糯玉米莖稈穿刺強度QTL分析與基因組選擇

摘要：莖稈穿刺強度是衡量玉米莖稈機械強度和抗倒伏能力的重要指標之一，本研究以衍生于糯玉米自交系衡白522和通系5的198個重組自交系為試驗材料，對莖稈穿刺強度進行數量性狀位點（QTL）分析和基因組選擇研究。單個環境QTL分析共檢測到4個控制糯玉米莖稈穿刺強度的QTL，每個QTL的表型變異貢獻率均小于10.00%，且僅在單個環境中被檢測到；多個環境QTL分析共檢測到8個QTL與環境互作，其加性效應總共可解釋24.64%的表型變異，加性效應與環境互作貢獻率為17.51%；上位性QTL分析共檢測到4對QTL與QTL互作，可解釋8.25%的表型變異。基因組選擇中，當訓練群體占群體總數的80%，隨機選擇500個標記即可獲得較高的預測準確性；但是根據單個環境QTL分析結果，選擇機率常用對數值排名前200的標記，即可大幅度提高基因組選擇預測準確性。

關鍵詞：糯玉米；莖稈穿刺強度；數量性狀位點；基因組選擇

中圖分類號：S513文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2024）07-1191-08QTL analysis and genomic selection of rind penetrometer resistance in waxy maizeZHANG Huimin ZHANG Shuyu SONG Xudong ZHANG Zhenliang LU Huhua CHEN Guoqing HAO Derong MAO Yuxiang SHI Mingliang XUE Lin ZHOU Guangfei

（1.Jiangsu Yanjiang Institute of Agricultural Science， Nantong 226012， China;2.Jiangsu Collaborative Innovation Centre for Modern Crop Production， Nanjing 210095， China）

Abstract：Rind penetrometer resistance （RPR） is an important index that can be used to measure mechanical strength and lodging-resistance capability of maize stalk. In this study， a total of 198 recombinant inbred lines developed from waxy maize inbred lines Hengbai 522 and Tongxi 5 were used as test materials to perform quantitative trait locus （QTL） analysis and genomic selection （GS） study of RPR. Four QTLs for waxy maize PRP were detected by individual environmental QTL analysis， and contribution rate of phenotypic variation for each QTL was below 10.00% and was detected only in individual environment. Eight QTLs were detected to interact with the environment by multiple environmental QTL analysis， the additive effect could explain a total of 24.64% phenotypic variations， and the contribution rate of interaction between additive QTL and environment was 17.51%. Four pairs of QTL-QTL interactions were detected by epistatic QTL analysis， which could explain 8.25% of the phenotypic variation. In GS， when the training population size occupied 80% of the total population size， a relatively high prediction accuracy could be obtained by selecting 500 markers randomly. However， the genome selection prediction accuracy could be significantly improved by using top 200 markers for logarithm of odds values based on QTL analysis results of individual environmental.

Key words：waxy maize；rind penetrometer resistance；QTL（quantitative trait locus）；genomic selection

倒伏是玉米生產中一種常見的現象，每年可造成5%～20%的產量損失[1]。引起玉米倒伏的原因有多種，外因主要包括強風、暴雨等惡劣天氣以及不合理的田間管理和栽培措施等，內因主要是品種自身的莖稈機械強度。提高莖稈機械強度可以有效降低倒伏率，而玉米莖稈穿刺強度是衡量莖稈機械強度的重要指標之一[2-3]。

為了獲得可用于玉米莖稈穿刺強度遺傳改良的分子標記，國內外學者利用不同的遺傳群體，鑒定到大量控制玉米莖稈穿刺強度的數量性狀位點（QTL），也證實玉米莖稈穿刺強度遺傳基礎復雜，由微效多基因控制[4-5]。Flint-Garcia等[1]于2003年首次報道了玉米莖稈穿刺強度QTL的定位，該研究利用4個F2代群體，通過6個環境表型的鑒定，檢測到36個莖稈穿刺強度QTL。Peiffer等[5]通過聯合連鎖和關聯分析，鑒定到141個與玉米莖稈穿刺強度顯著關聯的遺傳位點。Li等[6]利用2個重組自交系群體，在玉米第3染色體定位到1個莖稈穿刺強度主效QTL——qRPR3-1，通過單倍型分析，將qRPR3-1縮小至3.1 Mb的物理區間。Zhang等[7]利用多位點全基因組關聯分析，檢測到48個與玉米莖稈穿刺強度顯著關聯的遺傳位點。Zhang等[8]利用圖位克隆和關聯分析，克隆了玉米莖稈強度基因stiff1，其啟動子區有1 個27.2 kb的轉座子插入，可降低該基因表達量，導致莖稈細胞壁纖維素和木質素含量提高，進而提高玉米莖稈穿刺強度和機械強度。Xu等[9]利用候選基因關聯分析和突變體分析驗證了ZmNR2調控玉米莖稈穿刺強度的生物學功能。

