微生物菌肥對龍腦型陰香根際輕基質中微生物多樣性及功能的影響

摘要：以2年生龍腦型陰香（Cinnamomum burmannii）輕基質苗為對象，采用微生物菌肥分別處理3、6個月，用16S測序技術、qPCR芯片技術研究輕基質微生物群落結構和輕基質碳、氮、磷、硫相關功能基因表達量的變化。結果表明，施用菌肥3個月后可顯著提升陰香根際土壤微生物中某些細菌（如疣微菌門、擬桿菌門、髕骨細菌門、綠彎菌門）的相對豐度；施用菌肥6個月后可顯著提高變形菌門、酸桿菌門的相對豐度。qPCR芯片分析結果表明，施用菌肥前后碳固定、氮循環和磷循環相關基因的相對表達量顯著提升。綜上，微生物菌肥的施用能改變龍腦型陰香根際輕基質微生物的群落結構與功能，顯著提高龍腦型陰香根際輕基質氮、磷、碳相關功能基因的相對豐度，促進輕基質氮、磷、碳元素的利用，從而為陰香苗的培育提供新思路和理論基礎。

關鍵詞：陰香；微生物菌肥；α多樣性；土壤；功能基因；表達量；qPCR芯片分析

中圖分類號：S144；S792.23 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）16-0252-11

陰香［Cinnamomum burmannii （Nees et T.Nees） Blume］是樟科樟屬樹種，在我國南方地區和東南亞地區均有分布，具有觀賞、用材和藥用等諸多價值［1］。龍腦型陰香別稱梅片樹，其枝葉中富含右旋龍腦［2］。右旋龍腦的藥理功能豐富，具有消炎除腫、消炎止痛等作用［3-5］。研究發現，右旋龍腦能預防血栓的生成［6-7］，對心腦血管疾病的治療有顯著效果［5，8-12］。目前，國內天然冰片的年產量遠不能滿足市場需求［13］，市面上多用人工合成龍冰片，但人工合成冰片易產生大量有毒的異龍腦［14］，長期服用對人體危害嚴重，因而大面積推廣龍腦型陰香的種植有助于提高我國天然冰片的產量，從而減少人工合成冰片的使用。

龍腦型陰香的大規模擴繁種植離不開化肥的施用，而大量化肥的施用易導致土壤板結、重金屬富集和土壤微生物群落失衡等問題，從而降低土壤對生態系統的有益調控，降低植物的采收產量，影響林業的高質量發展［15］。微生物菌肥是含有特定微生物活體且可通過微生物活動使農作物獲得肥效的綠色肥料，近年來在經濟作物栽培中得到廣泛應用，可以通過促進有益微生物增殖、改變土壤微生物群落結構等途徑改善土壤及作物根際環境，從而促進作物生長并提高作物品質、提升作物產量［16-18］。有研究發現，使用菌肥能顯著提高林木根際土壤微生物的多樣性［19-20］，提高土壤中氮（N）、磷（P）和鉀（K）的含量及植物的生物量［21-24］。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是芽孢桿菌屬的一種革蘭氏陽性菌，其分泌物如抗菌蛋白、酚類等物質具有抑制病原真菌的功效［25-26］。有研究發現，枯草芽孢桿菌在土壤中參與溶磷、固氮等過程［27-28］。除枯草芽孢桿菌外，解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）可有效抑制植物的病原真菌、細菌、病毒，并能防御線蟲的侵擾，具備誘導植物產生抗菌、抗病毒和抗蟲的能力，從而減少植物病蟲害的發生［16］。林斌等研究發現，施用解淀粉芽孢桿菌W208YF可顯著改善土壤微生物的群落結構，促進植物對氮、磷、鉀及土壤營養的有效吸收［29］。亦有研究發現，解淀粉芽孢桿菌對玉米、小麥、番茄、西瓜等均有良好的促生作用［30］。雖然菌肥在農業種植領域應用廣泛，但在林木育種中的應用仍較少。因此，本研究以用輕基質培育的陰香幼苗為材料，施用以枯草芽孢桿菌為主、解淀粉芽孢桿菌為輔的復合菌肥，通過田間試驗研究該復合菌肥對陰香根際土壤微生物群落、輕基質肥力的影響，以期為陰香苗擴繁栽培生產應用提供新思路及理論依據。

1 材料與方法

1.1 陰香根際輕基質培育和樣本收集

田間試驗于2021年5—11月在廣東省林業科學研究院后山苗圃（113.385 68°E，23.202 18°N）開展，選取30株長勢一致、高度為60～80 cm的2年生陰香實生苗為試驗材料，將其培養于輕基質中（輕基質配方：70%～78%泥炭土、3%～10%椰糠、4%～9%珍珠巖、3%～5%磷肥、3%～8%黃泥、3%～6%火燒土）［31］。隨機選取未施肥的10株陰香，并以其根際輕基質作為對照（CK，5月），剩余陰香植株均施以菌肥，分別在施肥3個月后（處理1，8月）和6個月后（處理2，11月）隨機選擇10株陰香根際輕基質作為樣本。菌肥采用根力多微生物菌劑（含枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌），菌肥中含有效活菌數≥2億CFU/g，有機質含量≥65%，黃腐酸鉀含量≥50%（產品登記號：微生物肥2016準字1943號）。根據菌肥產品說明，每半個月對陰香苗進行施肥，每個植株施用的菌肥量為1 g，施肥后澆水。對照、各處理的樣本選取根系附著的輕基質，混合后選擇3個生物學重復，每個重復設2 g輕基質，分別裝入無菌密封袋中，于-80 ℃保存用于后續相關試驗。

