Fe3+對泥鰍腦組織AChE活性的影響

李會+付崇羅+張亮

摘要：以泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）為材料，比較了腦、腸、肝臟和胰臟的乙酰膽堿酯酶（Acetylcholin

esterase，AChE）活性，然后采用體內(nèi)染毒的方法，研究Fe3+對腦組織AChE活性的影響。結(jié)果表明，1%組織勻漿液中，腦、腸、肝臟、胰臟組織中AChE活性分別是1.42、0.35、0.06、0.15 U/mg；14 d后，與對照組相比，在60 mg/L Fe3+溶液中，泥鰍腦組織中AChE活性顯著降低（P<0.05），表明Fe3+對泥鰍具有神經(jīng)毒性。

關(guān)鍵詞：Fe3+；泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）；乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）活性；神經(jīng)毒性

中圖分類號：S966.4；X592文獻標(biāo)識碼：A文章編號：0439-8114（2014）10-2373-03

Effects of Fe3+ on the AChE Activity of Loach Brain

LI Hui，F(xiàn)U Chong-luo，ZHANG Liang

（College of Life Sciences，Liaocheng University，Liaocheng252059，Shandong，China）

Abstract： The activity of acetylcholinesterase（AChE）of brain，intestine，liver and pancreas in loach（Misgurnus anguillicaudatus）was compared. Effects of Fe3+ on AChE of loach brain was studied in vivo. The results showed that the activity of AChE of brain，intestine，liver and pancreas was 1.42、0.35、0.06、0.15 U/mg，respectively. Compared with control，AchE activity in the brain was significantly decreased（P<0.05） after 14 days under 60 mg/L Fe3+. It is indicated that Fe3+ might have a neural toxicity on loach.

Key words： Fe3+； loach（Misgurnus anguillicaudatus）； acetylcholinesterase（AChE） activity； neural toxicity

基金項目：山東省中青年科學(xué)家科研獎勵基金項目（2006BS03057）

隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，包括鐵在內(nèi)的重金屬污染物通過多種途徑釋放進入水體。高濃度的鐵離子對魚類有毒害作用，影響其生長、擾亂正常生命活動、破壞氧化抗氧化平衡、降低免疫力，嚴(yán)重時甚至引起魚類的死亡。水體中按1∶1比例添加硫酸亞鐵和氯化亞鐵（總鐵濃度為5 mg/L）會導(dǎo)致鮭魚（Oncorhynchus keta）血液紅細胞數(shù)和血糖含量升高，并使紅細胞比容積和血清中兒茶酚胺的含量降低[1]；陳玉明等[2]研究發(fā)現(xiàn)60 mol/L的Fe2+溶液明顯影響泥鰍的精子活力。乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinestera

-se，AChE）是一個經(jīng)典的毒理指標(biāo)，常用于評價水體中有機磷農(nóng)藥的毒性。20世紀(jì)50年代末，Weiss[3]提出用魚腦組織中或無脊椎動物的AChE活力受抑制程度來檢測水環(huán)境中極低濃度的有機磷殺蟲劑。目前，國內(nèi)外在這方面展開了大量的研究[4-6]，但以AChE指示重金屬離子污染的研究報道較少。本研究以泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）為材料，對不同組織中的AChE活性及Fe3+對泥鰍腦組織中AChE活性的影響進行了研究，為進一步了解Fe3+對淡水魚的神經(jīng)毒性作用提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗用泥鰍購自于聊城市交運大市場，運回實驗室后，先在10 mg/L的KMnO4溶液中浸泡10 min殺菌消毒，在玻璃缸（60 cm×35 cm×35 cm）內(nèi)飼養(yǎng)兩周后用于試驗。試驗用水為曝氣3 d以上的自來水，連續(xù)充氣，每天換約1/5體積的水。

1.2試驗試劑

試驗用FeCl3等化學(xué)試劑均為分析純，購自于南京南奧科技有限公司；AChE測定試劑盒、考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。試驗前先配制6 g/L含F(xiàn)e3+的母液，4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3試驗分組

配制終濃度分別為0.03、6.00和60.00 mg/L的Fe3+溶液，每1個濃度梯度為1個處理，每組飼養(yǎng)泥鰍18尾，飼養(yǎng)14 d進行檢測。另設(shè)不含F(xiàn)e3+溶液為對照。

1.4腦組織勻漿液的制備

每組取5尾泥鰍，用剪刀將魚頭背面剪開，剝開頭頂骨，用鑷子取出腦組織，放入表面皿中稱重；用預(yù)冷的含1% Triton X-100的磷酸鹽緩沖液（pH 8.0，100 mmol/L）冰浴條件下勻漿，勻漿比（m/V）為1∶9，制成10%的腦勻漿液；在4 ℃、4 000 r/min離心15 min，取上清液，即酶提取液，按1∶9（V/V）稀釋成1%腦組織勻漿液，在4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5AChE活性的測定

