佛羅里達文昌魚哈氏窩組織在性腺發育不同時期的形態結構變化

摘 要：哈氏窩是文昌魚生殖內分泌調控軸重要組成部分，為了進一步揭示文昌哈氏窩形態特征與性腺發育的關系，豐富文昌魚的生物學基礎信息，利用組織學切片及HE染色技術觀察了佛羅里達文昌魚在性腺發育不同時期哈氏窩形態變化。結果表明：佛羅里達文昌魚在性腺剛出現及早期時，哈氏窩位于文昌魚哈氏窩位于脊索附近，有一層薄膜相隔，呈近似對稱的倒“凹”狀；在性腺發育和成熟時期，哈氏窩頂部增厚，胞質清晰，兩側向窩內增大，窩內空隙變小，形狀呈現矮寬；在性腺排空及退化時期，哈氏窩兩側呈細長狀，窩內空間狹窄。

關鍵詞：佛羅里達文昌魚；哈氏窩；石蠟切片；組織學觀察

中圖分類號：Q954.6 文獻標志碼：A 文章編號：0253?2301（2024）07?0017?04

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.07.003

Morphological and Structural Changes of Hatschek's Pit Tissue in Branchio-stoma floridae atDifferent Stages of Gonadal Development

CENWan，WURui-qiong，YANGLi-cheng，HUANGZhen

（1.College of Life Sciences， Fujian Normal University， Fuzhou， Fujian 350117， China;2.Innovation and Transformation Center， Fujian University of Traditional Chinese Medicine，Fuzhou， Fujian 350108， China）

Abstract： Thehatschek'spitisanimportantcomponentof thereproductiveendocrineregulationaxisinAmphioxus.Inordertofurtherrevealtherelationshipbetweenthemorphologicalcharacteristicsofhatschek'spitandgonadaldevelopmentofAmphioxus，andenrichthebiologicalbasicinformationofAmphioxus，themorphologicalchangesofhatschek'spitatdifferentstagesofgonadaldevelopmentofBranchio-stoma floridae wereobservedbyusingthehistologicalsectionandHEstainingtechnique.TheresultsshowedthatwhenthegonadsofBranchio-stoma floridaeappearedatthebeginningandearlystageofdevelopment，thehatschek'spitwaslocatednearthenotochordofAmphioxus，withathinfilmseparatingit，forminganapproximatelysymmetricalinverted"concave"shape.Duringthedevelopmentandmatureperiodofgonads，thehatschek'spithadathickenedtop，clearcytoplasm，enlargedonbothsidestowardsthepit，smallergapswithinthepit，andashorterandwidershape.Duringtheperiodofgonadalemptyinganddegeneration，thetwosidesofthehatschek'spitwereslenderandthespaceinsidethepitwasnarrow.

Key words： Branchio-stoma floridae；Hatschek'spit；Paraffinsectioning；Histologicalobservation

文昌魚Amphioxus屬于脊索動物門、頭索動物亞門、頭索綱，是無脊椎動物與脊椎動物的中間態，有著脊索動物的三大特征：有鰓裂、神經管和脊索，可以提供有關脊椎動物起源和演化的重要線索[1]。常見的文昌魚有佛羅里達文昌魚Branchio-stoma floridae、白氏文昌魚Branchiostoma belcheri、日本文昌魚Branchiostoma. japonicum等。目前佛羅里達文昌魚的基因組已經被發表，結果顯示文昌魚的基因組演化速率相對較慢，其保留了與現代脊椎動物相似的身體結構[2]。