1.2 輕基質微生物的高通量測序

用土壤基因組DNA提取試劑盒（ALFA-SEQ Advanced Soil DNA Kit，方舟生物安全科技廣州有限公司）提取輕基質中微生物的總DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳NanoDropOne檢測DNA的完整度、純度及濃度。用引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對抽提的DNA進行PCR擴增。按照 NEBNext UltraTMⅡDNA Library Prep Kit for Illumina（New England Biolabs，美國）的步驟進行建庫操作。用Illumina Nova 6000 平臺對擴增子的文庫進行 PE250 測序（廣東美格基因科技有限公司）。

1.3 微生物qPCR芯片檢測

獲得土壤樣品后，用DNA試劑盒（ALFA-SEQ Advanced Soil DNA Kit，方舟生物安全科技廣州有限公司）對樣品DNA進行提取。提取完成后，用Qubit 4.0（Thermo Fisher Scientific，Waltham，美國）儀器對DNA總量及純度進行檢測，確保DNA濃度統一稀釋為 20 ng/μL。將檢測合格的DNA樣品添加至384孔板的樣品板中，同時將引物（表1）和qPCR所用試劑添加至另一384 孔板中作為引物板。qPCR的條件是：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，58 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環；4 ℃保存。分別將樣品板、引物板試劑添加至高通量qPCR芯（SmartChip MyDesign Chip）的微孔中，在SmartChip Real-Time PCR System（WaferGen Biosystems，美國）中進行qPCR 反應及熒光信號檢測，并生成擴增曲線、熔解曲線。用SmartChip Real-Time PCR System（WaferGen Biosystems，美國）和Canco software v4.5軟件獲得各基因在各樣本中的熒光閾值，進行質控，質控條件如下：（1）當擴增效率<1.8或>2.2時，舍去該基因；（2）當陰性對照有擴增時，舍去該基因；（3）當CT（C表示循環數；T表示循環閾值）值大于31時，則舍去該基因在對應樣本中的CT值。

1.4 數據處理分析

用fastp（v 0.14.1，https：//github.com/OpenGene/fastp）分別對雙端原始序列數據進行滑窗質量剪裁（滑動窗口大小為4，平均質量值為20）。用Cutadapt 軟件（https：//github.com/marcelm/cutadapt/）去除引物，得到質控后的雙端測序數據，對于雙端測序數據，根據雙向測序數據之間的重疊關系，用usearch-fastq_mergepairs（v10，http：//www.drive5.com/usearch/）預設最小重疊長度為 16 bp，拼接序列的重疊區允許的最大錯配為 5 bp，過濾不符合條件的序列，獲得原始拼接序列（raw tags）。得到有效拼接片段（clean tags）后，基于Usearch（v 10.0.240）平臺，在97.0%的相似度水平下進行聚類，獲得分類操作單元（operational taxonomic unit，OTU）［33］。用UPARSE聚類法對3個樣本（對照、施肥3個月和施肥6個月）的OTU進行統計劃分并用VennDiagram軟件繪韋恩（Venn）圖［33-34］。以16S細菌數據庫SILVA為參考數據庫，使用樸素貝葉斯分類器對序列進行分類學注釋，得到序列物種分類信息（設定置信度閾值為0.8），進而在不同分類水平上分析群落結構。去除注釋為葉綠體或線粒體（16S 擴增子）及不能注釋到界級別的OTU及其序列（tags），得到各樣品最終用于分析的有效序列數及 OTU 分類學綜合信息表。基于 OTU 的豐度表，用usearch-alpha_div（v10，http：//www.drive5.com/usearch）進行多樣性指數（ACE值、Chao1指數、Simpson指數和Shannon指數）的計算，再用R語言工具繪制群落結構圖。使用STAMP中的Fisher小樣本檢驗方法進行兩兩樣本間的差異顯著性檢驗，對不同組間進行兩兩t檢驗，P<0.05表示差異顯著［35］。通過KEGG代謝途徑的組成及差異分析觀測不同處理間微生物群落的功能基因在代謝途徑上的差異和變化。文中α多樣性的數據用Excel 2010、DPS 7.05軟件進行處理和分析，通過Tukey法對不同處理下的α多樣性進行顯著性分析和多重比較［36］。

2 結果與分析

2.1 菌肥施用對陰香根際輕基質OTU數量變化的影響

在對照、施肥后3個月和施肥后6個月陰香處理組輕基質樣本中共檢測出7 843個OTU，各處理間共有的OTU數為1 069個，占OTU總數的13.63%（圖1）。對照組特有的OTU數為1 025個（占比為13.07%）；施肥3個月后，陰香根際輕基質特有的OTU數為2 140個（占比為27.29%），與對照組相比，提高了108.8%；施肥6個月后，陰香根際輕基質特有的OTU數為2 605個（占比為33.21%），與對照組相比提高了154.1%。與對照相比，隨著處理時間的增長，施用菌肥可提高陰香根際輕基質中特有的OTU數，說明施肥后陰香根際輕基質中的OTU數量變化較大。

