雙孢蘑菇褐變過程營養成分和酶活性的變化

摘要 為深入了解雙孢蘑菇采收后在常溫儲存下褐變過程的生理生化變化，本試驗測定了雙孢蘑菇的失重率、褐變度與可溶性糖、蛋白質、丙二醛和脯氨酸含量，以及多酚氧化酶、過氧化物酶、酪氨酸酶和漆酶的活性。結果表明，在常溫儲存條件下，隨著時間的延長，雙孢蘑菇的失重率和褐變程度不斷增加，丙二醛、可溶性糖和脯氨酸含量呈先上升后下降的趨勢，蛋白質含量持續下降。多酚氧化酶和過氧化物酶的活性先上升，達到最高值后下降至初始水平；酪氨酸酶活性整體呈下降趨勢，最后維持低活性狀態；漆酶活性波動較小，并始終維持在低水平狀態。在雙孢蘑菇褐變過程中，隨著水分的不斷流失，滲透調節物質發生波動以應對褐變反應，相關酶活性發生變化，多酚氧化酶和過氧化物酶協同推動褐變進程。

關鍵詞 雙孢蘑菇；褐變；營養成分；多酚氧化酶；過氧化物酶

中圖分類號 TS219 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2024）19-0042-06

DOI號 10.16377/j.cnki.issn1007-7731.2024.19.009

Variations of nutrient composition and enzymes in Agaricus bisporus during the browning process

ZHU Lili1 HE Huaqi2

（1Anhui Shucheng County Agricultural Comprehensive Administrative Law Enforcement Brigade，

Shucheng 231300， China；

2College of Agriculture， Anhui Science and Technology University， Fengyang 233100， China）

Abstract In order to investigate the physiological and biochemical changes of the browning process of Agariculus bisporus after harvesting and storage at room temperature， the weight loss rate， browning degree， soluble sugar， protein， malondialdehyde， and proline contents， as well as the activity of polyphenol oxidase， peroxidase， tyrosinase and laccase of Agariculus bisporus were measured. The results showed that the browning degree and weight loss rate of Agaricum bispora increased with the extension of time， the contents of malondialdehyde， soluble sugar and proline increased first and then decreased， the protein content continued to decrease. The activities of polyphenol oxidase and peroxidase increased first， reached the highest value， and then decreased to the initial level. The activity of tyrosinase decreased and remained low at last. Laccase activity fluctuated little and remained at a low level. In the browning process of Agariculus bisporus， with the continuous loss of water， osmotic regulatory substances fluctuate to cope with the browning reaction， and related enzyme activities change， polyphenol oxidase and peroxidase cooperate to promote the browning process.

Keywords Agaricus bisporus; browning; nutrient composition; polyphenol oxidase; peroxidase

褐變是新鮮水果和蔬菜等在加工或貯藏中受到機械損傷后，物質氧化聚合成褐色色素或黑色素的過程，影響商品的營養價值和品質。按發生機理可將褐變分為非酶促褐變和酶促褐變兩大類[1]。非酶促褐變是指食品加工和貯藏過程中含氮化合物如胺、蛋白質或氨基酸等與還原糖羰基發生復雜的化學反應，生成褐色物質的現象。褐變程度與丙二醛、脯氨酸和可溶性糖含量密切相關。邢楓等[2]研究認為，采收后的組織衰老、冷害、機械損傷和病原微生物污染等逆境脅迫因素也可加速褐變。Adam等[3]研究表明，褐變是酶催化酚類物質形成醌及其聚合物的結果，與酶活性和多酚類物質的氧化密切相關；酶促褐變多發生在牛油果等果蔬[4-5]和食用菌中。催化酶促褐變的酶有酚氧化酶[6]、過氧化物酶等。酚氧化酶是一類含銅離子的末端氧化酶，包括酪氨酸酶、多酚氧化酶和漆酶等，其在褐變過程中發揮著重要作用。

雙孢蘑菇是重要的栽培食用菌之一，其子實體富含蛋白質、多糖和維生素等營養成分[7]。Zhang等[8]研究表明，雙孢蘑菇的保質期3～4 d，子實體在采后貯藏及加工過程中極易褐變，是影響鮮銷的主要原因之一。金曉燕等[9]對香菇子實體褐變機理進行研究，發現采后的子實體隨著貯藏時間的延長，其活躍的后熟過程會引發多種生理生化變化，一些小分子物質和酶的活性發生變化，使菇體組織中的氧化還原平衡遭到破壞。因此，深入了解雙孢蘑菇采收后常溫儲存過程中生理生化變化對認識其褐變機理具有重要意義。

