豬TGF-βⅡ型受體胞外域的表達及生物活性驗證

摘要：轉化生長因子β1Ⅱ型受體（TGFⅡR）是TGF-β家族的主要受體?，F有研究發現，TGF-β1在家畜繁殖活動中起著負調控作用，因此我們提出通過重組TGFⅡR胞外域蛋白質競爭性結合體內TGF-β1以改善家畜繁殖性能的新思路。首先，對豬TGFⅡR胞外域蛋白質編碼序列進行密碼子優化并進行人工合成，將合成的基因片段插入原核表達載體pET-32a（+）中。然后，將重組表達載體轉入BL21（DE3）表達菌株中，并篩選合適的乳糖誘導濃度、誘導時間，以獲得最高表達效率。再然后，對重組蛋白質進行純化、復性及質譜鑒定。最后，通過體外細胞試驗對重組蛋白質的生物活性進行測定。結果表明，在培養溫度為37 ℃、培養時間為8 h、乳糖誘導質量濃度為2.0 g/L的條件下，可以誘導重組蛋白質的高表達，用8 mol/L尿素對包涵體蛋白質進行溶解，再以生理鹽水為透析液透析24 h后，可以獲得純度達80％以上的重組豬TGFⅡR胞外域蛋白，用該重組蛋白質處理豬顆粒細胞后，可顯著抑制TGF-β1誘導的信號分子Smad3的磷酸化水平?？梢钥闯觯狙芯恐斜磉_的重組豬TGFⅡ R胞外域蛋白質具有較好的生物活性。研究結果可為進一步研究和開發有利于提高豬繁殖效率的產品奠定工作基礎。

關鍵詞：轉化生長因子β1Ⅱ型受體（TGFⅡR）；原核表達；TGF-β1；生物活性

中圖分類號：S828.2文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2024）07-1268-08Expression of porcine TGF-β type Ⅱ receptor in extracellular domain and validation of its biological activityZHAO Lei1，LI Hui2，QIN Shuiping3，LI Bixia2，DAI Chaohui2，ZHAO Weimin2，FU Yanfeng2，DENG Yanfei1，CHENG Jinhua2

（1.College of Animal Science and Technology， Guangxi University， Nanning 530005， China；2.Key Laboratory of Crop and Animal Integrated Farming， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Institute of Animal Science， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Protection and Utilization Platform of Agricultural Germplasm Resources in Jiangsu Province， Nanjing 210014， China；3.Guangxi Zhuang Autonomous Region Huanjiang Maonan Autonomous County Dongxing Town Agricultural Technology Extension Station， Huanjiang 547117， China）

Abstract：Transforming growth factor-β1 type Ⅱ receptor （TGFⅡR） is the main receptor of TGF-β family. Existing studies have shown that TGF-β1 plays a negative regulatory role in livestock reproduction activities. Therefore， we proposed a new idea to improve the reproductive performance of livestock by competitively binding TGF-β1 in vivo with recombinant TGFⅡR extracellular domain protein. In order to verify it， this study first optimized the codon of porcine TGFⅡ R extracellular domain and synthesized it artificially. The synthesized gene fragment was inserted into the prokaryotic expression vector pET-32a（+）. Then， the recombinant expression vector was transferred into BL21（DE3） expression strain， and suitable lactose induction concentration and induction time were screened to obtain the highest expression efficiency. The recombinant protein was purified， regenerated and identified by mass spectrometry. Finally， the bioactivity of the recombinant protein was determined by in vitro cell experiment. The results showed that the high expression of recombinant protein was induced at 37 ℃， 6 h， 2.0 g/L lactose， the inclusion body protein was dissolved by 8 mol/L urea， and the recombinant porcine TGFⅡR protein with a purity of more than 80% was obtained after dialysis with normal saline for 24 h. After treatment of porcine granulosa cells with the recombinant protein， the phosphorylation level of Smad3 induced by TGF-β1 was significantly inhibited， which indicated that the recombinant porcine TGFⅡR protein expressed in this study had good biological activity. In conclusion， this study lays a foundation for further research and development of products suitable for improving the reproductive efficiency of pigs.