2.2 菌肥施用對陰香根際輕基質微生物α多樣性的影響

α多樣性是反映一個區域或生態系統內豐富度、均勻度的指標。α多樣性主要由種類數量（即豐富度）和群落中個體的均勻性（即多樣性）來衡量。物種豐富度（community richness）指數包括Chao1值、ACE值等，Chao1、ACE值越大表示豐富度越高［37-38］；群落多樣性（community diversity）的指數包括Shannon指數、Simpson指數，Shannon指數越高，表明群落的多樣性越高，相反，Simpson 指數越大，說明群落的多樣性越低［39-40］。如表2所示，與對照相比，施用菌肥3、6個月后陰香根際輕基質微生物的Chao1值顯著上升，在施肥6個月后ACE值也顯著上升，說明施用菌肥有助于提高陰香根際輕基質的微生物數量。與對照相比，施肥后3個月后陰香根際輕基質的Simpson指數明顯下降，且施肥6個月后陰香根際輕基質的Simpson指數最低；與對照相比，施用菌肥后的Shannon指數顯著提高，施用菌肥6個月后的Shannon指數最高，表明施用菌肥可提高陰香根際輕基質的微生物多樣性。

2.3 菌肥施用對陰香根際輕基質群落結構的影響

在陰香根際輕基質的對照組中，優勢菌落門（相對豐度大于0.05）為變形菌門（Proteobacteria，相對豐度為0.41）、酸桿菌門（Acidobacteria，0.14）、擬桿菌門（Bacteroidetes，0.09）、髕骨細菌門（Patescibacteria，0.79）、放線菌門（Actinobacteria，0.09）、綠彎菌門（Chloroflexi，0.06）、裝甲菌門（Armatimonadetes，0.05）（圖2）。與對照相比，處理1（施肥3個月）相對豐度提高的菌門為芽單胞菌門（提高了172.73%）、髕骨細菌門（83.75%）、疣微菌門（56.80 %）、綠彎菌門（54.10%）、擬桿菌門3.19%）；相對豐度下降較明顯的細菌門為裝甲菌門（下降了57.41%）、酸桿菌門（35.46%）、放線菌門（29.03%）、變形菌門（14.60%）。與對照相比，處理2（施肥6個月）中相對豐度提升的細菌有變形菌門（提升了29.44%）、酸桿菌門（30.50%）；相對豐度下降的細菌門有擬桿菌門（下降了51.06%）、放線菌門（36.67%）、髕骨細菌門（95.57%）、綠彎菌門（14.88%）、裝甲菌門（47.81%）。與處理1相比，處理2中相對豐度提高的細菌有疣微菌門（提高了145.00%）、酸桿菌門（102.20%）、變形菌門（51.57%）；相對豐度下降的細菌門有髕骨細菌門（下降了97.28%）、擬桿菌門（52.57%）、綠彎菌門（45.21%）、放線菌門（36.36%）。施用菌肥后疣微菌門的相對豐度持續增加，而變形菌門、酸桿菌門的相對豐度呈現先降低后增加的趨勢；施用菌肥后相對豐度持續降低的細菌門有裝甲菌門、放線菌門，而擬桿菌門、綠彎菌門、髕骨細菌門的相對豐度呈現先升高后降低的趨勢。

與對照相比，施用菌肥3個月后Micropepsaceae、黃色單胞菌科（Xanthobacteraceae）、土圈菌科（Pedosphaeraceae）、芽單胞菌科（Gemmatimonadaceae）、亞硝化單胞菌科（Nitrosomonadaceae）的相對豐度均有所升高，提高幅度分別為43.62%、56.20%、173.85%、54.08%（圖3），而紅細菌科（Rhodanobacteraceae）、酸熱菌科（Acidothermaceae）、酸桿菌科亞組1（Acidobacteriaceae_subgroup_1）、纖毛單胞菌科（Fimbriimonadaceae）的相對豐度有所下降，降幅分別為85.21%、82.30%、70.54%、94.77%。施肥6個月后，與對照相比，相對豐度提高的科有黃色單胞菌科（提高327.98%）、土圈菌（提高303.31%）、亞硝化單胞菌科（提高736.73%），而相對豐度下降的科、屬有紅細菌科（下降85.21%）、酸熱菌科（下降82.30%）、酸桿菌科亞組1（下降70.54%）以及纖毛單胞菌科（下降94.77%）。與施肥3個月相比，施肥6個月能提高亞硝化單胞菌科、黃色單胞菌科、土圈菌的相對豐度，提高幅度分別為440.40%、197.13%、158.20%（圖3）。說明施用菌肥6個月可持續提高亞硝化單胞菌科、黃色單胞菌科和土圈菌的相對豐度并持續降低紅細菌科、酸熱菌科、酸桿菌科亞組1細菌的相對豐度。

2.4 土壤微生物群落基因功能分析

施用菌肥3個月后，陰香根際輕基質的碳降解相關基因拷貝數從3.59×104上升到1.11×106，增長了3 007%（圖4）；碳固定相關基因拷貝數從 1.86×105上升到4.08×106，增長了2 095%；氮循環相關基因拷貝數從1.18×105上升到5.48×106，增長了4 527%；磷循環相關基因拷貝數從2.81×104上升到1.39×106，增長了4 856%。施肥6個月后，碳降解相關基因拷貝數從3.59×104上升到1.69×106，增長了4 605%：其中碳固定相關基因拷貝數從1.86×105上升到7.57×106，增長了 3 979%；氮循環相關基因拷貝數從1.18×105上升到1.50×107，增長了12 928%；磷循環相關基因拷貝數從2.81×104上升到3.66×106，增長了 12 928%。與施肥3個月相比，施肥6個月后，碳降解相關基因拷貝數從1.11×106上升到1.69×106，增長了51.43%；碳固定相關基因拷貝數從4.08×106上升到7.57×106，增長了85.83%；氮循環相關基因拷貝數從5.48×106上升到1.50×107，增長了173.51%；磷循環相關基因拷貝數從1.39×106上升到3.66×106，增長了162.86%。由此可見，施用菌肥后微生物群體的碳代謝、碳固定、氮循環和磷循環的相關基因的數量獲得了顯著增長。

