基于線粒體 12S基因分析福建省棘胸蛙不同地理種群遺傳多樣性

摘 要：棘胸蛙Quasipaa spinosa為福建省特色分布的大型蛙類，被列入三有保護動物之列，開發新的辨別福建省內棘胸蛙不同地理種群的快速方法對于該物種的保護極為重要。通過選取福建省內14個地區的野生棘胸蛙樣本，提取其DNA并通過PCR擴增出線粒體12SrRNA基因，然后進行一代測序，基于獲得的12SrRNA基因序列構建了進化樹。結果表明：福建省內的棘胸蛙可以分成兩大類種群，武夷山、建陽、順昌、將樂、明溪、永安、華安、德化和新羅聚為一類（西部群體），武夷山、政和、屏南、寧德、福鼎、永泰、德化、新羅和福安聚為另一類（東部群體），其中，武夷山、德化、新羅在兩個大類均有分布。為了更快地基于12SrRNA基因區分兩個群體，篩選了這兩大類種群的12SrRNA基因的SNP位點，并利用競爭性等位基因特異性PCR（KASP，KompetitiveAllele-SpecificPCR）方法，開發了一種針對這兩個群體的特異性SNP快速分型方法，結果顯示所開發的KASP檢測體系能準確區分福建省野生棘胸蛙的兩個支系。該結果可為深入了解福建省內棘胸蛙的種群分化、有效鑒別不同地理種群，以及為種質資源保護和育種工作提供科學依據。

關鍵詞：棘胸蛙；分子標記；SNP位點；KASP技術

中圖分類號：S966.3 文獻標志碼：A 文章編號：0253?2301（2024）07?0010?07

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.07.002

Analysis on Genetic Aiversity of Different Geographical Populations of Quasipaa spinosa in Fujian

Province Based on the Mitochondrial 12S Gene

WURui-qiong，ZHANGXue-ping，YANGLi-cheng，CHENYou-ling，HUANGZhen（College of Life Sciences， FujianiKq2cmobzTOlEtZSUODJlnjfDnOn02Na5QCIRysQ29Q= Normal University ， Fuzhou， Fujian 350117， China）

Abstract： Quasipaa spinosaisalarge-scalefrogspecieswithauniquedistributioninFujianProvinceandislistedasaprotectedspeciesunderthe“ ThreeProtectedCategories” .ThedevelopmentofnewrapidmethodstoidentifydifferentgeographicalpopulationsofQuasipaa spinosainFujianProvinceisextremelyimportantfortheprotectionofthisspecies.Inthisstudy，theDNAwasextractedfromthewildQuasipaa spinosasamplescollectedfrom14regionsinFujianProvince，andthemitochondrial12SrRNAgenewasamplifiedbyusingPCR.Then，thefirst-generationsequencingwasconducted.Theevolutionarytreewasconstructedbasedontheobtained12SrRNAgenesequence.TheresultsshowedthatQuasipaaspinosainFujianProvincecouldbedividedintotwomajorpopulations：Wuyishan，Jianyang，Shunchang，Jiangle，Mingxi，Yong'an，Hua'an，DehuaandXinluowereclusteredintoonegroup（thewesternpopulation）.Wuyishan，Zhenghe，Pingnan，Ningde，Fuding，Yongtai，Dehua，XinluoandFu'anwereclusteredintoanothergroup（theeasternpopulation）.?pq99zM26SE0sTay+mSwoR125iOnilgSY9YSH3JpVr2Y=;Amongthem，Wuyishan，DehuaandXinluoweredistributedinbothmajorcategories.Inordertodistinguishthetwopopulationsbasedonthe12SrRNAgenemorequickly，theSNPlociofthe12SrRNAgeneinthetwomajorpopulationswerescreened.AndarapidspecificSNPgenotypingmethodforthesetwopopulationswasdevelopedbasedonthecompetitiveallele-specificPCR（KASP，KompetitiveAllele-SpecificPCR）method.TheresultsshowedthatthedevelopedKASPdetectionsystemcouldaccuratelydistinguishthetwolineagesofwildQuasipaa spinosainFujianProvince.Theresultscouldprovideascientificbasisforthein-depthunderstandingofthepopulationdifferentiationofQuasipaa spinosainFujianProvince，andtheeffectiveidentificationofdifferentgeographicalpopulations，aswellastheprotectionandbreedingofgermplasmresources.

