃，進樣量：1μL。

2.1.2質譜條件

離子源為電噴霧（ESI），負離子掃描模式，質譜監測采用多重反應（MRM）監測模式，毛細管電壓2.50kV，錐孔電壓30.00V，離子源溫度150℃，去溶劑溫度550℃，錐孔氣150L/Hr，去溶劑氣900L/Hr，碰撞氣0.14mL/min，氣簾氣138kPa，碰撞氣48kPa。質譜參數見表2。

2.2對照品溶液制備

分別稱取人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd和三七皂苷R1對照品適量，加甲醇，制成濃度為100μg/mL單標對照品貯備溶液。分別精密量取各皂苷單標對照品貯備溶液適量，用甲醇稀釋制成濃度為5μg/mL混合對照品貯備溶液。

2.3供試品溶液制備

取樣品適量，加甲醇溶解，定容，取續濾液即得。

2.4方法學驗證

2.4.1線性和定量限

采用逐級稀釋法用甲醇制備標示濃度分別為5000、2500、1250、625、250、125及62.5ng/mL混合對照品溶液。每個樣品進樣1次，記錄對應峰面積，以對照品溶液濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算R2值。

采用逐級稀釋法用甲醇稀釋混合對照品溶液，以信噪比為10皂苷成分濃度為定量限。

2.4.2重復性和準確度

取樣品溶液適量，制備1/2平均含量水平溶液，添加混合對照品溶液，制備含量水平達70%、100%及130%水平的供試品溶液，每個濃度平行制備6份，測定1/2平均含量水平溶液2份，以標準曲線法計算各成分含量，計算回收率和相對標準偏差（RSD）。

2.4.3精密度

取625ng/mL混合對照品溶液，連續進樣6次，計算進樣精密度。

2.5 樣品測定

按2.3項下方法制備供試品溶液，在2.1分析方法下依法測定，計算待測成分含量。

3 結果

3.1線性和定量限

LC-MS/MS法測定血栓通注射液中5種皂苷成分的回歸方程、相關系數及定量限見表3。可見，人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd和三七皂苷R1線性關系良好，R2>0.999，定量限在0.34～1.45ng/mL。

3.2重復性、準確度和精密度

血栓通注射液中5種皂苷成分重復性、準確度和精密度具體參見表4，其中5種皂苷成分低、中、高3種濃度的加樣回收率范圍為90.59%～104.10%，表明該測定方法準確度良好，且5種皂苷成分3種濃度水平測試的RSD為1.27%～4.29%，表明方法重復性良好。

精密度測定結果表明，5種皂苷成分峰面積的RSD為1.80%～2.64%，說明該方法精密度良好。

3.3樣品測定結果

采用建立方法測定市面上的6批血栓通注射液皂苷成分的含量，結果見表5。結果顯示，五種皂苷成分的含量測定差異跨度不大，不同廠家不同批次血栓通注射液生產工藝成熟穩定。

4 討論

本研究分別將五種皂苷成分的單標對照品貯備溶液直接注入質譜，結果發現，5種皂苷成分在負離子模式下離子信息豐富，離子豐度較大，故選用負離子掃描方式。

LC-MS/MS將采用不同分離原理的色譜分離與質譜分離相結合，實現物質的定量分析[5]。本研究中人參皂苷Re、人參皂苷Rd屬于同分異構體，質譜裂解碎片完全一致，不能單獨依靠質譜的碎片信息實現分離，需采用色譜分離和質譜檢測聯合方式。色譜分離條件摸索過程中，選用不同色譜柱對5種皂苷成分進行分析，結果發現，Waters BEH C18（2.1mm*100mm，1.8μm）色譜柱通過改變梯度洗脫程序可實現人參皂苷Re、人參皂苷Rd分離基線分離完成定量分析。

綜上所述，本文成功建立了LC-MS/MS法同時測定血栓通注射液中人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、人參皂苷Rd和三七皂苷R1含量測定方法，方法靈敏度高、準確度好，且通過不同廠家不同批次檢測分析發現，血栓通注射劑5種皂苷成分含量差異不大，生產工藝相對穩定。

參考文獻

[1] 呂曉洲.注射用血塞通和血栓通膠囊序貫治療腦梗死恢復期瘀血阻滯證的臨床研究[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2021，19（13）： 2258-2261.

[2] 宋艷剛，劉學華，李波.血栓通注射液指紋圖譜及多成分定量的快檢研究[J].廣東藥學院學報，2014（6）：722-725

[3] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典一部[M].北京：中國醫藥科技出版社，2020.

[4] 李婷，張珂，李軍，等.基于液相色譜-多級多反應監測模式（LC-MRM）的高靈敏定量分析新策略[J].中國藥科大學學報，2023，54（6）：718-728.

[5] 牛江濤，曹瑞，司昕蕾，等.LC-MS技術在天然產物黃酮類成分分析中的應用[J].中國現代中藥，2020，22（9）：1576-1579.