2.5 高表達功能基因的篩選

在輕基質微生物群落的諸多與碳、氮、磷、硫功能相關的基因中，acsA、rbcL、abfA、gdhA、phnK、cax、gcd、sga、pccA、nirS1、ureC、phoD、pqqC、accA、nirS2、xylA、apsA的表達量在施用菌肥3、6個月后均獲得到顯著提升，而smtA、manB、pmoA、korA、amoA1、mct、nirK3、yedZ、nosZ1、acsE的表達量在施用微生物菌肥3個月后雖得到顯著增加，但在施用微生物菌肥6個月后又逐漸減少（圖5）。盡管如此，上述基因在施用菌肥6個月后的表達量仍高于對照。由此可見，施用菌肥可提升陰香根際輕基質微生物群體中有關碳氮磷硫功能基因的表達量，促進輕基質中微生物對氮磷鉀的代謝。

3 討論

3.1 施用微生物菌肥對陰香根際輕基質微生物細菌群落的影響

根際微生物作為植物根際環境的重要組成部分，是衡量土壤肥力、土壤質量的重要指標［43］，在維持土壤結構、促進有機質分解和積累、促進養分循環、維持生態系統穩定等方面發揮著重要作用［41-42］。有研究發現，土壤微生物的多樣性越高，土壤微生物生態系統越復雜，功能就越穩定［44］。細菌不僅是土壤中數量最多、類群最大的微生物，占土壤微生物總數的70%～90%，而且具有豐富的遺傳多樣性和基因功能，能有效促進土壤有機物的分解和轉化，參與碳、氮等營養循環過程［45-47］。微生物菌肥正是利用有益微生物的特性和優點對土壤中的微生物結構進行優化，從而達到促進植物生長、提高土壤肥力等效果，最終提高土壤重要營養元素有效性的功能［48］及土壤肥力和肥料利用率，并改善土壤微生物的群落結構［49-51］。本研究施用的微生物菌肥以枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌為主。有研究發現，枯草芽孢桿菌的施用改變了煙草根際土壤微生物群落結構，增加了變形菌門數量，降低了浮霉菌門、厚壁菌門的數量［18］。同樣在煙草種植中發現，施用枯草芽孢桿菌Tpb55后，煙草土壤根際微生物群落結構發生了變化，酸桿菌門、變形菌門的豐度提高，放線菌門的豐度降低［52］。解淀粉芽孢桿菌同屬于芽孢桿菌屬，能在植物根際定植并在脅迫條件下生長，可促進植物生長，被認為是無毒且生態友好的綠色肥料［53］，被廣泛用于水稻、西瓜和煙草栽培中［54-56］。在本研究中，施用菌肥后，變形菌門、酸桿菌門的相對豐度同樣得到提高，持續降低了放線菌門的相對豐度。也有研究發現，施用枯草芽孢桿菌后，苜蓿根際土壤中變形菌門的數量減少，厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門的數量增加［57］。

在本研究中，與對照相比，施用菌肥顯著提高了陰香根際輕基質的微生物多樣性，并且施肥6個月后的陰香根際輕基質微生物多樣性更高。在門水平下，陰香根際輕基質的主要優勢細菌門為變形菌門、酸桿菌門、髕骨細菌門、放線菌門以及綠彎菌門等，這些菌群在其他作物土壤中也作為優勢種群存在［44-46］。其中，綠彎菌門對不利環境適應性強，可忍受極端的土壤環境并與其他生物競爭活性碳［58］，具有較強的競爭力［59］；而疣微菌門是參與土壤氮循環的主要微生物類群［60］，疣微菌門中存在多種多樣、連接稀疏的非核糖體肽合成酶系統，其基因簇中有合成抗生素的作用［52］。在本研究中，施用菌肥3個月后能提高綠彎菌門和疣微菌門的相對豐度；施用菌肥6個月能進一步提高疣微菌門的相對豐度，此外還提高了變形菌門、和酸桿菌門的相對豐度。變形菌門是一種富營養菌群，可在養分條件豐富的土壤環境中迅速生長繁殖，對土壤養分循環發揮重要作用［61］，有助于脂質多糖生物合成、細菌運動性和碳代謝［62］；酸桿菌門大多數屬于代謝物轉運家族具有大量的編碼轉運蛋白基因［63］，可以產生多種代謝物，分解難降解物質，參與鐵循環、單碳化合物代謝、光合作用以及在氮循環中起到還原硝酸鹽、亞硝酸鹽的作用，可能還有還原一氧化氮的作用，從而提高土壤肥力［64-67］。研究表明，酸桿菌門能在復雜環境中及寡營養條件下生存適應［68］。由此推測施用菌肥可對陰香根際輕基質的種群結構產生積極效應，增強碳、氮和磷的循環，提高氮、磷的有效性，有利于植物對營養物質的吸收。

