褪黑素預處理對擠壓綜合征大鼠海馬體中一氧化氮及其合酶的影響

【摘要】目的 探討褪黑素（MT）預處理應用于擠壓綜合征（CS）大鼠對其海馬體中一氧化氮（NO）合成及氧化應激指標的影響。方法 選取健康Sprague Dawley（SD）雄性大鼠30只，依據隨機數字表法分為空白組（10只）、對照組（10只）、褪黑素組（10只）。褪黑素組大鼠尾靜脈推注10 mL/kg體質量褪黑素溶液，空白組和對照組大鼠均無處理。給藥30 min后建立CS大鼠模型。3組大鼠均進行麻醉處理，將對照組和褪黑素組大鼠雙側后肢根部用卡式止血帶壓迫4 h后恢復血流灌注，其中空白組大鼠麻醉后不進行任何處理。

3組大鼠均飼養至再灌注4 h。比較3組大鼠再灌注4 h后海馬體中誘導性一氧化氮合酶（iNOS）和核因子-κB（NF-κB）蛋白表達、NO含量、iNOS含量、氧化應激指標水平。結果 與空白組比，再灌注4 h后，對照組和褪黑素組大鼠海馬體中的iNOS與NF-κB蛋白表達水平均升高，與對照組比，褪黑素組大鼠海馬體中的iNOS與NF-κB蛋白表達水平均降低；與空白組比，再灌注4 h后，對照組和褪黑素組大鼠的海馬體中NO與iNOS含量均升高，與對照組比，褪黑素組大鼠海馬體中NO與iNOS含量均降低；與空白組比，再灌注4 h后，對照組和褪黑素組大鼠海馬體中丙二醛（MDA）含量均增加，超氧化物歧化酶（SOD）活性均降低，與對照組比，褪黑素組大鼠海馬體中的MDA含量降低，SOD活性升高（均P<0.05）。結論 CS大鼠應用MT預處理能夠抑制其海馬體組織的氧化應激反應，并調節iNOS與NF-κB蛋白表達水平，降低iNOS的含量，抑制NO合成，減輕缺血再灌注損傷。

【關鍵詞】擠壓綜合征 ; 缺血再灌注損傷 ; 褪黑素 ; 海馬體 ; 一氧化氮 ; 氧化應激

【中圖分類號】R642 【文獻標識碼】A 【文章編號】2096-3718.2024.17.0024.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-3718.2024.17.008

擠壓綜合征（crush syndrome， CS）主要是由富含肌肉的四肢或軀干受到外界持續擠壓而引起，以酸中毒、高鉀血癥、急性腎損傷等為特點的臨床綜合征。受擠壓肢體突然解除壓迫后能夠重新獲得血液灌注，再灌注過程中會產生大量的氧自由基，引起機體氧化應激反應、炎癥反應等，造成缺血再灌注損傷（IRI）。CS對原位器官與遠隔器官都會造成損傷，若治療不及時，會引起橫紋肌溶解、急性腎損傷和多器官衰竭等，最終導致患者死亡[1]。目前，關于CS對遠隔器官造成損傷的研究主要集中于腎臟和心臟，而其他部位較少[2]。海馬體是大腦的重要結構，主要與學習、記憶、認知功能等相關，其損傷會引起認知功能障礙，這可能是CS引起腦組織損傷，導致認知功能障礙的原因。研究表明，當肌肉組織受到長期擠壓后，誘導性一氧化氮合酶（iNOS）表達水平上升，會催化一氧化氮（NO）大量合成，導致NO含量增加，從而加重IRI [3]。褪黑素（MT）是由松果體分泌的一種調節激素，具有抑制炎癥反應、清除氧自由基、抑制細胞凋亡、調節晝夜節律等作用。研究表明，MT能夠抑制iNOS表達，降低NO的含量，有效減輕細胞氧化應激反應，抑制線粒體凋亡，進而減輕IRI[4]。基于此，本研究旨在探討MT預處理應用于CS大鼠，對其海馬體中NO合成及氧化應激指標的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Sprague Dawley（SD）雄性大鼠[湖北省實驗動物研究中心，實驗動物生產許可證號：SCXK（鄂）2020-0018]，大鼠6～8周齡，平均（7.1±0.6）周；體質量220～250 g，平均（228.90±8.46） g。飼養于牡丹江醫學院實驗動物中心，在恒溫（22～26 ℃）且濕度適宜（40%～47%）的受控環境中，確保無噪音和光線干擾，同時提供充足的食物和水，以滿足其生理需求。大鼠均按清潔級標準飼養，適應性飼養1周。本研究經牡丹江醫學院動物醫學倫理委員會批準。