傳統的分子標記輔助選擇（MAS）依賴于QTL的準確性，且對效應值較大的QTL選擇效果較好，不能有效選擇微效的QTL[10]。得益于高通量測序技術的發展，Meuwissen等[11]于2001年提出了基因組選擇（GS）的概念，即利用全基因組的標記估算育種群體中個體的育種值，根據育種值大小進行選擇。與MAS不同的是，GS不需要檢測顯著的QTL，而是利用全基因組的標記進行選擇，這樣就可以估算出所有的遺傳效應，解釋全部的遺傳變異，即便是標記微效，也能估算出來，可以大大提高選擇效率[11]。Peiffer等[5]發現在不同的遺傳群體中，對玉米莖稈穿刺強度進行GS，預測準確性存在顯著差異。Liu等[12]的研究結果表明，將與玉米莖稈穿刺強度相關的位點作為固定效應加入GS數據模型，可顯著提高預測準確性。

糯玉米是玉米傳入中國之后，在栽培種植過程中發生變異而產生的一種新類型，與普通玉米相比，其籽粒中的淀粉幾乎100%為支鏈淀粉，具有食用品質優良、營養價值豐富等特點，已成為老百姓菜籃子的重要食源[13]。抗倒性是糯玉米重要育種目標之一，然而上述研究均是以普通玉米為研究對象，對糯玉米莖稈穿刺強度的QTL分析和GS研究鮮有報道。本研究擬利用糯玉米骨干自交系衡白522×通系5衍生的重組自交系群體，在3個環境中鑒定群體的莖稈穿刺強度，檢測控制糯玉米莖稈穿刺強度的QTL，分析QTL與環境互作效應及上位性效應，并探究GS在莖稈穿刺強度遺傳改良中的應用潛力，以期為糯玉米抗倒品種的選育提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料與基因型分析

試驗材料為以衡白522和通系5為親本，采用單籽粒傳遞法，連續自交7代構建的1個包含198個家系的重組自交系群體[14]。

利用Affymetrix microarray CGMB56K SNP Array基因芯片分析雙親和重組自交系群體的基因型，獲得12 268個高質量且在雙親之間存在差異的單核苷酸多態性位點（SNP），將共分離的SNP標記視為一個bin，利用JoinMap4.0軟件，將bin作為標記，利用Kosambi算法計算標記間的遺傳距離，構建的遺傳圖譜包含2 703個bin，遺傳圖譜總長1 876.20 cM，平均遺傳距離為0.73 cM[14]。

1.2田間試驗與表型鑒定

田間試驗分別于2017年（E1）、2018年（E2）和2019年（E3）在江蘇沿江地區農業科學研究所如皋薛窯試驗基地（32°23′N，120°33′E）進行，共3個環境。每個環境的田間試驗均采用隨機區組設計，2次重復，單行區，行長3.0 m，行距0.6 m，每行種植12株。

莖稈穿刺強度測定參考Flint-Garcia等[1]的方法，在玉米授粉14 d后，每行選取長勢一致的玉米8株，利用浙江拓普儀器有限公司生產的植物莖稈強度測定儀YYD-1A，將橫截面積為1.0 mm2的測頭從莖稈的短軸方向垂直刺入地上部第三節間中部，讀取并記錄試驗數據。

1.3表型數據分析

表型數據分析采用R 4.0.2軟件（https：/www.r-project.org/）完成。利用psych包describe語言（https：//CRAN.R-project.org/package=psych）計算群體的平均值、標準差、最小值、最大值、峰度和偏度等，使用corr.test語言計算不同環境之間的相關系數；利用stats包Shapiro.test語言（https：//stat.ethz.ch/R-manual/R-patched/library/stats/）進行W測驗；利用lme4包[15]lmer語言進行方差分析。

