蚯蚓硒制備工藝優化及其在番鴨中的應用效果

摘要：利用響應曲面法優化蚯蚓硒的制備工藝條件，研究其對番鴨生長性能、硒沉積規律和免疫相關指標的影響。在單因素試驗的基礎上，采用響應曲面法研究亞硒酸鈉的硒濃度（0、20、40、60、80、100、120、140、 160 mg/kg）、亞硒酸鈉攝食時間（0、30、60、90 min）對蚯蚓硒中總硒、有機硒和有機硒占比的影響，檢測模擬最優工藝條件制備蚯蚓硒，并將其用于番鴨養殖，探究其在番鴨中的應用效果。結果發現：（1）蚯蚓硒的最佳制備工藝：硒濃度為159.758 mg/kg，放置49.673 min，45 ℃酶解24 h。測得總硒含量、有機硒含量和有機硒占比分別為 28.880 mg/kg、24.330 mg/kg 和84.251%。（2）與對照組相比，0.3 mg/kg酵母硒顯著降低番鴨終末重和平均日增重（P<0.05）；0.5 mg/kg 蚯蚓硒顯著增加番鴨的平均日增重（P<0.05）；0.3、0.5 mg/kg蚯蚓硒顯著降低番鴨的耗料增重比（P<0.05）。（3）0.3 mg/kg酵母硒，0.1、0.3、0.5 mg/kg蚯蚓硒極顯著增加42 d和56 d肌肉中的硒含量（P<0.01）。此外，0.1、0.3、0.5 mg/kg蚯蚓硒組56 d肝臟的硒含量顯著低于0.3 mg/kg酵母硒組（P<0.05）。（4）0.3 mg/kg酵母硒極顯著提高番鴨血清的白細胞介素2含量（P<0.01）；0.5 mg/kg蚯蚓硒顯著提高番鴨血清的免疫球蛋白G水平（P<0.05），極顯著提高腫瘤壞死因子α水平（P<0.01）。結果表明，采用響應曲面法優化蚯蚓硒的制備條件是合理可行的，蚯蚓硒在番鴨肌肉組織中具有顯著的富集效果，且不易于聚積在番鴨的肝臟中，能有效提高番鴨生長性能和免疫功能，是一種安全的硒源補充形式。

關鍵詞：響應曲面法；蚯蚓硒；番鴨；生長性能；硒沉積；免疫相關指標

中圖分類號：S834.5 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）16-0214-07

硒是生命體所必需的重要微量營養元素，對清除自由基、延緩衰老、快速增強抵抗力等有重要作用，與機體健康密切相關［1］。有機硒相較于無機硒，具有毒性低、污染小、轉化率高、活性強、易富集等優點［2］。蚯蚓可將攝食的無機硒基本全部轉化為有機硒［3］。筆者所在課題組在蚯蚓中添加無機硒（亞硒酸鈉），利用蚯蚓的硒富集和轉化能力，將外源性無機硒轉化為蚯蚓體內的有機硒。隨后，利用蚯蚓本身的水解酶分解蚯蚓蛋白質，可得到高營養價值的蚯蚓硒，其有機硒占總硒的80%以上，是一種很好的硒源補充方式［4］。將蚯蚓硒作為畜禽飼料添加劑，不僅能實現畜禽產品的富硒，提高品質，提升附加值，還提高畜禽生產性能，這對延伸產業鏈，推動農牧循環和全面促進人類和畜禽養殖業的健康發展具有積極的作用。為進一步優化蚯蚓硒制備的工藝程序，本研究以亞硒酸鈉添加的硒濃度和蚯蚓對亞硒酸鈉的攝入時間為自變量，以總硒含量、有機硒含量和有機硒占比為因變量，利用響應曲面法（RSM）分析，通過分析試驗數據建立連續變量曲面模型，進而分析操作因子和響應值，得到最優參數值。

現階段，我國畜牧行業發展不僅僅著眼于擴大生產量，也將重點轉移至如何生產出符合消費者要求的高質量產品。番鴨作為我國人民重要的肉類食品，具有體型大、生長迅速、耐粗飼、易肥育、肉質鮮美等優點，能夠提供人體所需的多種微量元素［5］。通過在番鴨飼養過程中添加蚯蚓硒生產天然富硒番鴨可成為增加人類每日硒攝取量的有效途徑。因此，本研究以番鴨為研究對象，以蚯蚓硒為飼料添加物，進一步探究番鴨體內不同組織中硒元素隨日齡增加的沉積規律，同時檢測蚯蚓硒對番鴨生長性能和免疫相關指標，以驗證蚯蚓硒的安全性和使用效果，為優質富硒番鴨的開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

