酶抑制法在蔬菜農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)中的應(yīng)用

隨著人們生活水平的提升，人們?cè)絹碓阶⒅厥称钒踩珕栴}，蔬菜農(nóng)藥超標(biāo)會(huì)危害人們的身體健康，相關(guān)部門應(yīng)加強(qiáng)蔬菜的農(nóng)殘檢測(cè)和監(jiān)管，酶抑制法是一種農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)方法，其檢測(cè)操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)成本低、后續(xù)維護(hù)成本低，不要求檢測(cè)人員有較高的技術(shù)水平，廣泛應(yīng)用于基層日常蔬菜質(zhì)量安全檢測(cè)工作，是保證蔬菜產(chǎn)品安全重要措施之一。

1 農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)的必要性

蔬菜種植、運(yùn)輸和存儲(chǔ)過程中會(huì)使用除草劑、殺蟲劑、殺菌劑、保鮮劑等，促進(jìn)蔬菜增產(chǎn)，提升種植戶經(jīng)濟(jì)效益，隨著全球變暖、蔬菜種植面積擴(kuò)大和連作等現(xiàn)象的出現(xiàn)，病蟲害發(fā)生頻率和危害強(qiáng)度增大，農(nóng)藥的施用量逐年增多，這種惡性循環(huán)嚴(yán)重破壞生態(tài)環(huán)境。蔬菜是人們生活的必需品，但長期使用大量農(nóng)藥會(huì)使其在蔬菜上殘留，蔬菜中的農(nóng)殘超標(biāo)會(huì)危害消費(fèi)者的身體健康，甚至導(dǎo)致中毒死亡，蔬菜上農(nóng)殘超標(biāo)還會(huì)降低蔬菜的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，在蔬菜流通過程中進(jìn)行農(nóng)藥殘留量的快速檢測(cè)是控制蔬菜農(nóng)殘量和保障蔬菜食品安全的重要措施。

2 農(nóng)藥殘留主要的檢測(cè)方法

目前，我國檢測(cè)農(nóng)藥殘留的主要方法是色譜法、免疫法和酶抑制法等，蔬菜產(chǎn)品的農(nóng)殘檢測(cè)方法主要是色譜法和酶抑制法，色譜法準(zhǔn)確性高、靈敏度高，可以對(duì)農(nóng)藥殘留進(jìn)行精確的定量分析，但檢測(cè)需要專業(yè)儀器，成本較高，檢測(cè)時(shí)間較長，要求檢測(cè)人員技術(shù)水平較高，可以為農(nóng)藥殘留執(zhí)法提供依據(jù)，適合大型實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)分析，但不適用于基層使用。酶抑制法檢測(cè)操作簡(jiǎn)單，對(duì)檢測(cè)人員操作水平要求低，成本低，檢測(cè)時(shí)間短，可以現(xiàn)場(chǎng)出結(jié)果，適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和大批量檢測(cè)，是我國控制高毒農(nóng)藥殘留的快速篩選監(jiān)測(cè)方法，酶抑制法檢測(cè)速度快，可以對(duì)濫用農(nóng)藥的不法商販產(chǎn)生較大的威懾，減少違法行為，廣泛應(yīng)用于各種市場(chǎng)蔬菜農(nóng)殘檢測(cè)，酶抑制法只能做農(nóng)殘定性分析，主要用于避免農(nóng)殘嚴(yán)重超標(biāo)的蔬菜流入市場(chǎng)。

3 酶抑制法原理

有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥可以抑制昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)中乙酰膽堿酯酶活性，酶抑制法可以檢測(cè)樣品對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制程度，以此來確定樣品中是否含有有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥，在酶反應(yīng)液中加入底物和顯色劑，觀察顏色變化可以判斷是否存在有機(jī)磷類或氨基甲酸酯類農(nóng)藥，樣品中有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留會(huì)抑制酶活性，酶不會(huì)參與分解反應(yīng)，沒有水解產(chǎn)物與顯色劑發(fā)生反應(yīng)，不顯色；若樣品中沒有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類農(nóng)殘，乙酰膽堿酯酶有活性，有水解產(chǎn)物與顯色劑發(fā)生的反應(yīng)，出現(xiàn)顏色變化，若使用分光光度計(jì)測(cè)定吸光值，可以判斷農(nóng)藥殘留量，從而判斷樣品蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥是否超標(biāo)。酶抑制法可檢測(cè)葉菜、果菜、豆菜、瓜菜等蔬菜中的農(nóng)殘，可檢測(cè)出毒死蜱、敵敵畏、甲胺磷、對(duì)硫磷、氧化樂果等有機(jī)磷類農(nóng)藥，以及抗蚜威、西維因、葉蟬散等氨基甲酸酯類農(nóng)藥。

4 酶抑制法缺點(diǎn)