Key words：transforming growth factor-β1 type Ⅱ receptor （TGFⅡR）;prokaryotic expression;TGF-β1;biological activity

轉化生長因子β1（TGF-β1）是TGF-β家族的重要成員之一[1]。在動物體內，TGF-β1可通過自分泌、旁分泌及內分泌等方式來調節細胞的增殖分化及凋亡[2-3]，因此它在維持機體正常發育和體內穩態中起著重要作用。此外，現有研究發現，TGF-β1也在調控家畜的繁殖活動中發揮重要作用。

TGF-β1調控家畜的繁殖活動可從多個方面得到體現。首先，TGF-β1可以調控類固醇激素的分泌。前人研究發現，TGF-β1濃度在卵泡液中與雌二醇濃度呈負相關，表明TGF-β1可以抑制卵泡顆粒細胞產生雌激素；體外試驗也取得了類似結果，即用TGF-β1處理體外培養的顆粒細胞可顯著抑制雌二醇的分泌[4]；TGF-β1還可抑制黃體細胞、孕酮合成主要相關基因的表達，并抑制孕酮合成[5]。其次，TGF-β1可通過抑制顆粒細胞黃體化及胞外基質的重構、抑制黃體血管形成等方式影響黃體發育[6-7]。再次，TGF-β1可以通過降低細胞活力、誘導促凋亡因子的表達來影響卵泡發育及顆粒細胞的增殖與凋亡[8]。最后，TGF-β1還可以通過抑制胎盤滋養層細胞的遷移和侵襲，使胚胎著床失敗或流產[9-11]。綜上所述，機體內TGF-β1的水平受到嚴格的調控，一旦失調會造成繁殖障礙。受到上述研究結果的啟發，我們認為TGF-β1可能是一種抑制家畜繁殖活動的因子，并提出通過抑制TGF-β1的信號轉導來改善家畜繁殖性能的新思路。

TGF-β的信號轉導依賴其分布于細胞表面的跨膜糖蛋白受體[12]。TGF-β受體分為3種（TGFBⅠ R、TGFBⅡ R和TGFBⅢ R），其中TGF-β1Ⅱ型受體（TGFⅡR）在TGF-β1信號的接收和產生中發揮著關鍵作用，即TGF-β家族配體與膜上相應的Ⅱ型受體結合并誘導其磷酸化，隨后募集I型受體形成復合物，并催化其激酶活性，隨后I型受體招募并活化下游的Smad2/3?；罨腟mad2/3與Smad4結合后形成異聚復合物并轉移至細胞核內，該異聚復合物在其他輔因子的幫助下與靶基因的啟動子結合而發揮轉錄調控作用，最終調節下游靶基因的表達[13-14]。因此，TGFⅡR是TGF-β配體的主要接收元件和信號產生元件，對TGF-β家族功能的發揮起著關鍵作用。

鑒于TGF-β1在家畜繁殖活動中的負調控作用，我們提出用重組TGF Ⅱ R胞外域蛋白質競爭性結合體內TGF-β1，以達到阻斷或降低其信號轉導的目的，最終改善家畜繁殖性能。具體而言，本研究擬用原核表達系統表達重組豬TGF Ⅱ R胞外域蛋白質，并對其進行純化和生物活性驗證，從而為進一步研究和開發適用于提高豬繁殖效率的新產品奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1菌株、質粒及試劑原核表達載體pET-32a（+）、大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）菌株購自擎科生物科技股份有限公司，質粒提取試劑盒購自北京康為世紀生物科技股份有限公司，乳糖、LB液體培養基預混粉劑、瓊脂粉、氨芐青霉素（Amp）、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液（Tris-HCl）、尿素、咪唑、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）制備試劑盒（分離膠含量為10％、12％、15％）、考馬斯亮藍染色液、生理鹽水、ddH2O、脫色液、三（2-羧乙基）膦（TCEP）、氯乙酰胺（CAA）、胰蛋白酶、肽段抽提液（ACN/formic acid）、二甲基亞砜（DMSO）、胎牛血清、75％乙醇、DMEM/F12培養基、抗生素、苯甲基磺酰氟（PMSF）蛋白抑制劑、蛋白質裂解液、5×蛋白質上樣緩沖液、限制性內切酶Bam H I和Xho I、脫脂奶粉、一抗稀釋液、加入吐溫20的Tris緩沖鹽溶液（TBST）、增強型化學發光試劑（ECL）發光液等均購自碧云天生物科技有限公司。