動物試驗于2023年1—2月在江西省贛州市南康區試驗示范基地完成。其余試驗于2023年2—4月在贛州市畜牧水產研究所完成。

1.2 試驗材料

試驗選用經牛糞養殖的赤子愛勝蚓（Eisenia foetida，購于定南縣東山嘉禾現代農業有限公司）；試驗番鴨由贛州市畜牧水產研究所的贛南番鴨育種中心提供。

1.3 蚯蚓硒制備

將亞硒酸鈉倒入裝有蚯蚓的燒杯中，使其硒濃度分別為0、20、40、60、80、100、120、140、 160 mg/kg，分別放置0、30、60、90 min，再放入烘箱，45 ℃酶解24 h。過濾、搖勻，采集樣品用于后續總硒和有機硒的測定。

1.4 試驗設計

1.4.1 響應曲面優化試驗設計

根據單因素試驗結果，利用Design Expert設計軟件，采取Box-Behnken試驗原理對2個因素（亞硒酸鈉的硒濃度、攝食時間）及其水平進行響應曲面設計，優化單因素、因素的平方項和不同因素間的相互作用項，從而獲得最大響應變量，得出最佳的反應條件。以總硒含量、有機硒含量及有機硒占比為響應值，自變量為亞硒酸鈉濃度和蚯蚓對亞硒酸鈉攝入時間，亞硒酸鈉的硒濃度水平為0、20、40、60、80、100、120、140、160 mg/kg，亞硒酸鈉攝食時間為0、30、60、90 min。

1.4.2 動物試驗 選用1日齡體況良好、體重接近的番鴨900羽，隨機分成5個組，每組6個重復，每個重復30羽。對照組飼喂基礎飼糧，0.3 mg/kg 酵母硒組在基礎飼糧中添加硒含量為0.3 mg/kg的酵母硒，0.1 mg/kg蚯蚓硒組、0.3 mg/kg 蚯蚓硒組和0.5 mg/kg蚯蚓硒組在基礎飼糧中分別添加硒含量為0.1、0.3、0.5 mg/kg的蚯蚓硒。

1.5 檢測指標

試驗期過程中，采集試驗第14、28、42、56天番鴨的肌肉、糞便用于硒含量的檢測；采集試驗第56天番鴨的胸肌、腿肌、心臟、肝臟、十二指腸，用于硒含量的檢測；采集試驗第56天番鴨的血清，用于后續免疫相關指標的檢測。

1.5.1 生長性能測定 分別于飼養第1天和第56天測定番鴨的初生重及終末重，并定時記錄其采食量，計算各組的生長性能。供試番鴨生長性能指標包括：初生重、終末重、平均日增重、平均日采食量、耗料增重比（平均日采食量/平均日增重）。

1.5.2 總硒的測定 按照國家標準GB 5009.93—2017中電感耦合等離子體質譜法（ICP-MS法）使用電感耦合等離子體質譜儀（Agilent 7800 ICP-MS）測總硒含量。

1.5.3 有機硒測定

參照劉軍的試驗方法［6］測定有機硒的含量。有機硒含量和有機硒占比計算方式如下：有機硒=總硒-無機硒；有機硒占比=（有機硒含量/總硒含量）×100%。

1.5.4 免疫指標測定 血清中IgM、IgG含量采用免疫比濁法按照相應試劑盒說明書進行測定；白細胞介素2（IL-2）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素17（IL-17）含量采用ELISA法測定。

1.6 數據分析

采用SPSS 22軟件進行單因素方差分析，選擇Duncans法多重比較組間差異顯著性，結果以“平均數±標準差”表示。以P<0.05為差異顯著性判斷標準，以P<0.01為差異極顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 響應曲面法優化蚯蚓硒制備工藝條件

2.1.1 響應曲面試驗模型和數據 響應曲面試驗模型設計以亞硒酸鈉的硒濃度（A）和時間（B）為自變量，蚯蚓硒的總硒含量、有機硒含量和有機硒占比為響應值，設計2因素3水平響應試驗，共36組，所得數據和試驗因素水平見表1。

