一株牙鲆源哈維氏弧菌的分離鑒定及抗性研究

摘要：自秦皇島昌黎養殖的患病牙鲆 （Paralichthys olivaceus）體內分離獲得一株革蘭氏陰性菌，對其形態特征、生理生化特性及16S rDNA序列進行分析，鑒定其為哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）；對分離菌株進行了30種抗菌藥的藥敏試驗和11株益生菌的拮抗試驗，得出此分離菌株對米諾環素、左氧氟沙星、頭孢他啶、氟苯尼考、頭孢曲松、諾氟沙星、環丙沙星、強力霉素、復方新諾明等13種藥物高度敏感，對克林霉素、青霉素、氨芐西林、林可霉素、苯唑西林等9種藥物表現為不同程度的耐藥性；地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌2種益生菌在一定濃度下對其具有拮抗作用。

關鍵詞：牙鲆 （Paralichthys olivaceus）；哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）；分離鑒定；藥敏試驗；拮抗試驗

牙鲆（Paralichthys olivaceus）俗稱牙片、偏口、比目魚、平目、左口等，是渤海灣的重要土著種，也是我國北方遼寧、河北、天津和山東等地的重要魚類增養殖品種[1]。隨著牙鲆養殖規模的不斷擴大，各種病害也頻繁發生，其中細菌性疾病最為常見。哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）隸屬于弧菌屬（Vibrio）[2]，在自然界中分布廣泛，可廣泛引起海水養殖魚、蝦、蟹等感染發病[3-9]。本研究從患病牙鲆的病灶處分離出了一株病原菌，通過測序、生理生化等手段進行了鑒定，對分離菌株進行了常規抗菌藥的藥敏試驗，同時，利用河北農業大學海洋學院病害實驗室分離保存的11株益生菌對分離病原菌進行了拮抗試驗。本研究希望能夠確定其敏感藥物及具有拮抗作用的益生菌，旨在為牙鲆細菌性疾病的研究和防控提供參考。

1材料與方法

1.1患病牙鲆

患病牙鲆來自秦皇島昌黎縣某牙鲆養殖場，體質量260～470 g/尾。主要癥狀：患病牙鲆體色明顯發黑；有眼側部分鱗片脫落、出血；無眼側鰭邊發紅；尾鰭鰭條間組織潰爛；鰓絲呈粉紅色，部分鰓絲潰爛；解剖發現，病魚肝臟有線性淤血，膽囊腫大，腸道無食物、充滿水樣液，中腎呈粉紅色缺血狀，脾臟淤血。

1.2病原菌的分離鑒定

1.2.1病原菌的分離及純化取患病的牙鲆，解剖，分別挑取體表潰爛處、鰓絲潰爛處、腸道內容物、中腎等部位劃線接種于2216E和TCBS固體培養基，28 ℃下培養18～24 h；挑選培養基中形態一致的單個優勢菌落進行再次劃線接種， 重復此操作，直至獲得形態特征完全一致的菌落。記錄菌落的形態特征。將分離純化的菌落置于終濃度50%的甘油保護劑中， -80 ℃保存。

1.2.2分離菌的鑒定

1.2.2.1生理生化分析鑒定分離純化的菌株暫命名為 VH0522，將隔夜培養的菌落接種于細菌微量生化鑒定管中， 28 ℃培養，參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》（第九版）[10]和《常見細菌系統鑒定手冊》[11]對VH0522各項生理生化指標的測定結果進行分析。

1.2.2.2分子生物學鑒定利用細菌總基因組DNA提取試劑盒提取菌株VH0522的DNA，進行16S rDNA擴增，采用通用引物（正向引物為27F： 5′-AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG-3′；反向引物為1 492 R： 5′-TACG GTTACCTTGTTACGAC-3′）， 擴增目的片段的序列全長為1 477 bp。將擴增產物送至上海邁浦生物科技有限公司測序。用DNA Sequencing analysis軟件進行分析比對。使用MEGA11的Neighbor Joining方法構建系統進化樹。