性狀單環境廣義遺傳率計算參照公式H²=σ²/（σ²+σ²/r）×100%，多環境廣義遺傳率計算參照公式H²=σ²/（σ²+σ²/n+σ²/nr）×100%，其中σ²為基因型方差、σ²為基因型與環境互作方差、σ²為誤差方差，n為環境數，r為重復數[16]。每個家系的最佳線性無偏預測值（BLUP）采用lme4包[15]中的lmer語言估算。

1.4QTL分析

QTL分析利用QTL IciMapping 4.1軟件中的完備區間作圖法（ICIM）[17]完成，在0.05顯著性水平，通過1 000次排列，確定機率常用對數（LOD）值，其余參數為默認值。單個環境QTL分析利用BIP功能模塊中的ICIM-ADD完成，用于檢測控制莖稈穿刺強度的QTL；多個環境QTL分析利用MET功能模塊中的ICIM-ADD完成，用于檢測QTL與環境互作（QEI）；上位性QTL分析利用MET功能模塊中的ICIM-EPI完成，用于檢測QTL與QTL之間的互作（QQI）。

1.5基因組選擇

利用R 4.0.2軟件中rrBLUP包構建rrBLUP模型[18]并進行GS，預測準確性定義為預測值與真實值之間的皮爾遜相關系數[19]。

1）在訓練群體大小方面，設置不同的群體大小作為訓練群體進行GS，分別選取群體中10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%和90%的材料作為訓練群體，其余的材料作為測試群體，重復100次，標記數目為2 703個。

2）在標記密度方面，首先分別隨機選擇25個、50個、100個、200個、300個、400個、500個、600個、700個、800個、900個和1 000個標記進行GS，其次根據單環境QTL分析中每個標記的LOD值，從大到小排序，依次選取排名前25、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900和1 000的標記，群體中80%的材料作為訓練群體，其余20%的材料作為測試群體，重復100次。

2結果與分析

2.1群體表型分析

通過3個環境的表型鑒定，親本衡白522的莖稈穿刺強度顯著高于通系5的莖稈穿刺強度（表1）。不同環境下，莖稈穿刺強度具有較大的變異幅度（表1），不同基因型之間存在極顯著差異（表2），表現出豐富的遺傳變異。莖稈穿刺強度在群體中呈連續變異，偏度和峰度均介于-1.00～1.00，W值很大（P>0.05）（表1），符合正態分布，表現出數量性狀特征，適合進行QTL定位。相關性分析結果表明，莖稈穿刺強度在各環境之間呈極顯著正相關，但相關系數較小（表3），且環境方差（4.88）達到極顯著水平，基因型與環境之間存在極顯著的互作（6.74），表明莖稈穿刺強度易受環境影響。各環境中性狀的廣義遺傳率較大，均高于60.00%（表2），表明基因加性方差是表型變異的主要因素。

2.2QTL分析結果

利用單個環境QTL分析，在LOD≥3.85的條件下，檢測到4個控制糯玉米莖稈穿刺強度的QTL，分布在第2、第4、第5和第8染色體，共解釋31.63%的表型變異貢獻率（表4）。其中在E1環境下，檢測到1個QTL（qwRPR5），在E2環境下檢測到3個QTL（qwRPR2、qwRPR4和qwRPR8），在E3環境下和BLUP沒有檢測到QTL。

利用多個環境QTL分析，在LOD≥5.27的條件下，檢測到8個QEI，分布在第1、第2、第4、第5、第8和第9染色體，加性效應總共可解釋24.64%的表型變異，加性效應與環境互作貢獻率為17.51%（表5）。其中單個環境QTL分析檢測到的4個QTL均被檢測到，說明這4個QTL與環境存在顯著的互作效應。

利用上位性QTL分析，在LOD≥5.50的條件下，檢測到4對QQI，位于不同的連鎖群，包括8個遺傳位點，可解釋1.58%～2.80%的表型變異，總表型變異貢獻率為8.25%（表6）。