1.2 主要試劑與儀器 褪黑素（北京索萊寶科技有限公司，規格：1 g/瓶）；10%水合氯醛溶液（上海原葉生物科技有限公司，規格：100 mL/瓶）；二喹啉甲酸（BCA）試劑盒（碧云天生物技術有限公司）；NO測定（硝酸還原酶法）試劑盒（南京建成生物科技研究所）；丙二醛測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）；超氧化物歧化酶測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。迷你雙垂直電泳儀（北京六一生物科技有限公司，型號：DYCZ-24DN）；多功能凝膠圖像分析系統（上海天能生命科學有限公司，型號：2500R GIS）；全自動酶標儀（美國伯騰儀器有限公司，型號：Cytation5）；高速冷凍離心機（力康生物醫療科技控股有限公司，型號：Neofuge 15R）；低溫保存箱（三洋貿易株式會社，型號：MDF-436）。

1.3 研究方法

1.3.1 動物分組和干預 取健康SD雄性大鼠30只，依據隨機數字表法分為空白組（10只）、對照組（10只）、褪黑素組（10只）。取100 mg褪黑素粉末溶于4 mL無水乙醇中，利用生理鹽水稀釋至100 mL，持續電磁力攪拌至粉末完全溶解，配制成褪黑素溶液。褪黑素組大鼠于5 min內尾靜脈推注10 mL/kg體質量褪黑素溶液，空白組和對照組大鼠均無處理。給藥后30 min造模。

1.3.2 CS大鼠模型構建 空白組大鼠只進行麻醉處理，對照組和褪黑素組大鼠均進行造模處理。采用10%水合氯醛溶液以3 mL/kg體質量對每組大鼠行腹腔注射麻醉后，對照組和褪黑素組大鼠參考Murata[5]的造模方法加以改進，使用卡式止血帶對大鼠的雙后肢根部進行擠壓，壓力相當于3 kg重物，當觀察到大鼠的足趾由紅潤變為蒼白呈缺血狀，表示造模成功。對大鼠雙側后肢壓迫4 h后，松開止血帶，恢復血流灌注。再灌注4 h后，快速對3組大鼠進行斷頭取材。

1.3.3 大鼠海馬體中iNOS蛋白和核因子-κB（NF-κB）蛋白表達水平的測定 取大鼠海馬體于-80 ℃冰箱中備用，使用低溫超聲裂解，離心（4 ℃，12 000 r/min，20 min）獲取蛋白上清液。利用BCA法測定iNOS、NF-κB蛋白濃度。利用蛋白質印跡法檢測iNOS、NF-κB蛋白表達水平，蛋白樣品經加熱變性后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上；加入一抗iNOS、NF-κB（1∶500）和β-肌動蛋白（β-actin），以及標記有辣根過氧化物酶的二抗，通過化學發光法顯色，利用凝膠圖像分析系統記錄圖像。通過分析圖像中蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白/β-actin蛋白的強度比值表示目的蛋白的表達水平。