本試驗通過測定雙孢蘑菇子實體在采收后常溫儲存下丙二醛、蛋白質、脯氨酸和可溶性糖等的含量，以及酪氨酸酶、多酚氧化酶、漆酶和過氧化物酶的活性，探討其與褐變的關系，為蘑菇類儲藏保鮮以及抑制加工過程中的褐變提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料處理

新鮮雙孢蘑菇由安徽科技學院食用菌研究所提供。挑選菇體完整、大小均勻、顏色潔白、未開傘、無病蟲害且無機械損傷的子實體，洗凈晾干后裝入塑料筐，用PE保鮮袋套筐但不封口，于常溫下儲存。每隔1 d隨機挑取適量子實體，測量貯藏期間菇體的失重率、褐變度、營養成分含量和酶活性。

1.2 測定指標和方法

1.2.1 失重率計算 測定雙孢蘑菇儲存前后鮮重，失重率計算如式（1）。

失重率（%）=（儲存前鮮重－儲存后鮮重）/儲存前鮮重×100 （1）

1.2.2 褐變度測定 取1 g雙孢蘑菇，加4 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.8，含0.15 mol/L氯化鈉，2.5%聚乙烯吡咯烷酮），冰浴研磨，4 ℃離心5 min，轉速15 000 r/min，取上清液，于450 nm波長處測定吸光度值，該值用以表示褐變度。

1.2.3 可溶性糖含量測定 取1 g雙孢蘑菇，加10 mL蒸餾水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30 min，共2次，提取液過濾合并后定容。采用硫酸蒽酮法[10]測定樣品在630 nm波長處的吸光度值，根據標準曲線擬合的公式計算可溶性糖含量。

1.2.4 蛋白質含量測定 取1 g雙孢蘑菇，加入0.02 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.2）10 mL，充分研磨，靜置片刻后吸取上清液，8 000 r/min離心10 min。采用Bradford法[11]測定595 nm波長處的吸光度值，根據標準曲線擬合的公式計算蛋白質含量。

1.2.5 脯氨酸含量測定 配制系列濃度脯氨酸溶液，分別吸取2 mL系列濃度的脯氨酸溶液、2 mL冰醋酸和2 mL酸性茚三酮溶液混合，沸水浴中加熱30 min，冷卻后測定520 nm處吸光度值，制作標準曲線。稱取1 g雙孢蘑菇，加入3%磺基水楊酸溶液10 mL研磨，在沸水浴中提取10 min，冷卻后過濾，濾液即為脯氨酸提取液。吸取適量提取液按照標準曲線方法測得吸光度值，計算脯氨酸含量。

1.2.6 丙二醛含量測定 取1 g雙孢蘑菇，剪碎后加入10 mL 10%三氯乙酸和少量石英砂，研磨成勻漿，5 000 r/min離心10 min。吸取上清液2 mL（對照為2 mL蒸餾水），加入0.6 %的硫代巴比妥酸溶液2 mL，沸水浴反應15 min，迅速冷卻后離心。取上清液并測定532、600和450 nm波長處的吸光度值，計算如式（2）。

丙二醛含量（μmol/g）=（A532－A600）×6.45－0.56×A450 （2）

1.2.7 多酚氧化酶活性測定 取4 g雙孢蘑菇，加入10 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.8，含2.5 %聚乙烯吡咯烷酮），冰浴研磨，4 ℃下6 000 r/min離心15 min，上清液即為多酚氧化酶粗提取液。0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.8）1.95 mL和0.1 mol/L鄰苯二酚0.5 mL混合后預熱至25 ℃，然后迅速加入酶粗提液50 μL混勻，記錄420 nm波長處吸光度值在3 min內的變化[12]。

1.2.8 過氧化物酶活性測定 取4 g雙孢蘑菇，剪碎后加入10 mL預冷的0.1 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 5.5，含4%聚乙烯吡咯烷酮）和少許石英砂，冰浴研磨，4 ℃下6 000 r/min離心30 min，上清液為過氧化物酶粗提液。25 mmol/L愈創木酚3 mL、0.5 mol/L H2O2溶液200 μL和0.5 mL酶提取液混勻后立即計時，在反應15 s時記錄470 nm處吸光度值作為初始值，每隔30 s記錄1次，連續記錄6 min，以滅活的酶液作為對照[13]。