2.3基因組選擇結果

利用全基因組的2 703個標記，以群體中80%的材料作為訓練群體，其余20%的材料作為測試群體，重復100次，E1、E2、E3和BLUP的基因組選擇預測準確性分別為0.15、0.14、0.21和0.22（圖1a），其標記效應呈正態分布（圖1b）。不同環境中基因組選擇預測準確性結果顯示，E1和E2的基因組選擇預測準確性之間沒有顯著差異，E3和BLUP的基因組選擇預測準確性之間沒有顯著差異，E1、E2與E3、BLUP的基因組選擇預測準確性之間存在顯著差異（圖1a），說明環境對GS預測準確性有一定的影響。盡管E3和BLUP在單環境QTL分析中沒有檢測到QTL，但其GS預測準確性顯著高于E1和E2中的GS預測準確性（圖1a），可能由于較嚴格的閾值，致使E3和BLUP中丟失的真實微效位點多于E1和E2中丟失的真實微效位點。利用3個環境的BLUP值作為表型值進行GS，預測準確性均高于利用單個環境的表型值進行GS，因此后續分析中均利用群體的BLUP值作為表型進行GS。

在訓練群體大小方面，隨著訓練群體占比逐漸增大，GS預測準確性也逐漸提高。當訓練群體數占群體總數的比例由10%增加到70%時，預測準確性緩慢提高，由0.10上升到0.18，當訓練群體比例為80%時，預測準確性上升到0.22，當訓練群體比例為90%時，預測準確性為0.23（圖2）。

在標記密度方面，當隨機選取的標記密度從25個增加到200個時，預測準確性快速提高，由0.11上升到0.18，當隨機選擇500個標記時，預測準確性為0.20，接近利用2 703個標記的預測準確性（0.22），之后隨著標記密度的增加，預測準確性處于一個穩定水平（圖3）。當根據LOD值大小選擇標記時，預測準確性顯著高于隨機選擇相同數目標記的預測準確性（圖3）。當選擇排名前200的標記時，預測準確性為0.37，與利用全基因組標記得到的結果相比大幅度提高，但之后隨著標記密度的增加，預測準確性處于一個下降的趨勢（圖3）。

3討論

本研究在單環境QTL分析中，僅在E1 和E2中分別檢測到1個和3個控制糯玉米莖稈穿刺強度的QTL，而E3和BLUP中沒有檢測到QTL。第1個可能的原因是，較嚴格的閾值（3.85）造成了某些微效位點丟失[20]。當閾值取常用的2.50時，E1有2個QTL，E2有3個QTL，反而E3有6個QTL，BLUP有4個QTL。但如此低的閾值，會增加第一類錯誤發生的概率。因此，為檢測到一定數量可靠的QTL，并降低假陽性率，盡管E3和BLUP中沒有檢測到QTL，本研究仍選擇3.85作為閾值。與前期研究相比，本研究檢測到的4個QTL均有報道。qwRPR2與Meng等[21]利用Zheng58×Chang7-2組配的雙單倍體群體檢測到的1個QTL位置重合，qwRPR4的物理位置與pQTL4-1相距0.5 Mb[12]，qwRPR5區間內包含Peiffer等[5]檢測到的8個SNP和Zhang等[7]檢測到的2個SNP，且與pQTL5-1區間重合[12]，qwRPR8與qRPR8區間重合[22]。

第2個可能的原因是，QTL與環境互作，即某一QTL僅在特定環境下表達，在其他環境下不表達，或在某些環境下表達強烈，而在其他環境下表達較弱，或在不同環境中的表現相反[23-24]。本研究利用多環境QTL分析，檢測到8個QEI，其加性效應的表型變異總貢獻率僅比加性效應與環境互作總貢獻率高7.13個百分點。其中4個QEI與單環境QTL分析結果的位置重疊，而這4個QTL在單環境分析中僅在1個環境中被檢測到，且有2個QTL（qRPR2和qRPR4）與環境互作貢獻率大于其加性效應貢獻率，表明盡管本群體中莖稈穿刺強度具有較高的廣義遺傳率，QTL與環境互作對表型變異也具有重要作用。

上位性效應是指非等位基因間相互作用引起的效應[25]。前期研究結果表明，上位性效應對玉米莖稈穿刺強度具有重要作用[1]。本研究利用上位性QTL分析，檢測到4對QQI，共可解釋8.25%的表型變異，僅約為加性效應表型變異貢獻率的1/3（24.64%），說明本群體中上位性效應對表型變異的影響較小。