1.3.4 大鼠海馬體中NO含量的測定 將大鼠海馬體組織與生理鹽水按1 g∶9 mL的比例混合，并通過機械攪拌制成10%組織勻漿液，采用硝酸還原酶法測定勻漿液中NO的含量。取適量10 %組織勻漿液，以3 500 r/min離心10 min，取300 μL上清液。按照試劑盒說明書制備反應混合液，靜置10 min，以3 500～4 000 r/min離心15 min，取適量上清液，向其中加入顯色劑混勻，室溫靜置15 min后，在550 nm波長下使用酶標儀測定各孔的光密度（OD）值，測定NO的濃度。

1.3.5 大鼠海馬體中iNOS含量的測定 10%組織勻漿液制備方法同上文1.3.4。取0.5 mL 10%組織勻漿液于離心管，將離心管置于液氮中10 min，室溫放置，反復凍融3次。在冰浴條件下，超聲3 s，間歇4 s，共4次。離心（12 000 r/min，4 ℃，30 min）后取上清，采用酶聯免疫吸附實驗（ELISA）檢測大鼠海馬體組織中iNOS的含量。

1.3.6 大鼠海馬體組織中丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性測定 10%組織勻漿液制備方法同上文1.3.4。取適量勻漿后分別按照試劑盒說明書測定MDA含量、SOD活性。MDA含量=[（樣品管OD值－對照管OD值）/標準管OD值]×標準品濃度/勻漿液中蛋白濃度；SOD活性=[（對照管OD值－樣品管OD值）/對照管OD值]/50%×（反應液總體積/勻漿液取樣量）/勻漿液中蛋白濃度。

1.4 觀察指標 ⑴大鼠海馬體組織中iNOS蛋白與NF-κB蛋白表達水平。利用蛋白質印跡法檢測3組大鼠再灌注4 h后海馬體組織中iNOS蛋白與NF-κB蛋白表達水平。⑵大鼠海馬體中NO與iNOS含量。再灌注4 h后，采用硝酸還原酶法測定大鼠海馬體中NO含量；利用ELISA法檢測大鼠海馬體組織中的iNOS含量。⑶大鼠海馬體氧化應激指標水平。分別測定3組大鼠再灌注4 h后海馬體組織中MDA含量與SOD活性。

1.5 統計學方法 采用SPSS 26.0統計學軟件分析數據，計量資料經S-W法檢驗證實符合正態分布且方差齊，以（ x ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠海馬體組織中iNOS蛋白與NF-κB蛋白表達水平比較

與空白組比，再灌注4 h后，對照組和褪黑素組大鼠海馬體組織中的iNOS蛋白、NF-κB蛋白表達水平均升高；與對照組比，褪黑素組大鼠海馬體組織中的iNOS蛋白、NF-κB蛋白表達水平均降低，差異均有統計學意義（均P<0.05），見圖1、表1。

2.2 3組大鼠海馬體組織中NO與iNOS含量比較

與空白組比，再灌注4 h后，對照組和褪黑素組大鼠的海馬體中NO與iNOS含量均升高；與對照組比，褪黑素組大鼠海馬體中NO與iNOS含量均降低，差異均有統計學意義（均P<0.05），見表2。

2.3 3組大鼠海馬體組織MDA含量與SOD活性比較

與空白組比，再灌注4 h后，對照組和褪黑素組大鼠海馬體內MDA含量均增加，SOD活性均降低；與對照組比，褪黑素組大鼠海馬體中的MDA含量降低，SOD活性升高，差異均有統計學意義（均P<0.05），見表3。

3 討論

CS又稱為橫紋肌溶解癥，通常發生在地震、山體滑坡等自然災害和戰爭、踩踏等人為災害中，死亡率較高，是僅次于直接災害的第二大死亡原因[6]。CS治療以補液為主要措施，早期輸液可以治療高鉀血癥，預防患者休克和急性腎衰竭，但很難對IRI誘導的氧化應激反應、炎癥反應等起作用。在血液再灌注過程中，氧自由基水平升高，細胞因子和其他炎癥因子的參與，以及NO大量合成等均會加重缺血組織損傷，甚至導致器官衰竭。