文昌魚的哈氏窩（Hatschek'spit）屬于輪器的一部分，起源于內胚層或外胚層，位于口腔頂部，是個凹坑結構[3]。哈氏窩因在文昌魚的攝食機制中發揮作用[4]而引起了特別的關注，因為它與被囊動物和脊椎動物的多種結構同源，目前認為它對應于脊椎動物的垂體。Drach[5]也提到了哈氏窩和環口動物垂體管之間的特殊同源性關系。我國科學家發現了文昌魚存在原始的生殖內分泌調控軸、腦-哈氏窩-性腺軸，與脊椎動物腦（下丘腦）-腦垂體-性腺軸相似，該軸調節文昌魚性腺發育成熟及其生殖活動[6?8]。因此，剖析文昌魚哈氏窩的發育特征為探索器官的生理功能和演化歷程提供了的線索，具備一定的研究價值。本研究通過組織學切片的技術手段觀察不同發育時期的哈氏窩形態，為佛羅里達文昌魚發育生物學和哈氏窩結構的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1試驗材料

試驗中佛羅里達文昌魚Branchiostoma floridae是實驗室科研引進后人工飼養繁育的子三代。收集性腺發育早期（性腺剛開始、性腺分化早期）、發育中期（性腺發育中、性腺成熟）、發育后期（性腺排空、性腺退化完整）的文昌魚。

1.2哈氏窩組織切片制備

整只文昌魚置于質量分數4%的PFA（多聚甲醛）溶液中，4℃條件下固定24h。固定完成后，將樣品置于體積分數為30%、50%、70%、90%和100%酒精中進行梯度脫水，充分脫水后的組織經二甲苯透明和石蠟包埋，制備成為蠟塊，之后進行石蠟切片，切片厚度為8μm。

1.3蘇木精-伊紅染色（H.E染色）

將石蠟組織切片置于烘箱（60℃）中烘烤30min，經二甲苯、酒精梯度脫蠟和復水，隨后用蘇木精-伊紅染色，再次梯度脫水后用中性樹脂封片。

1.4顯微觀察

待樹脂干后通過顯微鏡（ZeissAxioZoom.V16）進行觀察，運用軟件ZEN2Pro進行圖像采集。

2 結果與分析

2.1佛羅里達文昌魚性腺發育初期的哈氏窩形態

在性腺剛出現的文昌魚中，通過解剖，在脊索中線側下方能觀察到倒“凹”型的哈氏窩組織。左右近似對稱，哈氏窩頂部與脊索以一層薄膜相連，僅有薄薄的上皮構成哈氏窩初型，其窩內空隙大。通過HE染色觀察發現，哈氏窩的細胞核呈圓形（圖1a、1a′）。當文昌魚發育至性腺早期時，哈氏窩頂部體積增大，兩側逐漸成形，以細長狀為主向窩內突起，并且在靠近哈氏窩底部開始出現細小纖毛，具有致密細胞核，核與核間堆疊，核數目增多，胞質較少（圖1b、1b′）。

2.2佛羅里達文昌魚性腺發育中期的哈氏窩形態

在佛羅里達文昌魚性腺逐漸成熟的過程中，通過取樣觀察可以看到，哈氏窩頂部組織繼續增厚，細胞核由圓形轉變為細長形，且排列緊密，胞質清晰，兩側向窩內增大，窩內空隙變小（圖2a、2a′）。至性腺發育成熟時，哈氏窩頂部沒有明顯改變，兩側向哈氏窩頂部回縮，不再向窩底部方向增大，形狀呈現矮寬，但繼續向窩內增厚，纖毛變長并排列有序（圖2b、2b′）。

2.3佛羅里達文昌魚性腺發育晚期的哈氏窩形態

當佛羅里達文昌魚處于性腺排空時期，可以在切片中觀察到哈氏窩兩側逐漸變回細長狀，仍有纖毛存在，窩內變得狹窄（圖3a、3a′）。當性腺退化后，哈氏窩細胞核排列緊密，形態幾乎與性腺排空時期相差不大，僅有窩內空間增大（圖3b、3b′）。

