簡化“探究抗生素對細菌的選擇作用”的實驗操作

摘 要：本文旨在探索并簡化“探究抗生素對細菌的選擇作用”的實驗操作。首先進行預實驗，探索菌種的選擇和轉接菌種條件對抑菌圈觀測的影響，然后通過正式實驗對比無菌環境和普通環境下操作實驗的結果。筆者通過分析發現，抑菌圈的大小及變化與超凈工作臺上操作的結果差異不顯著。通過對二者結果的對比和討論，以期擴大“微生物培養”實驗的開展范圍。

關鍵詞：抗生素；大腸桿菌；抑菌圈；普通實驗桌；超凈工作臺

文章編號：1003-7586（2024）06-0062-04 中圖分類號：G633.91 文獻標識碼：B

“探究抗生素對細菌的選擇作用”是人教版普通高中教科書《生物學·必修2·遺傳與進化》第6章第3節中的探究性實驗，該實驗可以幫助學生理解抗生素對細菌的選擇作用，樹立進化與適應觀，對于發展學生的科學探究素養及將知識應用于解決實際問題的科學思維具有較大價值。但很多學校由于缺乏超凈工作臺、恒溫培養箱等實驗設備而無法開展該實驗。因此本文旨在探索簡化實驗操作，讓不具備“微生物培養”實驗條件的學校也能開展該實驗。

實驗內容為：進行預實驗，包括探索菌種的選擇、轉接菌種時能否用無菌水、污染是否會影響對抑菌圈的觀測；進行正式實驗，包括超凈工作臺與普通實驗桌上操作的實驗結果的比較，以期判斷缺乏超凈工作臺和恒溫培養箱的情況下能否及如何開展該實驗。

1 實驗材料和設備

1.1 實驗菌種

大腸埃希氏菌（大腸桿菌）。

1.2 儀器設備

高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫培養箱、移液槍、一次性吸液槍頭、接種環、涂布器、培養皿、膠頭滴管、記號筆、量尺、酒精燈、鑷子、離心管。

1.3 實驗試劑

無菌水、LB固體培養基、^［1］無菌濾紙片、頭孢克肟藥敏紙片（5 μg/片）、頭孢他啶藥敏紙片（30 μg/片）、阿莫西林藥敏紙片（25 μg/片）、氧氟沙星藥敏紙片（5 μg/片）。

2 實驗原理和設計思路

2.1 實驗原理

一般情況下，一定濃度的抗生素會殺滅細菌，但變異的細菌可能產生耐藥性。在實驗室連續培養的過程中，相應抗生素耐藥細菌的比例可能會隨之增加，因此通過測量并分析抑菌圈的直徑變化，可推測細菌耐藥基因頻率的變化。

2.2 實驗設計

實驗設計思路如圖1所示。

實驗過程中簡化實驗操作：用膠頭滴管代替移液槍；用普通實驗桌代替超凈工作臺；轉接菌種使用無菌水代替液體培養基；室溫下培養代替恒溫培養箱培養。

3 實驗過程

3.1 問卷調查“藥店抗生素類藥物出售情況”

筆者走訪泉州南安梅山鎮區6家藥店，調查后進行統計分析。調查結果為：抗生素是處方藥；常1a1bc8d63355473bb94dc7b0d5f5373d見抗生素類有沙星類、青霉素類、頭孢類等；購買量較多的是氧氟沙星、阿莫西林、頭孢他啶、頭孢克肟。因此本文以這4種抗生素來開展實驗。

3.2 預實驗

3.2.1 預實驗目的

①篩選菌種：大腸桿菌、乳酸菌；②探明轉接菌種時能否用無菌水；③探索微生物污染是否會影響對抑菌圈的觀測。

3.2.2 預實驗方案

設計4組實驗：①大腸桿菌＋無菌水；②大腸桿菌＋無菌肉湯；③空白平板暴露于空氣5 min；④乳酸菌＋無菌肉湯。均置于37℃下恒溫培養3 d，每天定時觀察菌落的生長情況。