3.2 施用微生物菌肥對陰香根際土壤功能基因數量的影響

微生物在土壤氮磷周轉中起重要作用，直接影響土壤養分含量和有效性。在自然界中，微生物形成了復雜的氮轉化網絡。土壤中的大部分有機氮都不能直接被植物吸收利用，必須在微生物的作用下分解才能被植物吸收利用［69］。微生物可以通過氮的固定、氨化、硝化、反硝化和異化性硝酸鹽還原等過程調節氮的生物有效性，影響土壤中植物可利用氮的形式［70］。微生物在固氮酶的催化作用下，將空氣中的氮氣還原成氨，從而完成固氮。脲酶（ureC）可以分解土壤中的尿素并轉化成氨，供植物吸收。在本研究中，施用菌肥后可持續增加脲酶（ureC）的拷貝數，土壤中的銨態氮在氨單加氧酶（amoA1）的作用下被氧化成羥胺，再由羥胺氧化還原酶氧化為亞硝酸鹽。有研究表明亞硝化單胞菌科細菌是氨氧化的關鍵菌［71］，在本研究中施用菌肥后，可持續提高亞硝化單胞菌科細菌的相對豐度，推測亞硝化單胞菌科相對豐度的增加可促進陰香根際輕基質微生物群落的氨氧化，以此來促進陰香根際輕基質中氮的硝化，在本研究中也觀察到施用菌肥后陰香基質中氨單加氧酶（amoA1）的表達量有所提高。除此之外，亞硝酸鹽氧化還原酶（nxr）是將亞硝酸鹽氧化為硝酸鹽完成硝化作用的重要酶［72］；硝酸鹽由硝酸鹽還原酶（nirK3、nirS1、nirS2）還原成亞硝酸鹽后再由亞硝酸還原酶進一步將亞硝酸鹽轉化為氨或一氧化氮［70］，經過微生物的驅動將植物無法吸收的有機氮轉化為銨態氮和硝態氮等植物可以直接吸收利用的無機氮。在本研究中觀察到綠彎菌門屬于陰香基質中的優勢菌門（相對豐度0.06），相比對照，施用菌肥3個月后顯著提高了綠彎菌門的相對豐度，而綠彎菌門細菌具有亞硝酸鹽氧化還原酶（nxr）［73］，本研究中也觀察到施用菌肥后，nirK3、nirS1、nirS2的表達量顯著提高，因而推測綠彎菌門細菌也可促進陰香根際輕基質中氮的硝化，與亞硝化單胞菌科細菌協同提高氮的生物有效性。

土壤中的磷循環也需要微生物的參與，土壤中很大部分的磷是無法被植物獲取的有機態磷、無機態磷［74］。微生物分泌的一部分胞外酶如磷酸酶（sga、phoD）、植酸酶等可以分解土壤中的有機磷，從而使植物獲取更多的無機磷［75］。芽孢桿菌成員能夠分泌磷酸酶、固氮酶和有機酸，通過將氮、磷的復雜形態轉化為更簡單或者現有的形態。在本研究中，與對照相比，施用生物菌肥3個月后顯著提高了芽單胞菌科細菌的相對豐度，堿性磷酸酶（phoD）、磷酸脫羧酶（sga）等相關酶的表達量也顯著提高，從而將復雜形態的氮磷轉化為植物可吸收的形態，提高了磷、氮等必需營養元素的有效性［76-77］。土壤碳循環包括植物通過呼吸作用向外釋放二氧化碳、植物對土壤養分的吸收、植物殘體有機質的分解、微生物殘體對土壤碳源的輸送和厭氧環境下通過分解作用向外釋放甲烷等過程［78］。土壤微生物也同樣參與了碳的循環，土壤微生物通過各種代謝功能產生的酶來實現碳的固定、轉化和排放。有研究發現，微生物主要通過還原性戊糖磷酸循環（卡爾文循環）、還原性檸檬酸循環（rTCA循環）、羥基丙酸-羥基丁酸循環（3-HP/4-HB循環）、二羧酸-羥基丁酸循環（DC/4-HB循環）、3-羥基丙酸雙循環（3-HP循環）和還原性乙酰輔酶A途徑6個途徑將土壤中的無機碳轉化為有機物［79-80］。還有研究發現，變形菌門、酸桿菌門和綠彎菌門參與土壤的碳循環［81］，且酸桿菌門、變形菌門中可能含有大量與碳氮磷循環過程相關的功能基因［82-84］。本研究在施用菌肥后，變形菌門、酸桿菌門和綠彎菌門細菌的相對豐度提高，推動了基質的碳循環。

4 結論

本研究在施用微生物菌肥后，陰香根際基質微生物的豐富度和多樣性提高，陰香根際基質的微生物群落結構得到改變，而微生物具有豐富的遺傳信息和功能基因，施用微生物菌肥后提升了陰香根際土壤微生物中某些細菌如變形菌門、酸桿菌門、疣微菌門、擬桿菌門、髕骨細菌門、綠彎菌門的相對豐度，從而提升了與碳、氮、磷相關功能基因的表達，促進了碳、氮和磷的循環，提高了氮、磷的有效性，有利于植物對營養物質的吸收利用。上述分析結果顯示，施用微生物菌肥可以改變陰香根際微生物的群落結構，從而促進微生物和植物之間的相互作用，促使陰香對基質營養元素的有效利用。

參考文獻：

［1］邱國俊. 觀賞與經濟兼優樹種：陰香［J］. 廣東園林，1989，11（1）：40.

［2］李毓敬，朱亮鋒，陸碧瑤，等. 天然右旋龍腦新資源：梅片樹的研究［J］. 植物學報，1987，29（5）：527-531.

［3］吳碩文，鄒本革，唐麗華，等. 氟苯尼考與天然冰片聯用體外抑菌效果研究［J］. 黑龍江畜牧獸醫，2017（8）：166-167.