1.3藥敏試驗

在TCBS培養基上使用30種抗菌藥對分離菌株VH0522進行藥敏試驗， 每種藥物設3個平行。28 ℃ 培養24 h后用游標卡尺測量抑菌圈直徑， 測量值取 3個平行的平均值。

1.4益生菌拮抗試驗

在LB固體培養基上采用雙層平板打孔法進行益生菌抗性試驗。當上層平板經滅菌后降溫至45 ℃左右時，加VH0522菌液0.1 mL （濃度為108 CFU/mL）。在加菌液后的上層平板上使用經滅菌的打孔器打孔，每個平板上打6個間隔相近的孔，打孔時不能穿過下層培養基，用經滅菌的牙簽挑出孔中的上層培養基。每個孔內加菌液濃度為104～108 CFU/mL的20 μL益生菌液。每組設3個平行，1個空白對照。28 ℃培養 24 h后用游標卡尺測量抑菌圈直徑，判斷不同益生菌在不同菌液濃度下對VH0522的拮抗效果。試驗地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、熱帶芽孢桿菌、阿氏芽孢桿菌、產堿假單胞菌、極小短小桿菌、貝萊斯芽孢桿菌等11種益生菌，益生菌來自河北農業大學海洋學院病害實驗室。

2結果與分析

2.1細菌形態學觀察

對VH0522革蘭氏染色后光學顯微鏡觀察為革蘭氏陰性桿菌。28 ℃培養 24 h后，2216E固體培養基上的菌落形態呈乳白色、圓形，表面光滑； TCBS固體培養基上的菌落形態呈黃色、圓形，表面較光滑。

2.2生理生化特性分析

生理生化結果顯示，分離菌株VH0522在麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、賴氨酸脫羧酶、明膠、西蒙氏枸櫞酸鹽、甘露醇、氧化酶、鼠李糖、蕈糖、3％氯化鈉堿性蛋白胨水等方面反應為陽性；在鳥氨酸脫羧酶、精氨酸雙水解酶、乳糖、肌醇、山梨醇、阿拉伯糖、七葉苷、木糖、苦杏仁苷、丙二酸鹽、蛋白胨水、水楊素、苯丙氨酸等方面反應為陰性，且不能產生硫化氫 （見表1）。參考《常見細菌系統鑒定手冊》和《伯杰氏細菌鑒定手冊》（第九版），發現分離菌株 VH0522 與哈維氏弧菌的生理生化特性基本一致。

2.3分子生物學鑒定

將分離菌株VH0522的16S rDNA序列與GenBank 中已公布的序列進行BLAST 比對分析，發現與哈維氏弧菌的同源相似性達到 9986%。構建的系統發育樹見圖 1，結果顯示與哈維氏弧菌的親緣關系最近。

綜合菌株VH0522 的表型、生理生化特征及 16S rDNA 測序及系統發育樹分析結果， 可以判定菌株 VH0522 為哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）。

2.4藥敏試驗

藥敏試驗的具體結果見表2。結果顯示：菌株VH0522對30種抗菌藥物中的米諾環素、四環素、氯霉素、阿奇霉素、左氧氟沙星、亞胺培南、頭孢他啶、氟苯尼考、頭孢曲松、諾氟沙星、環丙沙星、強力霉素、復方新諾明等13種藥物高度敏感，對紅霉素、頭孢呋辛鈉、頭孢哌酮、卡那霉素、鏈霉素、哌拉西林、慶大霉素、阿卡米星等8種藥物敏感，對克林霉素、青霉素、氨芐西林、林可霉素、苯唑西林等其它9種藥物表現為不敏感。

2.5益生菌拮抗試驗

益生菌拮抗試驗的具體結果見表3。結果顯示：地衣芽孢桿菌在108 CFU/mL 濃度時表現出較好的拮抗效果，而107 CFU/mL濃度時拮抗效果則明顯降低，而106 CFU/mL以下濃度時則完全沒有拮抗作用；枯草芽孢桿菌的表現與地衣芽孢桿菌相似，在108 CFU/mL濃度時展現出一定拮抗作用， 107 CFU/mL濃度時拮抗效果降低，106 CFU/mL以下濃度時也完全失去拮抗作用。其他9種益生菌在所有濃度時對菌株VH0522都沒有拮抗作用。