AChE活性的測定按試劑盒說明書進行操作，3次重復(fù)。

1.6統(tǒng)計分析

所得數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用Excel和SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，采用t檢驗進行差異顯著性檢驗，P<0.05表示顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1泥鰍不同組織中AChE的活性

1%組織勻漿液中，腦、腸、肝臟、胰臟組織中的AChE活性分別是1.42、0.35、0.06、0.15 U/mg。由圖1可知，4種組織中AChE的活性大小順序為腦、腸、胰臟、肝臟。

2.2不同F(xiàn)e3+濃度對泥鰍腦組織中AChE活性的影響

分別將泥鰍暴露在含0.03、6.00和60.00 mg/L的Fe3+濃度中14 d后測得1%腦組織勻漿液的AChE活性分別是1.47、1.48和0.84 U/mg，對照組AChE活性為1.42 U/mg。由圖2可知，僅在含F(xiàn)e3+高濃度組（60 mg/L），同對照組相比，AChE活性有顯著降低（P<0.05）。

3小結(jié)與討論

AChE是一種由蛋白質(zhì)分子構(gòu)成的生物催化劑，主要功能是將神經(jīng)系統(tǒng)突觸部位傳導(dǎo)神經(jīng)興奮的化學(xué)物質(zhì)乙酰膽堿迅速水解為乙酸和膽堿，以維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常生理功能，其在魚類體內(nèi)的分布與組織神經(jīng)活動的強弱有關(guān)。在大鼠中，肝臟與腦組織中的AChE活性分別為1.1和1.0 μmol/mL，兩者差別不大[7]；本研究中發(fā)現(xiàn)在泥鰍腦、腸、肝臟和胰臟等組織中都有AChE存在，但其活性有較大差異，腦組織中AChE活性遠高于其他組織，這種差異可能與AChE的不同來源有關(guān)。

研究表明，有機磷農(nóng)藥和重金屬等污染物對AChE活性具有抑制作用[8-10]。Lionetto等[11]發(fā)現(xiàn)工業(yè)區(qū)和港區(qū)紫貽貝（Mytilus galloprovincialis）和紅山羊魚（Mullus barbatus）體內(nèi)AChE活性減少，以此推測除殺蟲劑外，水中重金屬具有抑制AChE活性的作用。賈秀英等[12]研究了Cd2+、Cr6+單一及復(fù)合污染對鯽魚腦組織AChE活性的影響，發(fā)現(xiàn)隨著重金屬脅迫濃度的增加以及染毒時間的延長，鯽魚腦組織AChE活性下降；相似抑制現(xiàn)象也出現(xiàn)在對白氏文昌魚中，鎘和鋅對AChE活性的抑制率分別達65%和79%[13]。在本研究中，60 mg/L的Fe3+明顯抑制了泥鰍腦組織中AChE的活性，可見重金屬對淡水魚的神經(jīng)毒性并不是孤立事件，其相關(guān)研究需廣泛開展。

AChE的活性中心由酯解部位、陰離子部位和疏水性區(qū)域3個主要部分成，其中酯解部位含有絲氨酸和組氨酸[14]。關(guān)于重金屬對AChE抑制機理，一般認(rèn)為重金屬暴露引起有機體AChE活性降低的原因一方面可能是重金屬共價結(jié)合乙酰膽堿酯酶活性位點的絲氨酸，導(dǎo)致酶的活性喪失；另一方面可能是由于酶中大量巰基與重金屬結(jié)合引起空間構(gòu)象變化，從而間接引起酶活性降低[15]。盡管這些假說能夠解釋重金屬對AChE活性的抑制現(xiàn)象，但需要更多的直接證據(jù)來支持這些假說。

參考文獻：

[1] LAPPIVAARA J，MARTTINEN S. Effects of waterborne iron overload and simulated winter conditions on acute physiological stress response of whitefish，Coregonus lavaretus[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety，2005，60（2）：157-168.

[2] 陳玉明，陳杰，王曰文，等. Fe2+對雄性泥鰍生殖毒性的研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，50（7）：1444-1447.

[3] WEISS C M. The determination of cholinesterase in the brain tissue of three species of fresh water fish and its inactivation in vivo[J].Ecology，1958，39（2）：194-199.

[4] HARTAD M. Relationships between behavior and inhibition of acetylcholinesterase in birds exposed to organophosphorus pesticides[J]. Environmental Toxicology and Chemistry，1993，12（2）：321-336.