Key words： Quasipaa spinosa；MolecularMarkers；SNPloci；KASPtechnology

棘胸蛙Quasipaa spinosa屬兩棲綱Amphibia無尾目Anura叉舌蛙科Dicroglossidae棘胸蛙屬Quasipaa，是我國南方地區特色的食藥用蛙類。近年來，隨著生態環境的惡化，棘胸蛙的棲息地遭受破壞[1]，以及人為的濫捕現象加劇，這些因素共同導致福建省內部分地區的野生棘胸蛙資源受到嚴重破壞，種群數量日趨減少[2]。針對這一現象，如何有效監測省內的野生棘胸蛙的種質資源遺傳多樣性，并開展種質資源保護，成為當前亟待解決的一大問題。棘胸蛙屬于兩棲類，其擴散能力有限，容易受歷史地質、氣候事件等因素的影響，而產生遺傳上的譜系地理分歧演化。國內許多學者開展過棘胸蛙的遺傳譜系地理分化的研究[3]，發現其種群存在支系分布現象，且不同支系間存在顯著的遺傳分化。目前，從全國范圍來分析，國內分布的棘胸蛙存在3個支系，一支分布于中國東南部：浙江、安徽及福建部分地區；一支分布于中國中南部：湖南、江西、廣東、廣西及福建部分地區；一支分布于中國西南部：云南[3?6]。然而，目前關于福建省內野生棘胸蛙不同地理種群支系的遺傳多樣性報道較少，這在一定程度上阻礙了野生棘胸蛙保護工作的開展。因此，如何快速、準確地對福建省內的棘胸蛙地理種群支系進行判斷，對于福建省棘胸蛙資源的保護具有重要的現實意義。

線粒體是真核生物細胞核外的一種半自主細胞器，是細胞進行有氧呼吸的主要場所，是動物體內唯一的核外遺傳信息載體，具有分子量小、嚴格母系遺傳、結構簡單等特點，已被廣泛用于研究物種的遺傳多樣性和群體間遺傳結構的差異[7]。其中，線粒體12SrRNA基因是無尾兩棲動物在遺傳多樣性研究中應用較多的分子標記。單核苷酸多態性（SingleNucleotidePolymorphism，SNP），是指基因組水平上由單核苷酸變異引起的序列多態性。基因組中在同一位置發生相同堿基突變的概率極低，因此SNP具有遺傳穩定、數量極大、特異性強、便于批量檢測等優點，被廣泛用作主流的分子標記[8?9]，并在遺傳疾病診斷[10?11]、分子遺傳學[12]以及動植物育種[12?14]中發揮著重要作用。本研究基于線粒體12SrRNA基因數據，分析了福建省野生棘胸蛙不同地理種群的遺傳多樣性，并根據不同支系的棘胸蛙在12SrRNA基因上的SNP差異，開發了競爭性等位基因特異性PCR（KompetitiveAlleleSpecificPCR，KASP）的分型方法，這有助于解析福建省內野生棘胸蛙不同種群間的遺傳差異，也有助于建立棘胸蛙的遺傳資源庫，為未來的遺傳育種、種質資源保護以及可持續利用提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1野生棘胸蛙的來源

本研究所用的野生棘胸蛙樣本采集自福建省15個地區：武夷山市、建陽區、順昌縣、將樂縣、明溪縣、永安市、華安縣、德化縣、新羅區、政和縣、屏南縣、寧德市、福鼎市、永泰縣、福安市。均取野生棘胸蛙的大腿內側肌肉組織，用于DNA抽提。

1.2野生棘胸蛙DNA提取

剪取棘胸蛙大腿內側肌肉組織，取適量的肌肉組織于EP管中，加入蛋白酶K，用渦旋振蕩儀將其混勻。按照Quick-DNATMMiniprepPlusKit試劑盒（ZYMORESEARCH）說明書的步驟，提取棘胸蛙的DNA。提取好的DNA保存在?80℃冰箱中。

1.3棘胸蛙線粒體12SrRNA基因的PCR引物設計及反應體系

用于擴增棘胸蛙線粒體12srRNA基因的PCR引物序列見表1。PCR反應體系（20μL）組成：2×AccurateTaqMasterMix（艾科瑞生物有限公司）10μL，上下游引物各0.2μL，DNA模版1μL，ddH2O8.6μL。PCR擴增程序：94℃預變性5min；94℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，循環35次；72℃再延伸7min，4℃冷卻保存。PCR擴增所得產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，剩余PCR產物送往鉑尚生物技術（上海）有限公司進行測序。