3討論

哈維氏弧菌是海水養殖的常見致病菌，已有的報道顯示曾導致多種海水養殖動物患病，從不同養殖動物、不同發病地區分離出的哈維氏弧菌表現出不同的藥物敏感性。許悅等[6]對從海南養殖石斑魚潰瘍病上分離鑒定的哈維氏弧菌進行了藥敏試驗，結果顯示對四環素類藥物高度敏感；滕爽爽等[7]從浙江發病泥蚶（Tegillarca granosa）上分離鑒定的哈維氏弧菌也對四環素類藥物高度敏感；郭美玲等[8]從天津養殖的青石斑（Epirzephelas awoara）分離鑒定的哈維氏弧菌同樣對四環素類藥物高度敏感；以上試驗結果與本試驗結果一致。但裴立碩等[5]從天津養殖的點帶石斑魚（Epinephelus coioides）上分離鑒定的哈維氏弧菌卻對部分四環素類藥物耐藥（四環素、強力霉素），部分中度敏感（米諾環素）；孔明慧等[4]從豹紋鰓棘鱸（Plectropomus leopardus）上分離鑒定的哈維氏弧菌對部分四環素類藥物耐藥（米諾環素），部分中度敏感（四環素）?？酌骰鄣萚4]從豹紋鰓棘鱸上分離鑒定的哈維氏弧菌對氨基糖苷類藥物中度敏感，裴立碩等[5]從天津養殖的點帶石斑魚上分離鑒定的哈維氏弧菌對氨基糖苷類藥物也表現為中度敏感，這兩個試驗結果與本試驗結果相同；而滕爽爽等[7]從浙江發病泥蚶上分離鑒定的哈維氏弧菌則對氨基糖苷類藥物高度敏感；許悅等[6]從海南養殖石斑魚潰瘍病上分離鑒定的哈維氏弧菌對氨基糖苷類藥物則表現為耐藥。另外，上述所有藥敏試驗中，哈維氏弧菌對喹諾酮類藥物均表現為高度敏感。以上結果顯示同一種病原菌的不同菌株間可能在藥物敏感性上存在一定差異，這可能與菌株的來源有關，不同地區、分離的不同年份、不同養殖品種或不同養殖模式的養殖業者的用藥習慣或用藥方式有很大區別，其結果是導致養殖動物體內或養殖環境中的不同菌株的耐藥性出現明顯區別。蔣魁等[9]、王春艷等[12]、吳越等[13]、胡大勝[14]、鄧玉婷等[15]的研究也得出了相似的結論。

益生菌現如今已經愈來愈被水產養殖從業者所接受，在水產養殖中的應用也愈來愈廣泛。益生菌目前主要被養殖業者應用到養殖水體中用來控制或改良水環境，如改良池塘底質，去除水中的氨氮、亞硝酸鹽和硫化氫等有害物質；另外，添加到飼料中用以改善養殖動物的腸道菌群結構、提高飼料利用率。除此外，理論上益生菌還可以在水環境和養殖動物腸道中拮抗致病菌，尤其是在水環境中使用消毒劑后，此時病原菌密度相對較低，益生菌可以快速占領生態位。本研究的結果顯示，地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌對哈維氏弧菌有一定拮抗作用，但只在107 CFU/mL以上的高濃度時才有一定效果，而其他益生菌均沒有拮抗作用。利用益生菌拮抗條件致病菌來防控病害是減少抗生素使用的有效路徑，目前能夠商品化使用的益生菌種類還相對較少，應加大篩選力度；此外，如何能夠在微生態環境更為復雜的養殖生產中更有效地實現這一路徑還需要進一步研究。

參考文獻：

[1] 宮春光.牙鲆養殖技術及發展[J].科學養魚，2002（2）：26-27.

[2] 鄭天倫，王國良，金珊.海水養殖動物弧菌病防治的研究進展[J].臺灣海峽，2002（3）：372-378.