GS是隨著現代測序技術發展而來的、一種利用覆蓋全基因組高密度分子標記進行預測的育種方法，比較適合由微效多基因控制的復雜數量性狀的遺傳改良[11]。與MAS相比，GS不需要檢測主效QTL，但其預測準確性受多種因素影響，其中包括群體大小和標記密度[26]。在研究群體大小對預測準確性的影響時，通常會考慮訓練群體與測試群體規模比例。本研究發現，當訓練群體的個體數目是測試群體的4.0倍時，預測準確性達到最大值。該結果與前人的研究結果有所不同，Guo等[27] 研究玉米籽粒鋅含量時發現，當訓練群體與測試群體大小一樣時，預測準確性達到最大值，而Liu等[28]對玉米株型、產量等相關性狀進行GS時，發現當訓練群體大小是測試群體的3.0倍時，可實現最高水平的預測。這種情況可能是使用群體大小和目標性狀不同導致的。

GS的基本原理是假設所有分子標記中至少有1個標記與所有控制目標性狀的QTL/基因處于連鎖不平衡狀態[11]，通過提高標記密度可以確保功能標記被充分覆蓋，進而提高預測準確性。本研究結果表明，當隨機選擇500個標記時，預測準確性與利用全基因組標記得到的結果接近，這與利用雙親群體對玉米穗腐病[29]、雄穗相關性狀[30]GS的結果相似。根據QTL分析結果，選擇與莖稈強度相關的標記，可以顯著提高預測準確性，尤其是選擇排名前200的標記，預測準確性較利用全基因組標記得到的結果顯著提高，但之后隨著標記密度的增加，預測準確性不升反降。在玉米穗行數GS分析中也得到了相似的結果[31]。上述結果說明，一方面通過增加標記密度可以提高預測準確性，選擇與莖稈強度相關的標記，可以在較少的標記密度下，實現較高水平的預測；另一方面若是標記數目太多，可能因為標記的隨機效應，影響預測準確性。因此，利用QTL定位或全基因組關聯分析結果，選擇適當的標記數目，可以在提高預測準確性的同時，降低檢測成本。

參考文獻：

[1]FLINT-GARCIA S A， JAMPATONG C， DARRAH L L， et al. Quantitative trait locus analysis of stalk strength in four maize populations[J]. Crop Science，2003，43（1）：13-22.

[2]KAMRAN M， CUI W， AHMAD I， et al. Effect of paclobutrazol， a potential growth regulator on stalk mechanical strength， lignin accumulation and its relation with lodging resistance of maize[J]. Plant Growth Regulation，2018，84（2）：317-332.

[3]豐光，黃長玲，邢錦豐. 玉米抗倒伏的研究進展[J]. 作物雜志，2008（4）：12-14.

[4]王夏青，宋偉，張如養，等. 玉米莖稈抗倒伏遺傳的研究進展[J]. 中國農業科學，2021，54（11）：2261-2272.

[5]PEIFFER J A， FLINT-GARCIA S A， DE LEON N， et al. The genetic architecture of maize stalk strength[J]. PLoS One，2013，8（6）：e67066.

[6]LI K， YAN J B， LI J S， et al. Genetic architecture of rind penetrometer resistance in two maize recombinant inbred line populations[J]. BMC Plant Biology，2014，14：152.

[7]ZHANG Y L， LIU P， ZHANG X X， et al. Multi-locus genome-wide association study reveals the genetic architecture of stalk lodging resistance-related traits in maize[J]. Frontiers in Plant Science，2018，9：611.

[8]ZHANG Z H， ZHANG X， LIN Z L， et al. A large transposon insertion in the stiff1 promoter increases stalk strength in maize[J]. The Plant Cell，2020，32（1）：152-165.

[9]XU S H， TANG X， ZHANG X M， et al. Genome-wide association study identifies novel candidate loci or genes affecting stalk strength in maize[J]. The Crop Journal，2023，11（1）：220-227.

[10]NAKAYA A， ISOBE S N. Will genomic selection be a practical method for plant breeding？[J]. Annals of Botany，2012，110（6）：1303-1316.