1.1.2Luria-Bertani（LB）培養基的配制按10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L氯化鈉的量稱取藥品并加水溶解，調節溶液的pH值至7.0，并定容至1 L，固定培養基需另加入瓊脂（總含量為20 g/L），配制好培養基后高壓滅菌。

1.1.3包涵體洗滌溶液、結合溶液按照50 mmol/L Tris-HCl、500 mmol/L NaCl、1 mol/L尿素或2 mol/L尿素或3 mol/L尿素的濃度稱取藥品并加水溶解，調節pH值至8.0，配制包涵體洗滌緩沖液。按照20 mmol/L Tris-HCl、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L咪唑、8 mol/L尿素的濃度稱取藥品并加水溶解，調節pH值至7.5，配制包涵體結合緩沖液。

1.2試驗方法

1.2.1基因合成及重組表達載體的制備用在線蛋白質跨膜結構域預測工具TMHMM 2.0對從GenBank中查詢的豬TGFⅡR氨基酸序列（編號： XP_020927152.1）進行預測，找出蛋白質的胞外域，并剔除信號肽序列。隨后對編碼胞外域的序列進行密碼子優化并進行化學合成。在5′端添加Bam H I酶切位點，在3′端添加終止密碼子、Xho I酶切位點，通Bam H I、Xho I將相應基因克隆至載體pET-32a（+）上，并通過質粒提取試劑盒獲得重組質粒pET-32a（+）-TGFⅡR備用。

1.2.2重組蛋白質的誘導表達及SDS-PAGE檢測將重組pET-32a（+）-TGFⅡR轉化至BL21（DE3）菌株中，用移液槍吸取100 μL菌液，使用涂布玻璃棒將菌液均勻涂布于LB固體培養基上，于37 ℃培養過夜。待長出單菌落后，挑取單菌落接種于添加氨芐青霉素的LB液體培養基中進行過夜擴大培養。當OD600為0.6～0.8時，加入乳糖并在搖床上誘導重組豬TGFⅡR蛋白的表達，誘導用的乳糖質量濃度梯度為0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L，誘導溫度為37 ℃。取誘導后的菌液，用PBS重懸后超聲破碎30 min，離心并收集上清液和沉淀。按照上清液∶沉淀=4∶1（體積比）加入5×蛋白質上樣緩沖液，在95 ℃、10 min條件下使其充分變性，取10 μL變性溶液進行上樣電泳。電泳結束后，用考馬斯亮藍快速染色液染色15～20 min，再用蒸餾水脫色至背景清晰。

1.2.3重組蛋白質的純化及SDS-PAGE檢測按照方法1.2.2優化的最佳誘導條件和誘導步驟進行重組豬TGFⅡR蛋白的擴大培養，將誘導好的菌液于8 000 r/min離心10 min，棄去上清液，加入PBS重懸后，用超聲波破碎儀進行破碎洗滌，參數如下：功率200 W，工作時間2 s，工作間隙2 s，共持續2 min。用超聲波進行破碎處理后對液體進行離心并收集沉淀，再重復1次PBS洗滌的步驟后，分別用1 mol/L、2 mol/L、3 mol/L包涵體洗滌溶液并重懸沉淀，再用超聲波破碎儀（功率200 W，工作時間2 s，工作間隙2 s，共持續2 min）進行破碎洗滌，離心并收集沉淀。重復上述步驟6次后，用8 mol/L尿素將包涵體溶解。

