3種益生菌分離、鑒定及水質(zhì)凈化和抑菌功能研究

摘要：為篩選可用于微生態(tài)制劑的益生菌，從養(yǎng)殖池底泥成功篩選出3株微生物，深入探討了它們的生物特性、對(duì)病原菌的抑制效果以及對(duì)水環(huán)境的凈化能力。分離菌株后，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和16S rRNA基因序列比對(duì)分析鑒定，結(jié)果顯示3株菌株均為芽孢桿菌。測(cè)定了3株菌株的生長(zhǎng)性能，并分析其耐藥性及抑菌效果。結(jié)果表明，3株菌株具有抑制大腸桿菌（Escherichia coli）和溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）能力，并且對(duì)阿莫西林、硫氰酸紅霉素、鹽酸多西環(huán)素、氨芐西林等9種抗生素敏感。水體中亞硝酸鹽（NO-2-N）和氨氮（NH+4-N）含量測(cè)定結(jié)果顯示， 3株菌株具有一定的水質(zhì)凈化作用。篩選出來(lái)的3株菌株展現(xiàn)出作為水產(chǎn)飼料添加劑所需的生物學(xué)特性，并具備改善水質(zhì)的潛力。

關(guān)鍵詞：芽孢桿菌；菌株鑒定；水質(zhì)凈化；抑菌分析

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，養(yǎng)殖過(guò)程中不可避免地會(huì)產(chǎn)生大量的廢棄物，如殘餌、排泄物和動(dòng)物遺體。這些物質(zhì)會(huì)成為病原微生物繁衍的溫床，進(jìn)而破壞水體的微生態(tài)平衡，導(dǎo)致水質(zhì)逐漸惡化[1]。因此，探尋有效方法以改善水質(zhì)、修復(fù)并保持水體微生態(tài)平衡變得尤為重要[2]。近年來(lái)，微生態(tài)添加劑作為抗生素替代產(chǎn)品受到越來(lái)越廣泛的關(guān)注。微生態(tài)制劑，又稱微生態(tài)調(diào)節(jié)劑，對(duì)于改善養(yǎng)殖環(huán)境、維持養(yǎng)殖水體微生態(tài)平衡以及促進(jìn)水生動(dòng)物生長(zhǎng)具有重要作用[3]。

芽孢桿菌作為一類既可好氧又可兼性厭氧的細(xì)菌，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中扮演著至關(guān)重要的角色。它們通過(guò)促進(jìn)宿主生長(zhǎng)、改善水質(zhì)和預(yù)防疾病，被廣泛認(rèn)為是一種具有廣闊應(yīng)用前景的益生菌[4-5]。芽孢桿菌可以通過(guò)多種方式抑制病原菌在腸道內(nèi)定植，其中包括營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、空間競(jìng)爭(zhēng)或產(chǎn)生抑制作用的胞外產(chǎn)物[6]。Vaseeharan等[4]研究顯示枯草芽孢桿菌BT23對(duì)哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）有較強(qiáng)的抑制作用，且能夠提高斑節(jié)對(duì)蝦的存活率。胡毅等[7]分別用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）及復(fù)合益生菌飼喂凡納濱對(duì)蝦，發(fā)現(xiàn)這些益生菌都能降低腸道弧菌數(shù)，且均可提高消化酶和溶菌酶活力。此外，芽孢桿菌可分泌多種高活性水解酶類，有助于促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中的物質(zhì)循環(huán)和水質(zhì)凈化[8]。劉慧玲等[9]通過(guò)分析枯草芽孢桿菌對(duì)羅非魚幼魚生長(zhǎng)環(huán)境的影響，觀察到該菌種能有效改善水質(zhì)，顯著減少氨態(tài)氮和亞硝酸鹽的濃度。張慶華等[10]從大黃魚腸道中提取出地衣芽孢桿菌，經(jīng)過(guò)氨氮和未消化飼料的降解能力測(cè)試，證實(shí)了該菌種在降解氨氮、蛋白質(zhì)和淀粉方面的能力。本試驗(yàn)從養(yǎng)殖池塘底泥篩選出3株具有潛力的益生菌，對(duì)其生物學(xué)特性、對(duì)病原菌的抑制作用以及對(duì)水質(zhì)的凈化效果進(jìn)行了深入研究。這些研究成果不僅為開(kāi)發(fā)新型飼料添加劑提供了科學(xué)依據(jù)，也為芽孢桿菌類微生物制劑的創(chuàng)新開(kāi)發(fā)提供了寶貴的種質(zhì)資源。