[5] 穆大剛，孟范平，朱小山，等. 海魚AChE監(jiān)測海水有機磷農(nóng)藥的可行性研究[J]. 海洋湖沼通報，2004（1）：68-73.

[6] 程燕，周軍英，韓志華，等. 二嗪磷對鳥類腦組織乙酰膽堿酯酶活性的影響[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報，2010，3（2）：149-154.

[7] 宋世震，彭曉武，范麗蓉. 孕期錳染毒對仔鼠腦、肝AChE的影響[J]. 武漢科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2004，27（1）：84-86.

[8] 劉曉宇，郝強，吳謀成，等. 鯽魚腦乙酰膽堿酯酶（AChE）的活性測定及對有機磷農(nóng)藥的敏感性研究[J]. 食品科學(xué)，2006，27（12）：71-74.

[9] 趙順順，孟范平，王震宇，等. 監(jiān)測水體重金屬污染的分子生物標(biāo)志物研究進展[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報，2010，19（2）：453-458.

[10] 李少南，謝顯傳，譚亞軍，等. 三唑磷對麥穗魚腦組織中乙酰膽堿酯酶的誘導(dǎo)[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報，2005，7（1）：59-62.

[11] LIONETTO M G，CARICATO R，GIORDANO M E，et al. Integrated use of biomarkers （acetylcholinesterase and antioxidant enzymes activities） in Mytilus galloprovincialis and Mullus barbatus in an Italian coastal marine area[J]. Marine Pollution Bulletin，2003，46（3）：324-330.

[12] 賈秀英，董愛華. Cd、Cr（Ⅵ）及其復(fù)合污染對鯽魚腦組織乙酰膽堿酯酶活性的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2003，22（3）：337-339.

[13] 盧斌，柯才煥，王文雄. 低濃度鎘、鋅暴露對白氏文昌魚的毒性累積及其幾種重要酶活性的影響[J]. 廈門大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2012，51（4）：767-773.

[14] 何東海，孟范平，朱小山. 有機磷農(nóng)藥對海洋動物乙酰膽堿酯酶（AChE）的毒性效應(yīng)研究進展[J]. 海洋通報，2003，22（6）：71-78.

[15] SZAB A，NEMCS K J，ASZTALOS B，et al. The effect of pesticides on carp（Cyprinus carpio L.） Acetylcholinesterase and its biochemical characterization[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety，1992，23（1）：39-45.

2 結(jié)果與分析

2.1泥鰍不同組織中AChE的活性

1%組織勻漿液中，腦、腸、肝臟、胰臟組織中的AChE活性分別是1.42、0.35、0.06、0.15 U/mg。由圖1可知，4種組織中AChE的活性大小順序為腦、腸、胰臟、肝臟。

2.2不同F(xiàn)e3+濃度對泥鰍腦組織中AChE活性的影響

分別將泥鰍暴露在含0.03、6.00和60.00 mg/L的Fe3+濃度中14 d后測得1%腦組織勻漿液的AChE活性分別是1.47、1.48和0.84 U/mg，對照組AChE活性為1.42 U/mg。由圖2可知，僅在含F(xiàn)e3+高濃度組（60 mg/L），同對照組相比，AChE活性有顯著降低（P<0.05）。

3小結(jié)與討論

AChE是一種由蛋白質(zhì)分子構(gòu)成的生物催化劑，主要功能是將神經(jīng)系統(tǒng)突觸部位傳導(dǎo)神經(jīng)興奮的化學(xué)物質(zhì)乙酰膽堿迅速水解為乙酸和膽堿，以維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常生理功能，其在魚類體內(nèi)的分布與組織神經(jīng)活動的強弱有關(guān)。在大鼠中，肝臟與腦組織中的AChE活性分別為1.1和1.0 μmol/mL，兩者差別不大[7]；本研究中發(fā)現(xiàn)在泥鰍腦、腸、肝臟和胰臟等組織中都有AChE存在，但其活性有較大差異，腦組織中AChE活性遠高于其他組織，這種差異可能與AChE的不同來源有關(guān)。