酶試劑需要低溫保存，在實(shí)際的應(yīng)用過程中，如果保存不當(dāng)可能會(huì)使酶失活，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性低，重復(fù)性差。酶抑制法僅能檢測(cè)出蔬菜樣品中是否有有機(jī)磷和氨基甲酸酯兩類農(nóng)藥，不能檢測(cè)出是否有有機(jī)氯類、菊酯等農(nóng)藥，存在檢測(cè)盲區(qū)。酶抑制法在檢測(cè)番茄香菜、蘿卜、蘑菇、韭菜、蔥、蒜等蔬菜會(huì)出現(xiàn)假陽性，這些蔬菜含有對(duì)酶有影響的葉綠素、花青素、氧化酶等次生物質(zhì)，對(duì)酶抑制率的檢測(cè)結(jié)果有影響，酶抑制法易發(fā)生誤判。樣品蔬菜中含有較多的胡蘿卜素、葉綠素等色素會(huì)導(dǎo)致光的透過率低，加入底物后會(huì)影響比對(duì)顏色變化，還會(huì)影響分光光度計(jì)的吸光度測(cè)量結(jié)果，檢測(cè)結(jié)果可靠性低。檢測(cè)人員需要進(jìn)行專門的培訓(xùn)，才能減少各種干擾，正確判斷檢測(cè)結(jié)果是否可用。

5 酶抑制法農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)

5.1 應(yīng)用合適的酶源

乙酰膽堿酯酶存在于動(dòng)物和植物組織中，植物酶源主要是用小麥面粉作為酶標(biāo)記物制成的酶片，動(dòng)物酶源來源廣泛，常用的動(dòng)物酶源主要是人血清、人血漿、蠅或蜜蜂腦酯、家畜的肝臟和血液等，其中家蠅頭部乙酰膽堿酯酶經(jīng)試驗(yàn)證明，使用效果最佳，經(jīng)分離純化后作為酶抑制法的酶源敏感性強(qiáng)、可靠性高。兩種酶法的反應(yīng)不同，生成物不同，顯色反應(yīng)呈現(xiàn)不同的顏色，動(dòng)物膽堿酯酶法進(jìn)行顯色反應(yīng)后呈黃色，植物酯酶法進(jìn)行顯色反應(yīng)后呈紫紅色。

5.2 檢測(cè)的設(shè)備

酶抑制法主要使用分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，此外還需要電子天平、蒸餾水機(jī)、移液器、微型樣品混合器、培養(yǎng)箱和配套的玻璃容器等，最重要的是底物和顯色劑，試劑應(yīng)正確存儲(chǔ)在適宜條件下，避免變性，試劑配置時(shí)要注意濃度，避免酶失活影響檢測(cè)結(jié)果，使用蒸餾水配置試劑，水中雜質(zhì)會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，酶、底物和顯色劑溶解后若長時(shí)間不使用，應(yīng)貯存在冰箱的冷凍室內(nèi)，要分裝存儲(chǔ)，用時(shí)解凍，不可反復(fù)解凍避免失效，未配置的底物和顯色劑的試劑放置于冷藏層保存，未配置的酶置于冷凍層保存，配置好的試劑要存儲(chǔ)于冰箱冷藏，在一周內(nèi)完成全部使用。

5.3 檢測(cè)步驟

采集蔬菜樣品，若蔬菜上有泥土或水，需要使用毛巾或?yàn)V紙將其擦干凈，不可使用水沖洗，稱取適量樣品碾碎至檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，樣品稱取時(shí)使用稱量紙或稱量容器，不可直接放于稱量盤上，將樣品放在有緩沖液的玻璃容器中并將其振蕩一定時(shí)間后過濾出提取液，靜置幾分鐘，在小試管中加入酶、顯色劑和提取液，在培養(yǎng)箱中放置半小時(shí)，加入底物混勻后立即倒入比色皿中，在412納米的波長下進(jìn)行吸光度測(cè)定。還需設(shè)置空白對(duì)照，使用緩沖液代替樣本提取液進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)的環(huán)境溫度、濕度、酶的活性和濃度、底物的濃度、pH值、反應(yīng)溫度都會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，環(huán)境溫度最好保持在20℃～25℃，保障酶活性，酶的種類較多，且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不同酶的最佳保溫時(shí)間和pH值不同，應(yīng)根據(jù)酶的種類控制反應(yīng)溫度。

5.4 結(jié)果判定

蔬菜農(nóng)殘檢測(cè)的抑制率范圍為-10％～110％，抑制率超出此范圍表明檢測(cè)過程出現(xiàn)錯(cuò)誤，需重新檢測(cè)。樣本檢測(cè)到的抑制率在40%以下為安全蔬菜；抑制率在40%～50%為較安全蔬菜；抑制率超出50%應(yīng)重復(fù)檢測(cè)一次來確定結(jié)果，抑制率在50%～70%表示蔬菜農(nóng)藥殘留的超標(biāo)，該蔬菜存在安全隱患；若抑制率高于70%則表示蔬菜不安全。

5.5 注意事項(xiàng)

由于蔬菜本身可能會(huì)導(dǎo)致假陽性，應(yīng)根據(jù)《果蔬農(nóng)藥殘留比對(duì)數(shù)據(jù)庫》明確酶抑制法的檢測(cè)盲區(qū)，有效避免結(jié)果假陽性，檢測(cè)平臺(tái)系統(tǒng)可以自動(dòng)校準(zhǔn)吸收光譜，保障結(jié)果的可靠性。