［4］Wang J Y，Dong X Y，Yu Z W，et al. Borneol inhibits CD+T cells proliferation by down-regulating miR-26a and miR-142-3p to attenuate asthma［J］. International Immunopharmacology，2021，90：107223.

［5］Bansod S，Chilvery S，Saifi M A，et al. Borneol protects against cerulein-induced oxidative stress and inflammation in acute pancreatitis mice model［J］. Environmental Toxicology，2021，36（4）：530-539.

［6］林海燕，于佳寧. 冰硝散外敷配合常規方法治療下肢深靜脈血栓形成40例［J］. 江蘇中醫藥，2008，40（11）：93.

［7］劉惠潔. 冰硝散外敷治療下肢深靜脈血栓形成患肢水腫的療效觀察［J］. 中國現代醫生，2010，48（8）：127，150.

［8］肇麗梅，何曉靜，劉玉蘭. 冰片注射液對小鼠腦缺血再灌注后學習和記憶行為的影響［J］. 華西藥學雜志，2006，21（1）：60-62.

［9］倪彩霞，曾 南，茍 玲，等. 芳香開竅藥對腦缺血再灌注損傷大鼠保護作用機制的研究［J］. 中藥藥理與臨床，2011，27（5）：65-68.

［10］沈鵬英，程紹民，付絲羽，等. 醒腦靜注射液在急性腦梗死中的應用［J］. 江西中醫藥大學學報，2020，32（6）：113-115.

［11］文 靜. 開竅藥對永久性局灶性腦缺血模型大鼠神經血管單元的保護機制研究［D］. 成都：成都中醫藥大學，2017.

［12］樊亞梅，王立映，王 建，等. 3種冰片防治給藥對AMI模型大鼠的心肌保護作用［J］. 中國實驗方劑學雜志，2020，26（6）：64-72.

［13］馬 青，馬 蕊，靳保龍，等. 天然冰片資源研究進展［J］. 中國中藥雜志，2021，46（1）：57-61.

［14］尚 坤，李敬文，常美月，等. 中藥冰片藥理作用研究進展［J］. 吉林中醫藥，2018，38（4）：439-441.

［15］劉紀愛，束愛萍，劉光榮，等. 施肥影響土壤性狀和微生物組的研究進展［J］. 生物技術通報，2019，35（9）：21-28.

［16］冼康華，蘇 江，付傳明，等. 不同菌肥對華重樓根際土壤微生物多樣性及理化性質的影響［J］. 廣西科學，2021，28（6）：616-625.

［17］劉 芳，汪航飛，蒲春燕，等. 不同施肥對葡萄苗根際微生物量、土壤酶活性和生理的影響［J］. 四川農業大學學報，2023，41（2）：318-324.

［18］游 偲，張立猛，計思貴，等. 枯草芽孢桿菌菌劑對煙草根際土壤細菌群落的影響［J］. 應用生態學報，2014，25（11）：3323-3330.

［19］李 丹，黃福墩，黃銘星，等. 生物菌肥對桂花移栽苗生長的影響［J］. 森林與環境學報，2015，35（3）：261-264.

［20］孫 慧，吳中能，苗婷婷，等. 不同施肥處理對楊樹林地土壤微生物群落的影響［J］. 中國農學通報，2023，39（2）：36-43.

［21］郜春花，張 強，盧朝東，等. 選用解磷菌劑改善缺磷土壤磷素的有效性［J］. 農業工程學報，2005，21（5）：56-59.

［22］戴建軍，劉宏宇. 生物磷肥對生菜、小白菜生長及N、P、K養分積累的影響［J］. 東北農業大學學報，2001，32（3）：248-251.

［23］李保會. 復合微生物菌肥對連作草莓礦質養分吸收及產量的影響［J］. 河北農業大學學報，2007，30（3）：44-47.

［24］劉麗麗，李淑高. PK菌肥的菌種篩選及應用研究［J］. 南開大學學報（自然科學版），1994，27（3）：82-86.

［25］李 廣，李曉芬，易蘭花. 拮抗菌枯草芽孢桿菌1151及其所產抗菌肽對辣椒采后軟腐病的控制作用［J］. 食品與發酵工業，2023，49（10）：78-84.

［26］Kinsella K，Schulthess C P，Morris T F，et al. Rapid quantification of Bacillus subtilis antibiotics in the rhizosphere［J］. Soil Biology and Biochemistry，2009，41（2）：374-379.

［27］宮安東，孔憲巍，翟新可，等. 枯草芽孢桿菌WY8-7的溶磷、抑菌及促生長作用［J］. 南京農業大學學報，2019，42（4）：697-705.

［28］解玉萌，田相利，趙 坤，等. 兩株海水氮降解菌的分離鑒定及其無機氮去除特性初步研究［J］. 中國海洋大學學報（自然科學版），2019，49（增刊1）：33-44.

［29］林 斌，黃菊青，官雪芳，等. 解淀粉芽孢桿菌液體肥在茶葉上的應用研究［J］. 福建農業學報，2019，34（10）：1173-1178.

［30］李紅曉，張殿朋，盧彩鴿，等. 生防解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）最新研究進展［J］. 微生物學雜志，2016，36（2）：87-92.

［31］何波祥，曾令海，連輝明，等. 一種闊葉樹輕基質育苗的基質配方：CN104737890B［P］. 2017-12-12.

［32］Zheng B X，Zhu Y G，Sardans J，et al. QMEC：a tool for high-throughput quantitative assessment of microbial functional potential in C，N，P，and S biogeochemical cycling［J］. Science China Life Sciences，2018，61（12）：1451-1462.