將重組豬TGFⅡR蛋白溶液裝入處理好的透析袋中，以生理鹽水作為透析液，于4 ℃透析12 h，更換1次透析液后繼續透析12 h，至尿素不再滲出，確保此時重組蛋白質處于可溶解狀態，表明已獲得純化的重組豬TGFⅡR蛋白溶液。

與此同時，收集每次尿素洗滌后的重懸溶液及純化的蛋白質樣品，按照4∶1（體積比）加入5×蛋白質上樣緩沖液，在95 ℃、10 min條件下使其充分變性，取10 μL變性后的溶液進行電泳，電泳結束后用考馬斯亮藍快速染色液染色15～20 min，再用蒸餾水脫色至背景清晰。

1.2.4質譜檢測用手術刀切割電泳凝膠上的樣品蛋白質條帶，用玻璃棒將樣品搗碎后分別加入ddH2O、脫色液、乙腈振蕩5 min，離心并去除上清液。加入三（2-羧乙基）膦（TCEP）、氯乙酰胺（CAA）于60 ℃孵育30 min，進行還原烷基化反應。加入乙腈振蕩5 min，隨后離心去除上清液，再真空抽干。按照樣品體積加入適量胰蛋白酶，于37 ℃孵育并振蕩過夜進行酶切。第2 d加入肽段抽提液（ACN/formic acid），超聲處理10 min，離心后取上清液，真空抽干。使用C18脫鹽柱脫鹽，真空抽干后于-20 ℃凍存，準備上機檢測。

1.2.5重組蛋白質生物活性的檢測從屠宰場收集形態正常的卵巢，依次在37 ℃生理鹽水溶液、75%乙醇中清洗后抽取卵泡液，離心并收集顆粒細胞，在含有10％胎牛血清、1％三抗的F12培養基中懸浮后接種于12孔板中，再將其置于37 ℃、含5％ CO2的細胞培養箱中培養。將純化的重組豬TGFⅡR蛋白過濾除菌后，與TGF-β1在培養箱中提前孵育4 h（使重組TGFⅡR蛋白與TGF-β1充分結合）。將豬顆粒細胞隨機分為對照、TGF-β1處理組、重組豬TGFⅡR蛋白處理組，重組豬TGFⅡR蛋白與TGF-β1共孵育處理組。提前將重組蛋白與TGF-β1在37 ℃培養箱中共孵育4 h，隨后對所有處理組的豬顆粒細胞同時進行加藥處理，45 min后收集細胞，提取蛋白質，每孔細胞加入120 μL含1％ PMSF的胞蛋白裂解液，于冰上裂解30 min后加入5×蛋白質上樣緩沖液，在95 ℃處理10 min，使其充分變性。

每組取10 μL蛋白質樣品上樣，經SDS-PAGE后，用半干轉移法轉移蛋白質至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用5％脫脂奶粉于室溫封閉1 h后，分別用p-Smad3、Smad3一抗于4 ℃孵育過夜，用TBST溶液洗滌后，在室溫下加入與p-Smad3、Smad3一抗對應的二抗孵育1 h，再用TBST溶液洗滌，配制并吸取適量增強型化學發光試劑（ECL）覆蓋于蛋白質條帶上，通過化學發光成像儀（LAS-4000）進行拍攝，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內參蛋白質。

2結果與分析

2.1原核表達載體的構建

GenBank中收錄的豬TGFⅡR共有567個氨基酸殘基，用TMHMM 2.0在線軟件對TGFⅡR進行跨膜結構分析，結果發現，第1～160個氨基酸屬于蛋白質的胞外域，并且第1～23個氨基酸屬于信號肽部分（圖1）。因此，我們選擇第24～159個氨基酸進行表達研究。

通過人工化學合成法合成密碼子優化后的序列，得到編碼豬TGF Ⅱ R基因的胞外域蛋白質編碼DNA片段。將該DNA片段經Bam H I、Xho I雙酶切處理后連接至同樣經過雙酶切處理的pET-32a（+）載體上，經E.coli DH5α轉化、篩選、擴增，最終獲得用于原核表達的pET-32a（+）-TGF Ⅱ R質粒。將重組質粒用Bam H I/Xho I進行雙酶切鑒定，分別得到長度為2 000 bp、5 000 bp的片段，與預期大小一致（圖2），表明質粒pET-32a（+）-TGF Ⅱ R構建成功。