MT是一種激素和自由基清除劑，主要在松果體中合成，具有多種藥理作用，包括抗炎、抗氧化、抑制細胞凋亡等。研究表明，MT可以減輕CS大鼠的氧化應激損傷，并提高大鼠的存活率[7]。MT作為活性氧清除劑，可以保護線粒體結構的完整性，抑制炎癥反應，有助于減輕血液再灌注導致的組織損傷，增加機體MT含量可能成為改善IRI的有效方法[8]。

NO作為一種重要的信號傳遞分子，參與機體多種生理反應。在病理狀態下，iNOS被激活，能夠催化NO大量合成，誘導氧化應激反應，造成腦組織損傷。NF-κB是一種核轉錄因子，被激活后可調節多種炎癥因子的表達，加重缺血組織的損傷，還可促進氧自由基的釋放，在缺血再灌注損傷過程中起著重要調節作用[9]。NF-κB是NO合成過程中的轉錄調節因子，在NO的合成過程中起著重要的作用。激活后的NF-κB會上調iNOS的表達，并誘導機體合成大量NO，可能加速神經元的損傷或死亡[10]。在本研究中，與空白組比，再灌注4 h后，對照組和褪黑素組大鼠海馬體組織中的iNOS蛋白與NF-κB蛋白表達水平均升高；與對照組比，褪黑素組大鼠海馬體組織中的iNOS蛋白與NF-κB蛋白表達水平均降低。這提示MT預處理能有效抑制大鼠海馬體中iNOS蛋白與NF-κB蛋白的表達。分析其原因可能為，CS大鼠雙側肢體解除壓迫后，血流再灌注導致炎癥因子和氧自由基大量產生，通過血液循環誘導大鼠海馬體中的NF-κB的蛋白表達，上調iNOS蛋白表達。MT可以阻斷NF-κB的轉錄過程，進而抑制其蛋白表達，并降低iNOS蛋白的表達水平[11]。

本研究結果顯示，與空白組比，再灌注4 h后，對照組和褪黑素組大鼠的海馬體中NO與iNOS含量均升高；與對照組比，褪黑素組大鼠海馬體中NO與iNOS含量均降低。這提示MT預處理可以降低大鼠海馬體中iNOS的含量。分析其原因為，iNOS是NO合成過程中的關鍵酶，在催化NO合成中發揮重要作用，而MT預處理降低大鼠海馬體中iNOS含量，影響NO合成過程，進而導致NO含量降低。

SOD是一種關鍵的抗氧化酶，能夠通過歧化反應清除細胞內的超氧自由基，其活性升高能有效減輕細胞內氧化應激反應；MDA是自由基與脂質發生氧化反應的終產物，其含量升高反映了氧化應激損傷加重。在本實驗中，與空白組比，再灌注4 h后，對照組和褪黑素組大鼠海馬體內MDA含量均增加，SOD活性均降低；與對照組比，褪黑素組大鼠海馬體中的MDA含量降低，SOD活性升高。這提示MT預處理可以減輕大鼠海馬體中的氧化應激反應程度。

綜上，MT預處理可以抑制CS大鼠海馬體內氧化應激反應，并通過下調iNOS蛋白與NF-κB蛋白表達，降低iNOS的含量來影響NO的合成，降低NO含量以減輕IRI，發揮保護海馬體組織的作用。但本研究仍存在考察指標較少、褪黑素最佳給藥劑量不明確的局限，后續應針對給藥劑量開展深入研究，并增加相應的考察指標。

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基金項目：2021年度黑龍江省省屬高等學校基本科研業務費科研項目（編號：2021-KYYWF-0511）

作者簡介：王兆宇，2021級在讀碩士生，研究方向：臨床麻醉。

通信作者：張月順，碩士研究生，主任醫師，研究方向：臨床麻醉。E-mail：zhangyueshun1968@163.com