1.2.9 酪氨酸酶活性測定 取4 g雙孢蘑菇，加入10 mL 預冷的0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.8），冰浴研磨成勻漿，4 ℃下6 000 r/min離心20 min，即為酪氨酸酶粗提液。1 mmol/L L-酪氨酸磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）3.9 mL與0.1 mL酶液迅速混勻，在317 nm處測定吸光度值，連續測定10 min。酶活力單位（U）定義為每分鐘引起吸光度值變化0.1所需的酶量。

1.2.10 漆酶活性測定 取4 g雙孢蘑菇，加入10 mL預冷的0.05 mol/L磷酸緩沖液（pH 6.8），冰浴研磨成勻漿，4 ℃下6 000 r/min離心15 min，上清液即為漆酶粗提液。0.5 mL 3.36 mmol/L鄰聯甲苯胺、3.4 mL 0.1 mol/L醋酸緩沖液（pH 4.6）和0.1 mL酶液混勻，25 ℃反應10 min，測定600 nm波長處的吸光度值。

2 結果與分析

2.1 常溫儲存下雙孢蘑菇失重率變化

水分含量是衡量雙孢蘑菇新鮮程度的重要指標之一。由圖1可知，儲存6 d時，失重率達88.7%，說明雙孢蘑菇采后極易失水。由于雙孢蘑菇只有很薄的外皮保護，常溫（25 ℃）儲存時，失重率呈持續上升趨勢，這可能導致其褐變速度加快。

2.2 常溫儲存下雙孢蘑菇褐變度變化

褐變是雙孢蘑菇采后品質和商品價值降低的主要原因之一，不僅影響產品外觀，而且損害其風味和營養品質。如圖2所示，常溫儲存的前4 d褐變度增加較快，第4天達到1.326，之后褐變速度變慢。在整個儲存過程中，雙孢蘑菇褐變度持續增加。

2.3 常溫儲存下雙孢蘑菇營養成分含量變化

2.3.1 可溶性糖含量變化 可溶性糖是生物體的重要營養物質之一。試驗測定的可溶性糖的標準曲線方程為y=0.014 3x-0.060 0，R2為0.997 1，由此計算得到不同儲存時間的子實體的可溶性糖含量。由圖3可知，雙孢蘑菇常溫儲存期間，可溶性糖含量在前2 d呈上升趨勢，隨后持續下降。

2.3.2 蛋白質含量變化 蛋白質是雙孢蘑菇子實體的重要組成成分之一。試驗測定的蛋白質標準曲線方程為y=0.021 7x-0.017 8，R2為0.991 3，由此計算得到不同儲存時間的子實體蛋白質含量。由圖4可知，在雙孢蘑菇常溫儲存1～6 d，蛋白質含量降低速度較快，說明蛋白質的分解代謝可能較為旺盛；常溫儲存6～8 d，蛋白質含量變化較小。

2.3.3 脯氨酸含量變化 脯氨酸是一種小分子的滲透調節物質，植物在受到逆境脅迫時可能積累高水平的脯氨酸。試驗測定的脯氨酸標準曲線為y=0.038 3x-0.013 7，R2為0.994 6，由此計算得到不同儲存時間的子實體的脯氨酸含量。由圖5可知，在常溫儲存的前4 d，雙孢蘑菇脯氨酸含量持續上升，隨后開始下降。

2.3.4 丙二醛含量變化 丙二醛是細胞膜脂過氧化產物之一，能夠與細胞內各種成分發生化學反應，從而引起酶和膜的損傷。由圖6可知，在常溫儲存前4 d，丙二醛含量呈上升趨勢，這可能與子實體內抗氧化防御系統能力減弱有關，說明膜脂過氧化作用是采后貯藏期間品質劣變的重要原因之一。第4天后，丙二醛含量急劇下降，可能是相關酶被激活，清除了自由基，丙二醛積累減少。