1.4線粒體12srRNA基因序列數據分析

PCR產物的測序序列全部通過NCBI官網進行同源性比對，從而確定所得的序列為棘胸蛙的線粒體12SrRNA基因序列。采用MEGA7.0軟件對所采集的棘胸蛙線粒體12srRNA基因序列構建系統發生樹，參數設置為鄰接法（Neighborjoining，NJ），同時用自展檢驗法（BootstrapTest）獲得系統進化樹各分支的置信值，重復抽樣1000次。構建進化樹時以脆皮大頭蛙Limnonectes fragilis和斑腿樹蛙Polypedates megacephalus作為外群。

1.5KASP反應體系及擴增程序

采用ClusterW軟件分析野生棘胸蛙在福建省內兩大地理種群分支的線粒體12SrRNA基因序列，通過序列比對，找到兩個地理種群分支中獨有的SNP位點。進一步基于DNAMAN軟件和引物設計軟件Primer3針對SNP位點設計KASP特異性引物（見表2），引物設計完成后經鉑尚生物技術（上海）有限公司合成。KASP引物混合體系的配置：12SrRNA-F1（100μmol·L?1）12μL，12SrRNA-F2（100μmol·L?1）12μL，12SrRNA-R（100μmol·L）30μL，ddH2O46μL，混合均勻。KASP反應體系（10μL）：HiGeno2×ProbeMix（北京嘉程生物科技有限公司）5μL，KASP引物0.14μL，DNA模板1μL，ddH2O4μL。AQPTM基因分型系統的PCR擴增程序：95℃預變性10min；95℃變性20s，61℃退火40s，循環35次，每循環1次，溫度降0.6℃；95℃變性20s，55℃退火/延伸40s，循環45次；4℃冷卻保存。PCR擴增循環結束后，采用TaqManGenotyperSoftware對AQPTM基因分型數據進行分析。

2 結果與分析

2.1棘胸蛙樣本的DNA提取結果

提取的棘胸蛙基因組DNA，采用1%瓊脂糖凝膠電泳（圖1）檢測，條帶明亮清晰，并且無明顯拖帶現象，可用于后續的基因PCR擴增。

2.2棘胸蛙線粒體12SrRNA基因的擴增

棘胸蛙線粒體12SrRNA基因片段的PCR擴增結果經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，圖譜顯示均獲得明亮清晰的條帶，12SrRNA擴增所獲片段長度為400bp左右，見圖2。

2.3基于線粒體12SrRNA基因序列分析福建省野生棘胸蛙的種群分化

以脆皮大頭蛙和斑腿樹蛙的線粒體12SrRNA基因對應序列為外群，對所篩得的福建野生棘胸蛙單倍型進行聚類分析。結果顯示，以鄰接法構建的系統進化樹（圖3）中，可以將福建省野生棘胸蛙分成兩大支，武夷山（WY）、建陽（JY）、順昌（SC）、將樂（JL）、明溪（MX）、永安（YA）、華安（HA）、德化（DH）和新羅（XL）聚為一支A1，武夷山（WY）、政和（ZH）、屏南（PN）、寧德（ND）、福鼎（FD）、永泰（YT）、德化（DH）、新羅（XL）和福安（FA）聚為一支B1。其中，武夷山、德化、新羅在兩個大支均有分布。

2.4福建省內野生棘胸蛙線粒體12SrRNA基因序列上地區特異SNP篩選

將所有棘胸蛙的線粒體12SrRNA基因測序結果分別進行序列比對，對獲得的分組進行組間序列比較，挑選出每組特有的SNP位點（圖4）。

2.5基于線粒體12SrRNA基因序列上地區特異SNP開發KASP快速分型體系

本研究基于線粒體12SrRNA基因數據分析，在12SrRNA上篩選出1個特異的SNP位點，根據該SNP位點（圖5）設計1對KASP引物。KASP反應測試在ABIStepOnePlus實時熒光定量PCR儀基因分型平臺上進行，KASP基因分型的實驗結果見圖6。圖中綠色為TC基因型，對應于武夷山、建陽、順昌、將樂、明溪、永安、華安、德化和新羅的地理種群；紅色為TT基因型，包括武夷山、政和、屏南、寧德、福鼎、永泰、德化、新羅和福安的地理種群。對KASP標記分型結果進行統計，基因分型結果與基于線粒體12SrRNA基因片段對野生棘胸蛙的聚類結果一致，說明采用所設計的KASP分型引物，能正確區分福建省野生棘胸蛙的兩大支系。對KASP標記分型結果進行統計，與預測結果一致，說明采用本研究所設計的KASP分型引物，能正確區分福建省野生棘胸蛙的兩大支系。