2.1.2 響應曲面試驗結果分析 應用Design Expert軟件對表中數據進行回歸模擬，得到總硒、有機硒和有機硒占比的函數表達式：

Y1=21.22+16.70A-3.87B+4.25AB-5.25A2-10.77B2-1.23A2B-7.33AB2-2.47A3+9.66B3；

Y2=13.84+14.80A+4.03B+4.47AB-2.34A2-7.25B2-2.18A2B-6.79AB2-3.09A3+1.61B3；

Y3=65.60+32.39A+35.28B+11.54AB-14.13A2-14.02B2-12.06A2B-11.72AB2-5.38A3-12.41B3。

式中：Y1為響應值（總硒），mg/kg；Y2為響應值（有機硒），mg/kg；Y3為響應值（有機硒占比），%；A為濃度，mg/kg；B為時間，min。

采用DesignExpert軟件中的ANOVA進行響應面方差分析。由表2可知，模型中F值分別為37.70、32.87、21.71。P<0.000 1，表明模型對總硒含量、有機硒含量和有機硒占比影響極顯著。預測值與它們對應的試驗值的R2（總硒）＝0.928 8、變異系數CV（總硒）為24.81%、調整相關系數值R2adj（總硒）＝0.904 2；R2（有機硒）＝0.919 2、變異系數CV（有機硒）為31.57%、調整相關系數值R2adj（有機硒）＝0.891 3；R2（有機硒占比）＝0.882 5、變異系數CV（有機硒占比）為18.94%、調整相關系數值R2adj（有機硒占比）＝0.841 9。各組R2和R2adj接近1，表明構建的模型擬合良好，模型選取合理。

由表2可知，對于響應值Y（總硒），A、AB、A2、B2、AB2、B3對總硒含量有顯著影響。各因素影響程度由強到弱順序為：溶液濃度（A）、時間（B）。對于響應值Y（有機硒）， A、AB、B2、AB2對有機硒含量的影響顯著。各因素影響程度由強到弱順序為：濃度（A）、時間（B）。對于響應值Y（有機硒占比），A、B、AB、A2、B2對有機硒占比的影響顯著。

2.1.3 響應曲面分析 通過構建模型預測蚯蚓硒的總硒、有機硒和有機硒占比的三維響應面圖和等高線圖。由圖1可知，濃度和時間的交互作用對總硒含量、有機硒含量和有機硒占比影響均顯著，表現為曲面較陡呈鐘罩形、半鐘罩形。通過軟件對試驗分析，將總硒和有機硒設置最大值，有機硒占比范圍設置為80%～100%，進行優化，模擬預測結果，亞硒酸鈉處理蚯蚓制備蚯蚓硒的優化條件為亞硒酸鈉的硒濃度為159.758 mg/kg、亞硒酸鈉的攝入時間為49.673 min。在該條件下總硒濃度和有機硒濃度最高，為29.929、23.714 mg/kg；有機硒占比為81.825%，>80%。試驗驗證值與預測值偏差為0.265。

2.1.4 條件優化及驗證 為檢驗響應曲面法的準確性，采取上述最優參數組合進行試驗，驗證結果測得的總硒含量、有機硒含量和有機硒占比分別為28.880 mg/kg、24.330 mg/kg和84.251%，相對誤差為1.05%，驗證實際值與優化預測值能夠很好地吻合，表明了模型選擇的準確性。

2.2 蚯蚓硒在番鴨的應用研究

2.2.1 蚯蚓硒對番鴨生長性能的影響 由表3可知，與對照組相比，0.3 mg/kg酵母硒組番鴨的終末重和平均日增重均顯著降低（P<0.05）；0.5 mg/kg蚯蚓硒組番鴨的平均日增重顯著增加（P<0.05）；0.3、0.5 mg/kg蚯蚓硒組番鴨的耗料增重比均顯著降低（P<0.05）。該結果表明，酵母硒會阻礙番鴨生長性能， 而蚯蚓硒的使用能有效提高番鴨生長性能和經濟效益。

2.2.2 蚯蚓硒對番鴨肌肉硒含量的影響 由表4可知，與對照組相比，使用0.3 mg/kg酵母硒，以及0.1、0.3、0.5 mg/kg蚯蚓硒42 d后，肌肉中的硒含量均極顯著增加（P<0.01）；使用0.1 mg/kg蚯蚓硒56 d后，肌肉中的硒含量顯著增加（P<0.05）。