1材料與方法

1.1主要試劑和儀器

主要試劑：蛋白胨、牛肉膏、瓊脂粉、氯化鈉、氫氧化鈉、TCBS瓊脂、結(jié)晶紫染色液、革蘭氏碘液、脫色液、沙黃復(fù)染液等。

主要儀器：紫外分光光度計(jì)、顯微鏡、立式壓力蒸汽滅菌器、生化培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、振蕩培養(yǎng)箱等。

1.2采樣及菌株的分離培養(yǎng)

從東營(yíng)市河口區(qū)仙河鎮(zhèn)的對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘中取底泥和養(yǎng)殖污水置于無(wú)菌試劑瓶中，密封低溫儲(chǔ)存。在無(wú)菌條件下，取50 g底泥于100 mL無(wú)菌水，振蕩搖勻，置于80 ℃水浴10 min，冷卻后取5 mL上清液于100 mL LB液體培養(yǎng)基中。37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，取1 mL菌液梯度稀釋，吸取100 μL菌液涂布于LB瓊脂平板上（每個(gè)梯度3個(gè)平行），將平板放置于37 ℃下培育24 h，觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。依據(jù)單菌落形態(tài)，挑取生長(zhǎng)良好、菌落形態(tài)相似且數(shù)目最多的菌落作為目的菌株，分離純化3次以上，直至菌落形態(tài)一致。

1.3菌株鑒定

用顯微鏡觀察單菌落形態(tài)，選取3株分離株進(jìn)行革蘭氏染色，分別將其命名為菌株BS-1、BPS-2和BAS-3，將菌液均勻涂在載玻片上，并在酒精燈火焰上進(jìn)行固定，染色過(guò)程包括初步染色、媒染劑處理、脫色和復(fù)染色，并鏡檢觀察菌體形態(tài)、排列方式、有無(wú)芽孢，鑒定其生理特性。

采用16S rRNA技術(shù)對(duì)微生物進(jìn)行鑒定是一種常規(guī)手段。將分離并純化后的菌株提交至華大基因進(jìn)行基因測(cè)序。通過(guò)在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)所得的基因序列，挑選出具有一定相似性且有效生物學(xué)命名的16S rRNA序列。隨后，使用MEGA7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，以評(píng)估不同菌株之間的同源性。

1.4生長(zhǎng)曲線測(cè)定

挑取上述分離純化的單菌落，接種到LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、120 r/min培養(yǎng)24 h。吸取1 mL活化的菌液接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)，每隔2 h使用紫外分光光度計(jì)（上海精科752N）測(cè)定菌液OD600值，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.5抗生素抗性測(cè)定

取100 μL分離純化后的菌液均勻涂布在LB瓊脂平板上，將藥敏片貼于培養(yǎng)基上，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑。

1.6抑菌性測(cè)定

采用溶藻弧菌和大腸桿菌這兩種典型病原菌作為檢測(cè)對(duì)象，將1 mL的活性病原菌液與100 mL LB瓊脂培養(yǎng)基混合，然后迅速倒入培養(yǎng)皿中形成檢測(cè)平板。待平板冷卻并凝固后，將100 μL的分離菌液注入牛津杯中，接著在37 ℃的恒溫條件下培養(yǎng)24 h，最后測(cè)量形成的抑菌圈的直徑大小。

1.7水質(zhì)凈化效果測(cè)定

取養(yǎng)殖池塘污水置于錐形瓶中進(jìn)行水質(zhì)凈化試驗(yàn)，試驗(yàn)組分別添加的3株菌株濃度維持在105 CFU/mL，對(duì)照組不添加任何菌液，每組3個(gè)重復(fù)。置于37 ℃、120 r/min搖床中培養(yǎng)，每24 h測(cè)定NH+4-N、NO-2-N的濃度。采用納氏試劑分光光度法和N-（1-萘基）-乙二胺光度法，對(duì)模擬養(yǎng)殖污水在不同時(shí)間段內(nèi)氨態(tài)氮（NH+4-N）、亞硝酸鹽（NO-2-N）含量進(jìn)行測(cè)定。