［33］Edgar R C. UPARSE：highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads［J］. Nature Methods，2013，10：996-998.

［34］Chen H B，Boutros P C. VennDiagram：a package for the generation of highly-customizable Venn and Euler diagrams in R［J］. BMC Bioinformatics，2011，12：35.

［35］Parks D H，Tyson G W，Hugenholtz P，et al. STAMP：statistical analysis of taxonomic and functional profiles［J］. Bioinformatics，2014，30（21）：3123-3124.

［36］Tang Q Y，Zhang C X. Data Processing System （DPS） software with experimental design，statistical analysis and data mining developed for use in entomological research［J］. Insect Science，2013，20（2）：254-260.

［37］Causey B D. Parametric estimation of the number of classes in a population［J］. Journal of Applied Statistics，2002，29（6）：925-934.

［38］Chao A，Yang M C K. Stopping rules and estimation for recapture debugging with unequal failure rates［J］. Biometrika，1993，80（1）：193-201.

［39］Shannon C E. A mathematical theory of communication［J］. The Bell System Technical Journal，1948，27（3）：379-423.

［40］Simpson E H. Measurement of diversity［J］. Nature，1949，163：688.

［41］賀紀正，李 晶，鄭袁明. 土壤生態系統微生物多樣性-穩定性關系的思考［J］. 生物多樣性，2013，21（4）：412-421.

［42］陸雅海，傅聲雷，褚海燕，等. 全球變化背景下的土壤生物學研究進展［J］. 中國科學基金，2015，29（1）：19-24.

［43］Hermans S M，Buckley H L，Case B S，et al. Bacteria as emerging indicators of soil condition［J］. Applied and Environmental Microbiology，2016，83（1）：e02826-e02816.

［44］任嘉紅，李 浩，劉 輝，等. 吡咯伯克霍爾德氏菌JK-SH007對楊樹根際微生物數量及功能多樣性的影響［J］. 林業科學，2016，52（5）：126-133.

［45］Carini P，Marsden P J，Leff J W，et al. Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity［J］. Nature Microbiology，2016，2：16242.

［46］Maestre F T，Delgado-Baquerizo M，Jeffries T C，et al. Increasing aridity reduces soil microbial diversity and abundance in global drylands［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA，2015，112（51）：15684-15689.

［47］Tedersoo L. Correspondence：analytical flaws in a continental-scale forest soil microbial diversity study［J］. Nature Communications，2017，8：15572.

［48］Wu S C，Cao Z H，Li Z G，et al. Effects of biofertilizer containing N-fixer，P and K solubilizers and AM fungi on maize growth：a greenhouse trial［J］. Geoderma，2005，125（1/2）：155-166.

［49］Murphy D V，Stockdale E A，Brookes P C，et al. Impact of microorganisms on chemical transformations in soil［M］//Soil Biological Fertility.Dordrecht：Springer，2007：37-59.

［50］Abbass Z，Okon Y. Plant growth promotion by Azotobacter paspali in the rhizosphere［J］. Soil Biology and Biochemistry，1993，25（8）：1075-1083.

［51］陳建明，葛順峰，沙建川，等. 微生物菌肥促進蘋果花臉病植株氮素吸收和果實增產［J］. 植物營養與肥料學報，2017，23（5）：1296-1302.

［52］韓 騰，張立猛，高加明，等. 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）Tpb55灌根與煙草根圍細菌多樣性變化的相關性［J］. 微生物學報，2016，56（5）：835-845.

［53］Chen X H，Koumoutsi A，Scholz R，et al. Comparative analysis of the complete genome sequence of the plant growth-promoting bacterium Bacillus amyloliquefaciens FZB42［J］. Nature Biotechnology，2007，25：1007-1014.

［54］Saechow S，Thammasittirong A，Kittakoop P，et al. Antagonistic activity against dirty panicle rice fungal pathogens and plant growth-promoting activity of Bacillus amyloliquefaciens BAS23［J］. Journal of Microbiology and Biotechnology，2018，28（9）：1527-1535.

［55］Wu Y C，Zhou J Y，Li C G，et al. Antifungal and plant growth promotion activity of volatile organic compounds produced by Bacillus amyloliquefaciens［J］. Microbiology Open，2019，8（8）：e00813.

［56］Luo L，Zhao C Z，Wang E T，et al. Bacillus amyloliquefaciens as an excellent agent for biofertilizer and biocontrol in agriculture：an overview for its mechanisms［J］. Microbiological Research，2022，259：127016.

［57］Li Q，Xing Y N，Fu X W，et al. Biochemical mechanisms of rhizospheric Bacillus subtilis-facilitated phytoextraction by alfalfa under cadmium stress-microbial diversity and metabolomics analyses［J］. Ecotoxicology and Environmental Safety，2021，212：112016.

［58］Neilson J W，Quade J，Ortiz M，et al. Life at the hyperarid margin：novel bacterial diversity in arid soils of the Atacama Desert，Chile［J］. Extremophiles，2012，16（3）：553-566.

［59］李雨桐，劉 坤，柏宏成，等. 設施種植下不同類型土壤微生物群落的響應機制［J］. 環境影響評價，2022，44（1）：85-89，96.

［60］de Bruyn J M，Nixon L T，Fawaz M N，et al. Global biogeography and quantitative seasonal dynamics of Gemmatimonadetes in soil［J］. Applied and Environmental Microbiology，2011，77（17）：6295-6300.