2.2.3 蚯蚓硒對番鴨糞便硒含量的影響 由表5可知，各組番鴨糞便中的硒含量差異均不顯著（P>0.05）。

2.2.4 蚯蚓硒對番鴨體內臟器硒含量的影響 由表6可知，56 d后，0.1、0.3、0.5 mg/kg蚯蚓硒組肝臟的硒含量均顯著低于酵母硒組（P<0.05）。

2.2.5 蚯蚓硒對番鴨免疫相關指標的影響 由表7可知，與對照組相比， 使用0.3 mg/kg酵母硒番鴨血清的白細胞介素2含量極顯著升高（P<0.01）；使用0.5 mg/kg蚯蚓硒番鴨血清的免疫球蛋白G含量顯著升高（P<0.05），腫瘤壞死因子α含量極顯著升高（P<0.01）。

3 討論

3.1 蚯蚓硒制備工藝的優化

富硒產業快速發展以來，人類缺硒問題不斷被解決，但新的高濃度硒暴露風險也隨之而來［7］。因此，硒源補充的研究不止關注硒富集量，也重視補硒方式的安全性。蚯蚓具有很強的無機硒富集和有機硒轉化能力，當其攝食無機硒后，可將無機硒基本全部轉化為有機硒［8］。有機硒毒性弱、吸收率較高、活性強、安全性好［9］。本研究發現，隨著亞硒酸鈉中硒含量的升高，蚯蚓硒中的硒水平也逐漸升高，通過軟件對試驗分析，將總硒和有機硒設置最大值，有機硒占比范圍設置為 80%～100%，[JP+2]進行優化，模擬預測結果：亞硒酸鈉處理蚯蚓制備蚯蚓硒的優化條件為亞硒酸鈉濃度 159.758 mg/kg、蚯蚓攝入亞硒酸鈉的時間為49.673 min。在該條件下總硒濃度和有機硒濃度最高，分別為29.929、23.714 mg/kg；有機硒占比為81.825%。

3.2 蚯蚓硒在番鴨中的應用研究

3.2.1 蚯蚓硒對番鴨生長性能的影響 平均日增重指的是受測畜禽在測定期中平均每天增加的重量，體現了畜禽的生長情況［10］。飼料轉化率也稱為飼料利用率，是指飼料轉化為活重的效率［11］。在番鴨生產中稱為耗料增重比， 為某一年齡段飼料消耗量與增加的體重之比［12］。耗料增重比越低表明番鴨的經濟效益越高［13］。本研究發現，蚯蚓硒的使用使番鴨的平均日增重顯著增加，耗料增重比顯著下降，該結果表明，蚯蚓硒的使用能有效提高番鴨生長性能和經濟效益。此外，酵母硒的使用顯著降低了番鴨的終末重和平均日增重，該結果表明酵母硒的使用不利于番鴨的生長發育。

3.2.2 蚯蚓硒對番鴨體內硒水平的影響 硒元素遍布動物組織器官，在機體內廣泛分布。本研究發現，在番鴨機體內各組織器官硒濃度由高到低為：肝臟>十二指腸>心臟>肌肉。此外，硒元素作為一種微量元素，若在體內沉積過多會出現中毒［14］。本研究結果表明，蚯蚓硒的使用可使硒在肝臟中的沉積量顯著低于酵母硒組，該結果表明，蚯蚓硒的使用可減少硒在肝臟中的積累，有效降低硒中毒風險。此外，研究發現，酵母硒的使用可導致硒在番鴨肝臟中顯著增加，該結果表明，酵母硒對番鴨肝臟可能有一定的損傷作用， 這可能是酵母硒導致番鴨生長性能降低的原因之一。

3.2.3 蚯蚓硒對番鴨免疫功能的影響 炎癥反應是機體對抗外界病原體等因素造成組織損傷所進行的一個正常生理反應，促炎細胞因子白細胞介素2等的含量可反映機體炎癥水平［15］。本研究發現，酵母硒的使用可使番鴨的IL-2水平顯著提高，該結果表明酵母硒的使用有可能引起機體炎癥反應，這可能是酵母硒導致番鴨56日齡體重顯著降低的原因之一，其具體機制有待進一步研究。免疫球蛋白G（IgG）是血清中免疫球蛋白的主成分，具有抗病毒、中和病毒、抗菌及免疫調節的功能［16］。腫瘤壞死因子α（TNF-α）能夠抑制腫瘤細胞，具有抗感染、調節機體免疫功能的作用［17］。因此，試驗結果中免疫球蛋白G和腫瘤壞死因子α水平的增加表明了番鴨機體免疫功能的提高，以上結果表明蚯蚓硒對番鴨的免疫功能有積極促進作用。

4 結論

蚯蚓硒有效提高了番鴨平均日增重、肌肉中的硒含量、血清中IgG和TNF-α的水平，降低了番鴨的耗料增重比。因此，本研究中制備的蚯蚓硒能夠有效提高番鴨的生長性能和免疫功能，為番鴨提供優質硒蛋白，在提高農業生產系統和醫藥中的硒水平方面具有重要的開發和應用價值。

參考文獻：

［1］王 萍，金 晶. 富硒食用菌粉對肉鴨生長性能、養分消化率及抗氧化能力的影響［J］. 中國飼料，2023（10）：134-137.