3 討論與結論

在文昌魚哈氏窩的相關研究中，通常把哈氏窩的凹槽作為識別標志。在本研究中同樣顯現了凹槽的哈氏窩，并從組織學上對不同性腺發育時期的佛羅里達文昌魚哈氏窩發育規律進行了探索。結果表明文昌魚哈氏窩位于脊索附近，有1層薄膜相隔，呈近似對稱的倒“凹”狀。在性腺不斷發育過程中，哈氏窩兩側逐漸增厚，由細長型轉為矮寬型，體積不斷向窩內變大，于后期再次轉為細長型且體積縮小，哈氏窩頂部變化不大。同樣地，Gorbman[9]等發現只有1層薄薄的透明基底膜狀將哈氏窩與相鄰的組織分開，并且凹槽結構雖不完全對稱，但僅有些許差距。而哈氏窩的窩內空隙，因哈氏窩兩側體積變化而變化，當哈氏窩兩側體積增大后，窩內空隙就變小，反之，空隙變大。另外哈氏窩具有致密的細胞核，并且核的數目隨著發育進行而增多，直至發育成熟后便不再增多，核形狀也由最初的圓形至中期開始轉為細長形。文昌魚哈氏窩是由3種類型的細胞所組成，分別為：位于頂部的上皮細胞、位于中間的不規則細胞以及位于底部（近口腔）的纖毛黏液細胞[10]。而在本研究中，也發現了纖毛的存在，纖毛不斷變長并有序排列。

文昌魚的生殖內分泌調控系統（腦泡-哈氏窩-性腺）能夠調控性腺發育、成熟及生殖活動等[11]。佛羅里達文昌魚哈氏窩發育變化可能與水溫有關，哈氏窩位于口腔頂部，與水流相通，對于水溫敏感，接受到刺激后，傳入神經刺激端腦中類似GnRH系統，緊接著該神經元發出纖維到達哈氏窩，促使哈氏窩逐漸發育合成多種脊椎動物腺垂體激素[12]，調控文昌魚的性腺發育。本試驗對佛羅里達文昌魚哈氏窩發育進行了初步探究，為佛羅里達文昌魚哈氏窩發育的后續研究奠定了基礎。

參考文獻：

[1]方永強.文昌魚哈氏窩結構與功能研究進展［J］.生物學通報，2002，37（6）：4?5.

[ 2] BI C， LU N， HUANG Z， et al. Whole-genome resequencing revealsthepleistocenetemporaldynamicsofBranchiostomabelcheri and Branchiostoma floridae populations［ J］ . Ecology and Evolution，2020，10（15）：1?15.

[ 3] 方永強，翁幼竹，胡曉霞.文昌魚內柱結構與功能及其神經內分 泌調節［J］.自然科學進展，2002（10）：1090?1093.

[ 4] HATSCHEK B. Mitteilungen fiber Amphioxus［ J］ . Zool Anz， 1884，7：86?127.

[ 5] DRACH P. Embranchcment des Cephaloeordes［ J］ . Traite de Zoologic，1948（11）：65?70.

[ 6] 方永強.文昌魚生殖內分泌生理學研究進展［J］.生物學通報， 1995，30（4）：4?5.

[ 7] 方永強，翁幼竹.文昌魚幼蟲變態的內分泌調節研究進展［J］. 應用海洋學學報，2015，34（3）：100?103.

[ 8] TJOY L， WELSCH U. Electron microscopical obse-rvations on Kolliker'sandHatschek'spitonthewheelorganintheheadregionof amphioxus（ Branchiostomalanceolatum）［ J］ . Cell T issue Res， 1974，153：175?187.

[ 9] GORBMANA，NOZAKIM，KUBOKAWAK.ABrain-Hatschek's Pit Connection in Amphioxus［ J］ . General & Comparative Endocrinology，1999，113（2）：251?253.

[ 10] 方永強，齊襄.文昌魚哈氏窩上皮細胞超微結構的研究［J］.中 國科學：B 輯，1989（6）：592?595.

[ 11] 方永強.文昌魚在生殖內分泌進化中的地位［J］.科學通報， 1998，43（3）：225?232.

[ 12] 翁幼竹，劉志剛，方永強，等.水溫對文昌魚生殖活動的影響及 其內分泌機制［J］.海洋學報，2012，34（4）：9?11.

（責任編輯：柯文輝）