[11]MEUWISSEN T H E， HAYES B J， GODDARD M E. Prediction of total genetic value using genome-wide dense markers maps[J]. Genetics，2001，157：1819-1829.

[12]LIU X G， HU X J， LI K， et al. Genetic mapping and genomic selection for maize stalk strength[J]. BMC Plant Biology，2020，20（1）：196.

[13]趙久然，盧柏山，史亞興，等. 我國糯玉米育種及產業發展動態[J]. 玉米科學，2016，24（4）：67-71.

[14]HAO D R， XUE L， YUAN J H， et al. Genetic dissection of starch paste viscosity characteristics in waxy maize revealed by high-density SNPs in a recombinant inbred line population[J]. Molecular Breeding，2017，37：50.

[15]BATES D， MCHLER M， BOLKER B， et al. Fitting linear mixed-effects models using lme4[J]. Journal of Statistical Software，2014，67：1-48.

[16]KNAPP S J， STROUP W W， ROSS W M. Exact confidence intervals for heritability on a progeny mean basis1[J]. Crop Science，1985，25：192-194.

[17]MENG L H， LI H， ZHANG L Y， et al. QTL icTGmpJJ255PdjGc0caTYcJQ==iMapping：integrated software for genetic linkage map construction and quantitative trait locus mapping in biparental populations[J]. The Crop Journal，2015，3（3）：269-283.

[18]ENDELMAN J B. Ridge regression and other kernels for genomic selection with R package rrBLUP[J]. The Plant Genome，2011，4（3）：250-255.

[19]CROSSA J， PEREZ P， HICKEY J， et al. Genomic prediction in CIMMYT maize and wheat breeding programs[J]. Heredity （Edinb），2014，112（1）：48-60.

[20]ZHOU G F， MAO Y X， XUE L， et al. Genetic dissection of husk number and length across multiple environments and fine-mapping of a major-effect QTL for husk number in maize （Zea mays L.）[J]. The Crop Journal，2020，8（6）：1071-1080.

[21]MENG Y J， LI J H， LIU J J， et al. Ploidy effect and genetic architecture exploration of stalk traits using DH and its corresponding haploid populations in maize[J]. BMC Plant Biol，2016，16：50.

[22]HU H X， MENG Y J， WANG H W， et al. Identifying quantitative trait loci and determining closely related stalk traits for rind penetrometer resistance in a high-oil maize population[J]. Theoretical and Applied Genetics，2012，124（8）：1439-1447.

[23]LI Z K， YU S B， LAFITTE H R， et al. QTL x environment interactions in rice. I. heading date and plant height[J]. Theoretical and Applied Genetics，2003，108（1）：141-153.

[24]JANSEN R C， VAN OOIJEN J W， STAM P， et al. Genotype-by-environment interaction in genetic mapping of multiple quantitative trait loci[J]. Theoretical and Applied Genetics，1995，91：33-37.

[25]BATESON W. The progress of genetics since the rediscovery of Mendel’s papers[J]. Progress Rei Botanicae，1906，1：368.

[26]XU Y B， LIU X G， FU J J， et al. Enhancing genetic gain through genomic selection：from livestock to plants[J]. Plant Communication，2020，1（1）：100005.

[27]GUO R， DHLIWAYO T， MAGETO E K， et al. Genomic prediction of kernel zinc concentration in multiple maize populations using genotyping-by-sequencing and repeat amplification sequencing markers[J]. Frontiers in Plant Science，2020，11：534.

[28]LIU X G， WANG H W， WANG H， et al. Factors affecting genomic selection revealed by empirical evidence in maize[J]. The Crop Journal，2018，6（4）：341-352.

[29]周廣飛，高夕全. 玉米禾谷鐮孢菌穗腐病抗性基因組選擇研究[J]. 江蘇農業科學，2023，51（14）：65-70.

[30]許加波，吳鵬昊，黃博文，等. 利用F2：3家系來源單倍體定位玉米雄穗相關性狀QTL及全基因組選擇[J]. 作物學報，2023，49（3）：622-633.

[31]LIU L， DU Y F， HUO D A， et al. Genetic architecture of maize kernel row number and whole genome prediction[J]. Theoretical and Applied Genetics，2015，128（11）：2243-2254.

（責任編輯：陳海霞）