2.2重組蛋白質的SDS-PAGE檢測

將重組表達載體轉化到表達菌株BL21（DE3）中，經乳糖誘導后進行SDS-PAGE分析?？捡R斯亮藍染色結果顯示，以蛋白質相對分子量為10 000～180 000的Maker作為參照，可見相對分子量約為15 000的包涵體蛋白質得到成功表達（圖3中的第2泳道）。分別用0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L乳糖對包涵體蛋白質進行誘導表達，結果發現，包涵體蛋白質表達效率最高的誘導質量濃度為2.0 g/L（圖4中的第4泳道）。當以4 h、5 h、6 h、7 h、8 h的乳糖誘導時間分別誘導蛋白質表達發現，8 h的誘導效果最佳（圖5中的第10泳道）。

2.3重組豬轉化生長因子β1Ⅱ型受體（TGFⅡR）蛋白胞外域的純化和復性對分離提取的包涵體進行多次清洗后，用8 mol/L尿素將其溶解，然后對其進行復性處理，并對復性后的蛋白質進行電泳分析。重組蛋白質的考馬斯亮藍染色結果（圖6）顯示，泳道中出現相對分子量約為15 000的蛋白質條帶，與預期相對分子量為15 000的重組豬TGFⅡR蛋白大小相符，且純度達80％以上。由此可見，本試驗獲得了純度較高且溶解度良好的重組豬TGFⅡR胞外域蛋白質。M：Marker；泳道1：純化后的重組豬TGFⅡR蛋白。

2.4重組蛋白質的質譜鑒定結果

為了證明所表達的蛋白質是豬TGFⅡR蛋白，將上述試驗中相對分子量為15 000左右的蛋白質電泳條帶切下進行質譜鑒定，并對質譜鑒定試驗得到的肽段序列進行BLAST比對分析。如圖7所示，pET-32a（+）-TGFⅡR經乳糖誘導后表達的蛋白質確實為重組豬TGFⅡR蛋白。

2.5重組TGFⅡR胞外域蛋白質的生物活性檢測

目前已知TGF-β1活性中最主要且最直觀的表現是與其受體TGFⅡR結合并催化其下游信號分子Smad2、Smad3的磷酸化。因此，要鑒定本研究制備的重組豬TGFⅡR蛋白是否具有生物活性，主要是要證明其是否能與TGF-β1結合。換言之，要證明重組豬TGFⅡR蛋白是否可以與細胞表面的天然TGFⅡR競爭性結合TGF-β1，從而抑制細胞內Smad2、Smad3的磷酸化。Western blotting檢測結果（圖8）表明，用TGF-β1處理后，豬顆粒細胞中的Smad3磷酸化水平升高；當用重組豬TGFⅡR蛋白與TGF-β1共孵育處理豬顆粒細胞時，Smad3的磷酸化水平相較于TGF-β1單獨處理顯著下降。上述研究結果表明，重組豬TGFⅡR蛋白可以與TGF-β1結合，從而影響Smad3的磷酸化水平，該重組蛋白質具有生物學活性。

3討論

TGF Ⅱ R是TGF-β家族中多個成員共用的受體，通過與TGF-β配體結合并誘導磷酸化來進行信號轉導[12]。大量研究發現，TGF Ⅱ R通過影響TGF-β信號轉導，從而在抑制腫瘤發生的過程中發揮關鍵作用。TGF Ⅱ R可以作為GA結合蛋白A （GABPA）的直接靶點而激活TGF-β信號轉導，從而發揮對腫瘤的抑制作用[15]。除了抑制腫瘤，TGF Ⅱ R還在調節顆粒細胞凋亡與女性生育能力中發揮著關鍵作用，作為去泛素酶USP9X的新底物和間接轉錄靶點，參與組成包括TGF-β信號通路在內的功能性微調節網絡[16]。TGF Ⅱ R對于顆粒細胞的作用在豬的研究中也有報道，Yang等[17]發現，TGF Ⅱ R是豬顆粒細胞凋亡的關鍵抑制因子，且TGF Ⅱ R可以作為靶點發揮作用以啟動新生小鼠卵巢中的原始卵泡發育并維持原始卵泡靜止[18]。很多研究發現，TGF Ⅱ R可以在不同物種中通過TGF-β信號轉導從而影響卵巢顆粒細胞的凋亡。因此，阻斷TGF-β信號的傳導可能是一種改善母豬卵泡發育、提高繁殖效率的有效治療手段。