［2］李麗偉，馬夢夢，劉會超，等. 不同硒源對肉雞生長性能、組織硒含量、腸道抗氧化及菌群結構的影響［J］. 中國畜牧雜志，2024，60（2）：282-292.

［3］Yue S Z，Zhang H Q，Zhen H Y，et al. Selenium accumulation，speciation and bioaccessibility in selenium-enriched earthworm （Eisenia fetida）［J］. Microchemical Journal，2019，145：1-8.

［4］吳麗娟，雷小文，劉珍妮，等. 蚯蚓對亞硒酸鈉轉化效果的研究［J］. 江西科學，2022，40（6）：1083-1087，1101.

［5］譚東海，雷小文，劉珍妮，等. 2種飼養模式對番鴨生長和屠宰性能、肉品質的影響［J］. 江蘇農業科學，2021，49（12）：124-128.

［6］劉 軍. 富硒肥料的研制及其對韭菜生長和品質的影響［D］. 泰安：山東農業大學，2011：13-16.

［7］周旖妮，王 歡，楊景峰，等. 過量硒-L-蛋氨酸對青鳉魚胚胎的毒性作用及與氧化應激機制的關聯［J］. 生態毒理學報，2022，17（6）：365-375.

［8］劉 念. 基于牛糞為養料下蚯蚓對硒元素富集效應的影響研究［D］. 呼和浩特：內蒙古農業大學，2020：8-18.

［9］李圓澤，劉昊昆，鞏玉龍，等. 飼料中添加高劑量有機硒和無機硒對異育銀鯽生長性能、組織硒蓄積和血液生化指標的影響［J］. 水生生物學報，2023，47（5）：702-712.

［10］張 旭，姚玥州，黃 璇，等. 不同纖維原料飼糧對14～63日齡臨武鴨生長性能、屠宰性能、肉品質及血清生化和激素指標的影響［J］. 動物營養學報，2023，35（4）：2306-2315.

［11］楊寶龍. 不同飼養方式和剩余采食量對小體型肉鴨生長性能、屠宰性能及肉品質的影響［D］. 揚州：揚州大學，2022：10-20.

［12］季湛卿，郝永勝，薛又嘉，等. 包膜丁酸鈉對14～35日齡北京鴨生長性能和腸道組織形態的影響［J］. 中國畜牧雜志，2023，59（3）：259-263.

［13］陸一嘉，田 坤，谷少軒，等. 蘇氨酸對北京鴨1～14日齡生長性能和血漿生化指標的影響［J］. 中國飼料，2022（15）：69-73.

［14］周惠萍，郭定宗，楊世錦，等. 硒中毒對豬紅細胞免疫功能的影響［J］. 中國畜牧獸醫，2005，32（6）：8-10.

［15］羅鑫宇，葛超悅，呂雨杰，等. 博落回散對番鴨生長性能、肉品質、抗氧化能力及免疫性能的影響［J］. 動物營養學報，2023，35（10）：6402-6413.

［16］李雨笑，李 濤，曹 敞，等. 生物酵素對略陽烏雞生長性能、血清免疫球蛋白和盲腸微生物菌群結構的影響［J］. 中國家禽，2023，45（8）：55-62.

［17］陳婷玉，方鳳貞. 參芪薏苡仁粥介導Toll樣受體4/核因子-κB通路調控化療后大鼠血清白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α及腸道緊密連接蛋白的機制研究［J］. 中醫臨床研究，2022，14（20）：9-12.

基金項目：江西省高層次高技能領軍人才培養工程項目（編號：贛人社發〔2022〕34號）；贛州市科技計劃（編號：贛市科發〔2021〕24號、贛市科發〔2022〕31號）。

作者簡介：劉珍妮（1994—），女，福建省泉州人，碩士，畜牧師，主要從事動物營養與動物疫病研究。E-mail：746178508@qq.com。

通信作者：雷小文，碩士，副研究員，主要從事動物營養與動物疫病研究。E-mail：343224896@qq.com。