3.3 正式實驗

將超凈工作臺上的操作與普通實驗桌上的操作進行比較。

3.3.1 超凈工作臺上操作

配制培養基，對培養基等實驗用具進行高壓蒸汽滅菌處理，對超凈工作臺噴灑75%的酒精，并開啟紫外燈進行消毒后，在超凈工作臺上進行接種操作。在培養皿底部用記號筆進行劃線分區并標注，取大腸桿菌菌種用無菌水稀釋，用移液槍取200 μL的菌液涂布于平板上，在平板上放置無菌濾紙片和3個同一種抗生素的藥敏濾紙片，重復3個平板，共做了4組不同抗生素的實驗——頭孢他啶、阿莫西林、氧氟沙星、頭孢克肟，倒置在37 ℃恒溫箱中培養8～10 h。記錄抑菌圈的直徑比，后選取抑菌圈邊緣的細菌置于無菌水中，重復上述步驟，連續培養3代。

3.3.2 普通實驗桌上操作

先對普通實驗桌噴灑75%的酒精進行消毒，在培養皿底部用記號筆進行劃線分區并標注，取大腸桿菌菌種并用無菌水稀釋，用滅菌后的膠頭滴管取2滴菌液涂布于平板上，并在平板上放置無菌濾紙片和3個同一種抗生素的藥敏濾紙片，重復3個平板，共進行4組不同抗生素的實驗，之后在室溫條件下倒置培養8～10 h。測量抑菌圈的直徑并記錄，之后取抑菌圈邊緣的細菌置于無菌水中，重復上述步驟連續培養3代。

實驗結束后，將接種環、涂布器、膠頭滴管、鑷子、離心管及培養皿等用具進行滅菌，防止大腸桿菌擴散到環境中。

3.3.3 實驗結果的記錄

測量每一代大腸桿菌的抑菌圈直徑并記錄，同時與上一代進行比較，獲取差值以及抑菌圈縮小百分比。抑菌圈縮小百分比=（上一代抑菌圈直徑－當代抑菌圈直徑）/上一代抑菌圈直徑×100%。^［2］

4 實驗結果及結論

4.1 預實驗的結果如表1所示：

4.2 預實驗的結論

大腸桿菌繁殖周期短，約為8 h左右，而空氣中的雜菌、乳酸菌的繁殖周期均長于大腸桿菌。因此在72 h內，如果培養基受空氣中雜菌污染，大腸桿菌仍是優勢菌種，不影響抑菌圈的觀察。

4.3 正式實驗的結果

在普通實驗桌和超凈工作臺上操作的4種抗生素對大腸桿菌所形成的抑菌圈比較如圖2所示，其抑菌圈直徑大小的比較及前后代抑菌圈的直徑縮小值、抑菌圈縮小百分比如表2、表3所示。

4.4 正式實驗的結論

本實驗研究結果表明，不同抗生素對大腸桿菌的抑菌效果不同，普通實驗桌的結果顯示：氧氟沙星＞頭孢他啶＞頭孢克肟＞阿莫西林；超凈工作臺實驗結果顯示：頭孢他啶＞氧氟沙星＞頭孢克肟＞阿莫西林。筆者推測在普通實驗桌和超凈工作臺上操作得到的抑菌圈大小差異可能與接種的菌液量大小有關，由于膠頭滴管無法精確量取菌液，導致在兩個平臺上操作時量取的菌液量不同。大腸桿菌對不同抗生素的耐藥性存在差異，且隨抗生素使用頻率的增加，其耐藥性逐代增強。

對比結果顯示：在普通實驗桌上操作也可以得到明顯的抑菌圈，且與超凈工作臺上無菌操作得到的結果差異不大。所以具有高壓蒸汽滅菌鍋的學校就能夠開展該實驗。

5 小結與討論

大腸桿菌繁殖周期短，通常在8 h左右，該時間顯著短于空氣中雜菌的繁殖周期。因此在實施“探究抗生素對細菌的選擇作用”實驗的過程中，如果培養基受空氣中雜菌污染，大腸桿菌仍是優勢菌種，不影響對其抑菌圈的觀測。因此具有高壓蒸汽滅菌鍋的學校可以帶領學生在普通實驗桌上實施該實驗，用膠頭滴管取液，轉接菌種時用無菌水稀釋，室溫下培養即可。該實驗有助于學生理解抗生素對細菌的選擇作用，并幫助其樹立進化與適應觀。

參考文獻

［1］施大華，申定健.“探究抗生素對細菌的選擇作用”實驗拓展設計［J］.生物學教學，2020，45（11）：47-49．

［2］李毅，王秀紅.“探究多種抗生素對連續傳代細菌的選擇作用”實驗創新性設計［J］.生物學教學，2021，46（8）：63-64．