然而在目前的研究中，阻斷TGF-β家族的信號轉導常用小分子抑制劑和siRNA干擾的方法[19]。小分子抑制劑作為一種化合物，雖然具有高效的特點，但在動物活體中使用時存在毒性較大、給藥繁瑣和成本較高等缺點。而siRNA干擾是目前的研究中常用的一種較為有效的方法，但是在很多時候只能進行體外細胞試驗，動物活體試驗也存在與小分子抑制劑類似的困難。鑒于此，結合前人研究結果，我們提出了利用重組TGF Ⅱ R蛋白競爭性結合體內TGF-β以阻斷家族的信號轉導的方法。目前Gao等[20]構建了人的包含抗PD-L1抗體、TGF Ⅱ R胞外域的多功能融合蛋白質，在小鼠模型中，可免疫抑制TGF-β信號轉導從而抑制腫瘤的增殖。但是，目前尚未有研究發現單獨重組豬TGF Ⅱ R蛋白的表達能夠阻斷TGF-β信號轉導，并且缺乏利用重組蛋白質進行動物試驗的相關研究。

因此，本研究構建了豬TGF Ⅱ R的原核表達載體，通過在大腸桿菌中進行表達后，提取并純化重組豬TGF Ⅱ R蛋白，并對其活性進行驗證。首先，在感受態細胞BL21DE3中轉入原核質粒，用終質量濃度為2.0 g/L的乳糖誘導，于37 ℃培養過夜以成功表達重組豬TGF Ⅱ R包涵體蛋白。表達成功后，于冰上超聲破碎細菌，離心后棄上清液，用PBS及包涵體洗滌溶液多次重懸沉淀并用超聲波洗滌沉淀，隨后用生理鹽水對沉淀進行透析處理24 h，SDS-PAGE結果顯示，蛋白質的純化效果較好，豬TGF Ⅱ R重組蛋白質的純度達80％以上，且處于穩定的可溶解狀態。通過質譜鑒定，確定所表達的蛋白質為豬TGF Ⅱ R重組蛋白質。

與真核表達系統相比，以大腸桿菌為表達載體的原核表達系統，具有成本較低、生長速度快等特點，并可在較短時間內表達出大量目的蛋白質。本研究主要實現的是重組豬TGF Ⅱ R蛋白的包涵體蛋白質表達，雖然包涵體蛋白質需要用高濃度的尿素進行變性后復性，具有步驟復雜、可能存在影響蛋白質活性及復性率的因素等問題，但是對獲得的重組豬TGF Ⅱ R蛋白在細胞水平上進行驗證發現，本研究獲得了具有生物活性的重組豬TGF Ⅱ R蛋白。

本研究成功表達了純度較高、處于穩定可溶狀態的豬重組TGFⅡR蛋白，并分為對照組、TGF-β1處理組、豬重組TGFⅡR蛋白與TGF-β1共孵育處理組、豬重組TGFⅡR蛋白處理組來進行豬顆粒細胞水平的驗證。結果顯示，豬重組TGFⅡR蛋白可以結合TGF-β1，且smad3的磷酸化水平顯著下調，表明本試驗用原核系統構建的豬重組TGFⅡR蛋白具有活性，可以競爭性阻斷TGF-β1信號來改善母豬卵泡發育，為進一步研究和開發適用于提高母豬乃至其他家畜繁殖效率的產品奠定了工作基礎。

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