2結(jié)果與分析

2.1菌株形態(tài)鑒定

將菌株BS-1、BPS-2和BAS-3接種于LB固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h后，BS-1菌落呈灰白色，形態(tài)為圓形，大而扁平，不透明，有異味；BPS-2灰黃色，形狀不規(guī)則，菌落扁平，邊緣不整齊，多缺刻，粗糙多褶，有異味；BAS-3淡黃色，形態(tài)為圓形，明顯小于普通圓形菌落，不透明，菌體整體黏稠且有異味，表面飽滿隆起，邊緣整齊，表面濕潤(rùn)、光滑，易挑取。見(jiàn)封二圖1。

2.2鏡檢結(jié)果

革蘭氏染色結(jié)果表明，3株分離菌均為革蘭氏陽(yáng)性菌。BS-1在顯微鏡下觀察菌體呈棒狀，多數(shù)成鏈排列，少部分單獨(dú)存在；BPS-2在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)為細(xì)長(zhǎng)的桿狀，多數(shù)單獨(dú)存在，少部分成鏈排列；BAS-3在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)為短桿狀，同樣多數(shù)單獨(dú)存在，少部分成鏈排列。見(jiàn)封二圖2。

2.3測(cè)序結(jié)果

分別將菌株BS-1、BPS-2和BAS-3的16S rRNA測(cè)序所得的基因序列在GenBank中進(jìn)行同源性檢索。通過(guò)同源性比對(duì)（表1），結(jié)果表明BS-1與熱帶芽孢桿菌聚為一簇，其相似性為100%（圖3）。BPS-2與短短芽孢桿菌聚為一簇，其相似性為100% （圖4）。BAS-3與土壤芽孢桿菌聚為一簇，其相似性為100%（圖5）。經(jīng)綜合分析鑒定結(jié)果，確定3種菌株均屬于芽孢桿菌屬。

2.4三種菌株生長(zhǎng)曲線分析

3株芽抱桿菌以1%的接種量均能在 37 ℃ LB液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并達(dá)到較高濃度（封二圖6）。其中菌株BAS-3長(zhǎng)勢(shì)最好，具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力，1～10 h迅速繁殖，28 h OD600值達(dá)到最大；菌株BPS-2、BS-1的生長(zhǎng)曲線較為一致，在培養(yǎng) 2 h 時(shí)就開(kāi)始進(jìn)入快速增長(zhǎng)期，在培養(yǎng) 14 h 后濃度增長(zhǎng)放緩，培養(yǎng)26 h后菌株生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期。

2.5耐藥試驗(yàn)結(jié)果

由表2可以看出，BS-1菌株對(duì)阿莫西林、硫氰酸紅霉素、鹽酸多西環(huán)素、氨芐西林等9種抗生素高度敏感；BPS-2菌株對(duì)硫酸新霉素中度敏感，對(duì)阿莫西林、慶大霉素、氨芐西林、多黏菌素等8種抗生素高度敏感；BAS-3菌株對(duì)頭孢他啶、慶大霉素、多黏菌素、氨芐西林等9種抗生素高度敏感。

2.6抑菌試驗(yàn)結(jié)果

3株芽孢桿菌對(duì)溶藻弧菌和大腸桿菌的抑制效果見(jiàn)表3。對(duì)溶藻弧菌的抑制效果為：BS-1菌株> BAS-3菌株> BPS-2菌株；對(duì)大腸桿菌的抑制效果為：BS-1菌株> BAS-3菌株> BPS-2菌株。

2.7水質(zhì)凈化試驗(yàn)結(jié)果

2.7.1對(duì)養(yǎng)殖水體中NH+4-N 含量的影響圖7（封二）顯示了3株菌株對(duì)養(yǎng)殖水體氨態(tài)氮（NH+4-N）含量變化的影響，各試驗(yàn)組菌株濃度均保持在105 CFU/mL。其中對(duì)照組氨態(tài)氮濃度持續(xù)處于較高水平波動(dòng)，而試驗(yàn)組在第2天就觀察到水體中氨態(tài)氮濃度下降。經(jīng)過(guò)連續(xù)7 d的監(jiān)測(cè)，試驗(yàn)組水體中的NH+4-N含量一直維持在較低水平。結(jié)果表明，3株菌株均能有效降低養(yǎng)殖水體中氨態(tài)氮濃度。