[3] 朱貝貝，方皓，李煜，等.文蛤病原菌哈氏弧菌的分離鑒定與藥敏試驗[J].山東畜牧獸醫，2017，38（9）：4-5.

[4] 孔明慧，黃麗芳，廖國威，等.豹紋鰓棘鱸哈維氏弧菌的分離鑒定與耐藥分析[J].仲愷農業工程學院學報，2021，34（4）：16-20.

[5] 裴立碩，朱永龍，毛晴，等.點帶石斑魚致病性哈維氏弧菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].天津農學院學報，2021，28（4）：35-40.

[6] 許悅，王印庚，周永燦，等. 海南地區養殖石斑魚皮膚潰瘍病病原的分離、鑒定、藥敏分析及病理學研究[J]. 海南大學學報自然科學版，2018，36（2）：153-163.

[7] 滕爽爽，張炯明，張利兵，等. 泥蚶致病性哈維氏弧菌的分離與鑒定[J]. 水產科學，2022，41（4）：547-555.

[8] 郭美玲，龐月，劉芯睿，等. 青石斑幼魚致病病原哈維氏弧菌的分離鑒定及致病性分析[J]. 安徽農業科學，2023，51（12）：89-93，97.

[9] 蔣魁，徐力文，蘇友祿，等.兩株珍珠龍躉病原性哈維弧菌（Vibrio harveyi）的分離與鑒定[J].生態科學，2017，36（6）：16-24.

[10] HOLT J G，KRIEG N Ｒ，SNEATH P H A，et al．Bergey＇s manual of determinative bacteriology［M］．9th ed．Maryland：Lippincott，Williams＆Wilkins，1994：565－786．

[11] 蔡妙英，東秀珠.常見細菌系統鑒定手冊［M］.北京：科學出版社，2001.

[12] 王春艷，閻斌倫.連云港市贛榆縣水產養殖環境中哈氏弧菌耐藥性研究[J].淮海工學院學報：自然科學版，2013（1）：4.

[13] 吳越，鄭伊諾，陸榮茂，等.溫州地區水產品中哈維氏弧菌的耐藥分析[J].水產科學，2020（6）：39.

[14] 胡大勝.廣西水產養殖主要細菌病的監測與耐藥性調查[J]. 中國科技成果， 2010（13）： 49-51.

[15] 鄧玉婷，譚愛萍，張瑞泉，等.廣東主要水產養殖地區氣單胞菌耐藥狀況的調查分析[J]. 南方農業學報， 2019， 50（11）： 2375-2383.

Isolation， identification and resistance of Vibrio harveyi isolated

from Japanese flounder （Paralichthys olivaceus）

GAO Peiyu GUO Kaiying YIN Rui GONG Chunguang

（1. Zhangjiakou Aquatic Technology Extension Station，Zhangjiakou 075000， China;

2.Ocean College of Hebei Agricultural University， Qinhuangdao 066003，China;

3.Hebei Academy of Marine and Aquatic Sciences，Qinhuangdao 066201，China）

Abstract：A Gram-negative bacterium was isolated from diseased cultured Japanese flounder （Paralichthys olivaceus） in Changli， Qinhuangdao. Its morphological characteristics， physiological and biochemical properties， as well as its 16S rDNA sequence were analyzed， identifying it as Vibrio harveyi. The isolated strain underwent antibiotic susceptibility testing with 30 antibiotics and an antagonistic experiment with 11 probiotics. The results revealed that the isolated strain exhibited high sensitivity to 13 antibiotics， including minocycline， levofloxacin， cefotaxime， florfenicol， norfloxacin， ciprofloxacin， doxycycline and compound sulfadiazine among others; while showing varying degrees of resistance to 9 antibiotics such as clindamycin， penicillin and ampicillin. Two probiotics， Bacillus licheniformis and B. subtilis， demonstrated antagonistic effects on the strain at certain concentrations.

Key words：Paralichthys olivaceus; Vibrio harveyi; isolation and identification; antibiotic susceptibility testing；antagonistic assay

（收稿日期：2024-07-22；修回日期：2024-08-12）