3 討論與結論

Che等[15]利用棘蛙屬的核基因和線粒體基因進行系統發生樹分析時，提出了一個假設，即棘蛙屬這一物種內部可能隱藏著未被識別的隱種，他們的研究揭示了棘蛙屬在遺傳層面上的復雜性。隨后，路慶芳[4]研究通過對13個棘胸蛙地理種群的線粒體DNA細胞色素b基因562bp序列的測定，發現棘胸蛙可以分為4個不同的支系，這4個支系分別與越南、中國西部、中國中部和中國東部的種群相對應。這些支系之間的地理分布互不重疊，且遺傳距離較大，接近種間分化水平。Zheng等[16]采用了磁珠富集法篩選了15對多態性較高的微衛星引物。這些引物在來自兩個種群的38只棘胸蛙個體中表現出了較高的多態性，顯示出它們在棘胸蛙種群遺傳結構研究中的潛在價值。鄭榮泉[3]利用其中多態性較高的12對微衛星引物，進行了棘胸蛙的遺傳結構分析。結果顯示，棘胸蛙具有較高的遺傳多樣性，進一步證實了棘胸蛙種群的遺傳多樣性。聚類分析和系統發生樹分析的結果與線粒體DNA數據基本一致，均支持棘胸蛙存在4個遺傳分化單元，這些單元嚴格符合進化顯著單元的條件。黃華[17]在測定國內的棘胸蛙及其近緣種的線粒體16SrRNA和12SrRNA基因序列后，也得出了類似的結論。他認為廣泛分布在中國南部的棘胸蛙可能至少包含兩個隱存種。這些隱存種在形成過程中可能從西南向東北方向擴散。這些研究為理解棘胸蛙的遺傳結構、系統發生以及可能的隱種存在提供了寶貴的見解，揭示了這一物種在進化和遺傳上的復雜性。

由于福建省多山，而棘胸蛙屬于兩棲類，其擴散能力有限，容易受歷史地質因素的影響，而產生遺傳上的譜系地理分歧演化。因此，福建省內野生的棘胸蛙種群也可能存在隱存種。本研究通過采集了福建省內多個地區的野生棘胸蛙樣本，進行了遺傳多樣性研究。結果顯示，基于棘胸蛙的12SrRNA基因片段所構建的NJ系統發生樹可以把福建省野生棘胸蛙種群分為兩大支系：一支包括武夷山、建陽、順昌、將樂、明溪、永安、新羅、德化和華安的地理種群；另一支包括武夷山、政和、新羅、永泰、德化、屏南、福安、寧德和福鼎的地理種群。其中武夷山、德化、新羅樣品在兩個大支系中均有分布。這兩個支系已經在遺傳上產生了分化，因此可能是隱存種。通過對于地區的地貌特征查看，這兩種福建省內野生棘胸蛙的隱存種的分布趨勢可能與山脈形成有關。最后，為了對福建省的野生棘胸蛙進行兩大支系的判斷更加便捷和低成本，本研究基于福建省野生棘胸蛙兩個支系在線粒體12SrRNA基因上的差異位點，開發競爭性等位基因特異性PCR（KASP）的分型方法。研究結果顯示，采用本研究所設計的KASP分型引物，能正確區分福建省野生棘胸蛙的兩個支系。與傳統的PCR擴增測序方法相比，KASP標記利用特異熒光引物，對目標SNP位點進行精準的擴增，通過掃描熒光信號進行基因型分型，不需要進行電泳、照相和讀帶分析，具有便捷、快速的特點。本研究基于KASP所建立的方法具有操作簡單、時間短、成本低的優點，可應用于大規模樣品的檢測。本研究成果有助于解析福建省內野生棘胸蛙不同種群間的遺傳差異，也有助于建立棘胸蛙的遺傳資源庫，為未來的遺傳育種、種質資源保護以及可持續利用提供基礎數據。

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（責任編輯：柯文輝）