2.7.2對(duì)養(yǎng)殖水體中NO-2-N含量的影響圖8（封二）顯示了3株菌株對(duì)養(yǎng)殖水體亞硝酸鹽（NO-2-N）濃度變化的影響，各試驗(yàn)組菌株濃度均保持在105 CFU/mL。與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組水體中的NO-2-N濃度在第 2天開(kāi)始下降。在3種菌株中，BAS-3菌株對(duì)亞硝酸鹽的去除效果最好，其去除率最高可達(dá)到 69.09%。結(jié)果表明，這3株菌株均具有降低養(yǎng)殖水體中NO-2-N濃度的潛力。

3討論

芽孢桿菌通過(guò)其高效的胞外酶分泌機(jī)制，能夠直接分解或轉(zhuǎn)化養(yǎng)殖環(huán)境中的殘余飼料和代謝產(chǎn)物。這一過(guò)程有效減少了水體中的氨態(tài)氮和亞硝酸鹽等有害化學(xué)物質(zhì)，同時(shí)抑制了病原微生物的增殖，從而改善水質(zhì)[11]。大量研究證明，芽孢桿菌作為水質(zhì)改良劑在凈化水質(zhì)方面起著重要作用，有助于為水生動(dòng)物提供更多有益的微生物。熱帶芽胞桿菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，形態(tài)為圓形，不透明，有異味，為芽孢桿菌屬細(xì)菌。以菌株BS-1的DNA為模板，經(jīng)通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，成功獲得長(zhǎng)度為1 400 bp的DNA片段。序列比對(duì)分析表明，該菌株的16S rRNA序列與B. tropicus strain ISP161A的序列完全一致，相似度達(dá)到100%。熱帶芽孢桿菌對(duì)水質(zhì)具有明顯的凈化作用，可使人工廢水中的化學(xué)需氧量、氨氮、亞硝酸鹽的去除率高達(dá)90%[12]。吳海武[13]從海南海水養(yǎng)殖系統(tǒng)的底泥中篩選得到3株熱帶芽孢桿菌，對(duì)其進(jìn)行復(fù)方和規(guī)模化發(fā)酵培養(yǎng)，測(cè)定該芽孢桿菌制劑對(duì)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖水質(zhì)的凈化效果，結(jié)果表明該芽孢桿菌制劑對(duì)養(yǎng)殖水質(zhì)的凈化效果很明顯，不僅對(duì)氨氮、亞硝酸鹽和硝酸鹽有去除效果，而且對(duì)弧菌有抑制效果。本研究結(jié)果表明芽孢桿菌對(duì)養(yǎng)殖水體有積極影響，能夠幫助凈化水質(zhì)。推測(cè)菌株BS-1可能具有降解氨和解毒的作用，同時(shí)維持菌藻平衡。益生芽孢桿菌作為飼料添加劑具有穩(wěn)定的特點(diǎn)，對(duì)水生動(dòng)物無(wú)不良影響，且不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。未來(lái)可進(jìn)一步研究和應(yīng)用BS-1菌株，將其作為芽孢桿菌水質(zhì)凈化有益微生物制劑進(jìn)行開(kāi)發(fā)。