［61］Fierer N，Bradford M A，Jackson R B. Toward an ecological classification of soil bacteria［J］. Ecology，2007，88（6）：1354-1364.

［62］Li W X，Zhang Y P，Mao W，et al. Functional potential differences between Firmicutes and Proteobacteria in response to manure amendment in a reclaimed soil［J］. Canadian Journal of Microbiology，2020，66（12）：689-697.

［63］Challacombe J F，Eichorst S A，Hauser L，et al. Biological consequences of ancient gene acquisition and duplication in the large genome of Candidatus Solibacter usitatus Ellin6076［J］. PLoS One，2011，6（9）：e24882.

［64］程 揚，劉子丹，沈啟斌，等. 秸稈生物炭施用對玉米根際和非根際土壤微生物群落結構的影響［J］. 生態環境學報，2018，27（10）：1870-1877.

［65］Ventura M，Canchaya C，Tauch A，et al. Genomics of Actinobacteria：tracing the evolutionary history of an ancient phylum［J］. Microbiology and Molecular Biology Reviews，2007，71（3）：495-548.

［66］Sul W J，Asuming-Brempong S，Wang Q，et al. Tropical agricultural land management influences on soil microbial communities through its effect on soil organic carbon［J］. Soil Biology and Biochemistry，2013，65：33-38.

［67］Ward N L，Challacombe J F，Janssen P H，et al. Three genomes from the Phylum Acidobacteria provide insight into the lifestyles of these microorganisms in soils［J］. Applied and Environmental Microbiology，2009，75（7）：2046-2056.

［68］Kielak A M，Barreto C C，Kowalchuk G A，et al. The ecology of acidobacteria：moving beyond genes and genomes［J］. Frontiers in Microbiology，2016，7：744.

［69］Akter M，Deroo H，de Grave E，et al. Link between paddy soil mineral nitrogen release and iron and manganese reduction examined in a rice pot growth experiment［J］. Geoderma，2018，326：9-21.

［70］Dobrovolskaya T G，Zvyagintsev D G，Chernov I Y，et al. The role of microorganisms in the ecological functions of soils［J］. Eurasian Soil Science，2015，48（9）：959-967.

［71］Cao Y B，Wang X，Zhang X Y，et al. Nitrifier denitrification dominates nitrous oxide production in composting and can be inhibited by a bioelectrochemical nitrification inhibitor［J］. Bioresource Technology，2021，341：125851.

［72］Bengtsson G，Bengtson P，Mnsson K F. Gross nitrogen mineralization-，immobilization-，and nitrification rates as a function of soil C/N ratio and microbial activity［J］. Soil Biology and Biochemistry，2003，35（1）：143-154.

［73］Kuypers M M M，Marchant H K，Kartal B. The microbial nitrogen-cycling network［J］. Nature Reviews Microbiology，2018，16：263-276.

［74］曾廣娟，馮 陽，吳 舒，等. 有機種植與常規種植蔬菜地土壤細菌群落多樣性分析［J］. 江蘇農業科學，2023，51（7）：197-205.

［75］汪香君，姜美彤，李 森，等. 玉米根際微生物氮磷轉化的功能基因組學分析［J］. 環境科學，2023，44（12）：7014-7023.

［76］Kang S M，Radhakrishnan R，Lee K E，et al. Mechanism of plant growth promotion elicited by Bacillu ssp. LKE15 in oriental melon［J］. Acta Agriculturae Scandinavica（Section B：Soil & Plant Science），2015，65（7）：637-647.

［77］Kuan K B，Othman R，Abdul Rahim K，et al. Plant growth-promoting rhizobacteria inoculation to enhance vegetative growth，nitrogen fixation and nitrogen remobilisation of maize under greenhouse conditions［J］. PLoS One，2016，11（3）：e0152478.

［78］郭俊昇，吳宇坤. 淺析影響根際土壤碳循環的相關因素［J］. 南方農業，2023，17（2）：254-257.

［79］Bar-Even A，Noor E，Milo R. A survey of carbon fixation pathways through a quantitative lens［J］. Journal of Experimental Botany，2012，63（6）：2325-2342.

［80］Berg I A. Ecological aspects of the distribution of different autotrophic CO2 fixation pathways［J］. Applied and Environmental Microbiology，2011，77（6）：1925-1936.

［81］Liu Z. Metagenomic and 13C tracing evidence for autotrophic atmospheric carbon absorption in a semiarid desert［J］. Soil Biology and Biochemistry，2018，125：156-166.

［82］于鑒蘭. 若爾蓋泥炭地土壤微生物群落結構及碳氮磷循環功能基因分布特征［D］. 雅安：四川農業大學，2022：1-95.

［83］Maier S，Kratz A M，Weber J，et al. Water-driven microbial nitrogen transformations in biological soil crusts causing atmospheric nitrous acid and nitric oxide emissions［J］. The ISME Journal，2022，16（4）：1012-1024.

［84］Yang G，Wang M，Chen H，et al. Responses of CO2 emission and pore water DOC concentration to soil warming and water table drawdown in Zoige Peatlands［J］. Atmospheric Environment，2017，152：323-329.

基金項目：廣東省林業科技創新項目（編號：2022KJCX006）。

作者簡介：江穎超（1998—），男，江西寧都人，碩士研究生，主要從事林木遺傳育種研究。E-mail：1251876369@qq.com。

通信作者：侯 晨，博士，副研究員，主要從事木本精油樹種的遺傳育種研究。E-mail：houchen@sinogaf.cn。