2.4 常溫儲存下雙孢蘑菇酶活性變化

2.4.1 多酚氧化酶和過氧化物酶活性變化 由圖7可知，常溫儲存前期，子實體的多酚氧化酶活性逐漸升高，第5天達到104.509，隨后酶活性開始下降，這可能與褐變組織中底物濃度降低或者褐變產物的積累有關。從整體看，多酚氧化酶的活性相對較高，最后降至初始水平，說明其可能在雙孢蘑菇褐變過程中發揮主要作用。常溫儲存2 d內，過氧化物酶活性增強，可能是逆境脅迫刺激細胞產生過氧化物酶來抵御活性氧的傷害。隨著儲存時間延長，褐變逐漸發生，過氧化物酶活性稍降。說明過氧化物酶持續發揮作用，可能參與雙孢蘑菇漸進的褐變過程。

2.4.2 酪氨酸酶和漆酶活性變化 酪氨酸酶是一種末端氧化酶，與褐變密切相關。由圖8可知，酪氨酸酶活性總體呈下降趨勢，第1～2天活性略有上升，隨后開始緩慢下降，最終降至0.092。整體上看，酪氨酸酶的活性不強，可能不是引起雙孢蘑菇褐變的主要酶。在常溫儲存期間，漆酶活性保持較低水平（0.12～0.16），波動較小。

3 結論與討論

雙孢蘑菇采收后在常溫儲存過程中，由于呼吸作用的不斷增強，其內含物如水、糖和蛋白質等含量會發生較大變化。其失水后不僅影響正常的生理過程，還會造成失鮮、失重和品質下降。石鈺琢等[14]研究發現，失水后雙孢蘑菇子實體內相關氧化酶活性增加，呼吸強度增大，從而加快其褐變速度。因此，降低雙孢蘑菇的采后失水可以提高其保鮮效果，這與張國強等[15]的研究結果一致。可溶性糖是生物體中的重要碳源，也是響應外界脅迫的誘導分子。王霆[16]研究認為，雙孢蘑菇在采收后受干燥空氣的脅迫，為減少水分散失而主動積累可溶性糖進行滲透調節，隨著時間延長，雙孢蘑菇因缺少外界能量的適時補充，呼吸作用持續消耗儲存的可溶性糖為其他代謝提供能量，后期可溶性糖含量隨貯藏時間延長而降低，本試驗結果與此一致。在常溫儲存過程中，雙孢蘑菇蛋白質含量呈下降趨勢，說明采摘后其可能受到水分等因素的脅迫而趨于衰老，蛋白質不斷被降解。

脯氨酸含量呈先上升后下降的趨勢，與Acosta-Motos等[17]、Liu等[18]的研究結果一致。在儲存初期，雙孢蘑菇通過積累大量游離脯氨酸來增強組織的滲透調節能力，維持體內大分子物質的穩定性；隨著儲存時間的延長，由于缺少外界的能量和物質補充，脯氨酸或被降解用于供能或被用于合成其他蛋白質，其含量逐漸降低。丙二醛含量呈先上升后下降的趨勢，說明可能在雙孢蘑菇褐變過程中，代謝平衡被打破，活性氧等自由基逐漸累積，細胞受到氧化脅迫，丙二醛含量升高，而后相關抗氧化酶被激活發揮保護作用，從而含量下降[19]。徐耀宗等[20]對低壓靜電場處理對雙孢蘑菇采后貯藏品質的影響分析表明，低壓靜電場處理能抑制質量損失率和丙二醛含量的上升，減緩軟化速度，提高類黃酮和抗壞血酸等抗氧化物質的含量，抑制多酚氧化酶和過氧化物酶活性，從而延緩雙孢蘑菇發生褐變。胡欣悅等[21]研究表明，雙孢蘑菇經脈沖強光處理后多酚氧化酶活性降低，過氧化氫酶活性升高，表明脈沖強光可以通過抑制酚類物質氧化、提高雙孢蘑菇抗氧化能力來延緩雙孢蘑菇發生褐變。多酚氧化酶和過氧化物酶協同作用催化酚類、類黃酮的氧化和聚合，二者活性均呈先上升后下降趨勢，可能是因為過氧化物酶在褐變前期發揮重要作用，多酚氧化酶在后期發揮重要作用，這與王禮群等[22]的研究結果基本一致。酪氨酸酶活性整體呈下降趨勢，最后維持低活性狀態；漆酶活性保持較低水平狀態，說明二者可能在雙孢蘑菇褐變過程中發揮作用較小。

綜上所述，在雙孢蘑菇褐變過程中，隨著水分的不斷流失，滲透調節物質發生波動以應對褐變反應，相關酶活性發生變化，多酚氧化酶和過氧化物酶協同推動褐變的進程。

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（責任編輯：吳思文）