短短芽胞桿菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，具有較強(qiáng)的蛋白分泌能力，能產(chǎn)芽孢，分布廣泛，生命力強(qiáng)[14]。該菌在多個(gè)領(lǐng)域顯示著巨大的應(yīng)用潛力，不同環(huán)境下的短短芽胞桿菌會(huì)呈現(xiàn)不同的特征，同時(shí)也有不同的應(yīng)用，其中在生物防治領(lǐng)域，短桿菌肽的抗菌特性引起了廣泛關(guān)注，成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)[15-16]。研究表明，短桿菌肽是短短芽孢桿菌抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的關(guān)鍵活性成分之一。這種細(xì)菌主要通過(guò)釋放短桿菌肽（gramieidin）和短桿菌酪肽（tyrocidine）來(lái)抑制其他微生物的代謝活動(dòng)[17]。此外，短短芽孢桿菌顯示出對(duì)瘧原蟲(chóng)的抑制效果，Rautenbach等[18]研究發(fā)現(xiàn)，該細(xì)菌能夠產(chǎn)生一種環(huán)狀短桿菌肽，這種肽不僅能有效阻止瘧原蟲(chóng)的侵襲，還能中斷其生命周期，從而達(dá)到消滅瘧原蟲(chóng)的目的。Kondejewski等[19]在對(duì)短桿菌肽S的進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn)，它對(duì)革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌和真菌均表現(xiàn)出抗菌作用。在探究短短芽孢桿菌對(duì)番茄灰霉病菌的抑制作用時(shí)，Edwards等[16]發(fā)現(xiàn)該菌通過(guò)分泌短桿菌肽S來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)灰霉菌的抑制。同時(shí)，Li等[20]從短短芽孢桿菌中分離出一種新幾丁質(zhì)酶，該酶具有優(yōu)異的熱穩(wěn)定性和對(duì)蛋白水解酶的抵抗力，顯示出作為生物防治劑的潛力。關(guān)于芽孢桿菌作為抗菌物質(zhì)產(chǎn)生菌的許多報(bào)道已使其在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面得到廣泛應(yīng)用。本研究對(duì)養(yǎng)殖池塘底泥中分離出來(lái)的菌株進(jìn)行培養(yǎng)，并對(duì)其抗菌特性進(jìn)行初步探究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BPS-2菌株對(duì)溶藻弧菌有良好的抑制效果。BPS-2菌株和其它芽孢桿菌相比，在抗菌防病方面都存在一定的潛力，后期可繼續(xù)對(duì)BPS-2菌株的抑菌機(jī)制進(jìn)行探索。

眾多研究表明芽孢桿菌在可持續(xù)水產(chǎn)養(yǎng)殖中扮演重要角色，它們不僅能夠促進(jìn)宿主生物的增長(zhǎng)和提升其品質(zhì)，還有助于改善水體環(huán)境和減少病害風(fēng)險(xiǎn)，被認(rèn)為是一種有發(fā)展前景的益生菌[4-5]。因此對(duì)芽孢桿菌的研究對(duì)健康養(yǎng)殖的發(fā)展具有重大意義。

4結(jié)論

本研究成功從養(yǎng)殖池塘底泥中分離出3株芽孢桿菌，通過(guò)分離鑒定，最終確定菌株BS-1為熱帶芽孢桿菌、菌株BPS-2為短短芽孢桿菌、菌株BAS-3為土壤芽孢桿菌。通過(guò)弧菌抑制試驗(yàn)和水質(zhì)凈化試驗(yàn)，結(jié)果顯示3株益生菌在抑制有害菌及降低NH+4-N、NO-2-N方面有顯著作用，有利于水質(zhì)凈化。后期可將3株菌株復(fù)方并進(jìn)行規(guī)模化培養(yǎng)，將其作為水質(zhì)凈化有益微生物制劑進(jìn)行開(kāi)發(fā)，可起到全方位凈化水質(zhì)作用。

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Isolation and identification of three probiotics and analysis of their

bacteriostatic effect on aquatic pathogens and water purification

YANG Ning， LI Jinxiang， ZANG Xueyun， ZHAI Kaixuan

（Qingdao Zhongren Animal Pharmaceutical Co.， Ltd.， Jiaozhou 266100，China）

Abstract：In order to screen probiotics that can be used in microecological preparations， three strains of microorganisms were successfully screened from the bottom mud of aquaculture ponds. Their biological characteristics， inhibition effect on pathogenic bacteria and purification ability on water environment were deeply discussed. The isolated strains were identified by morphological observation and 16S rRNA gene sequence comparison. The results showed that all the three strains were Bacillus. The growth performance of the three strains was measured， and the drug resistance and antibacterial effect were analyzed. The results showed that the three strains had the ability to inhibit Escherichia coli and Vibrio alginolyticus， and were sensitive to 9 antibiotics such as amoxicillin， erythromycin thiocyanate， doxycycline hydrochloride and ampicillin. The content of nitrite （NO-2-N） and ammonia nitrogen （NH-4-N） in water was determined. The results showed that the three strains had a certain effect on water purification. The three selected strains showed the biological characteristics required as aquatic feed additives and had the potential to improve water quality.

Key words：Bacillus； strain identification； water purification； bacteriostatic analysis

（收稿日期：2024-07-13）