研究表明，有機磷農(nóng)藥和重金屬等污染物對AChE活性具有抑制作用[8-10]。Lionetto等[11]發(fā)現(xiàn)工業(yè)區(qū)和港區(qū)紫貽貝（Mytilus galloprovincialis）和紅山羊魚（Mullus barbatus）體內(nèi)AChE活性減少，以此推測除殺蟲劑外，水中重金屬具有抑制AChE活性的作用。賈秀英等[12]研究了Cd2+、Cr6+單一及復(fù)合污染對鯽魚腦組織AChE活性的影響，發(fā)現(xiàn)隨著重金屬脅迫濃度的增加以及染毒時間的延長，鯽魚腦組織AChE活性下降；相似抑制現(xiàn)象也出現(xiàn)在對白氏文昌魚中，鎘和鋅對AChE活性的抑制率分別達65%和79%[13]。在本研究中，60 mg/L的Fe3+明顯抑制了泥鰍腦組織中AChE的活性，可見重金屬對淡水魚的神經(jīng)毒性并不是孤立事件，其相關(guān)研究需廣泛開展。

AChE的活性中心由酯解部位、陰離子部位和疏水性區(qū)域3個主要部分成，其中酯解部位含有絲氨酸和組氨酸[14]。關(guān)于重金屬對AChE抑制機理，一般認(rèn)為重金屬暴露引起有機體AChE活性降低的原因一方面可能是重金屬共價結(jié)合乙酰膽堿酯酶活性位點的絲氨酸，導(dǎo)致酶的活性喪失；另一方面可能是由于酶中大量巰基與重金屬結(jié)合引起空間構(gòu)象變化，從而間接引起酶活性降低[15]。盡管這些假說能夠解釋重金屬對AChE活性的抑制現(xiàn)象，但需要更多的直接證據(jù)來支持這些假說。

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[8] 劉曉宇，郝強，吳謀成，等. 鯽魚腦乙酰膽堿酯酶（AChE）的活性測定及對有機磷農(nóng)藥的敏感性研究[J]. 食品科學(xué)，2006，27（12）：71-74.

[9] 趙順順，孟范平，王震宇，等. 監(jiān)測水體重金屬污染的分子生物標(biāo)志物研究進展[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報，2010，19（2）：453-458.

[10] 李少南，謝顯傳，譚亞軍，等. 三唑磷對麥穗魚腦組織中乙酰膽堿酯酶的誘導(dǎo)[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報，2005，7（1）：59-62.

[11] LIONETTO M G，CARICATO R，GIORDANO M E，et al. Integrated use of biomarkers （acetylcholinesterase and antioxidant enzymes activities） in Mytilus galloprovincialis and Mullus barbatus in an Italian coastal marine area[J]. Marine Pollution Bulletin，2003，46（3）：324-330.

[12] 賈秀英，董愛華. Cd、Cr（Ⅵ）及其復(fù)合污染對鯽魚腦組織乙酰膽堿酯酶活性的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2003，22（3）：337-339.

[13] 盧斌，柯才煥，王文雄. 低濃度鎘、鋅暴露對白氏文昌魚的毒性累積及其幾種重要酶活性的影響[J]. 廈門大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2012，51（4）：767-773.

[14] 何東海，孟范平，朱小山. 有機磷農(nóng)藥對海洋動物乙酰膽堿酯酶（AChE）的毒性效應(yīng)研究進展[J]. 海洋通報，2003，22（6）：71-78.

[15] SZAB A，NEMCS K J，ASZTALOS B，et al. The effect of pesticides on carp（Cyprinus carpio L.） Acetylcholinesterase and its biochemical characterization[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety，1992，23（1）：39-45.

2 結(jié)果與分析

2.1泥鰍不同組織中AChE的活性

1%組織勻漿液中，腦、腸、肝臟、胰臟組織中的AChE活性分別是1.42、0.35、0.06、0.15 U/mg。由圖1可知，4種組織中AChE的活性大小順序為腦、腸、胰臟、肝臟。

2.2不同F(xiàn)e3+濃度對泥鰍腦組織中AChE活性的影響

分別將泥鰍暴露在含0.03、6.00和60.00 mg/L的Fe3+濃度中14 d后測得1%腦組織勻漿液的AChE活性分別是1.47、1.48和0.84 U/mg，對照組AChE活性為1.42 U/mg。由圖2可知，僅在含F(xiàn)e3+高濃度組（60 mg/L），同對照組相比，AChE活性有顯著降低（P<0.05）。

3小結(jié)與討論

AChE是一種由蛋白質(zhì)分子構(gòu)成的生物催化劑，主要功能是將神經(jīng)系統(tǒng)突觸部位傳導(dǎo)神經(jīng)興奮的化學(xué)物質(zhì)乙酰膽堿迅速水解為乙酸和膽堿，以維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常生理功能，其在魚類體內(nèi)的分布與組織神經(jīng)活動的強弱有關(guān)。在大鼠中，肝臟與腦組織中的AChE活性分別為1.1和1.0 μmol/mL，兩者差別不大[7]；本研究中發(fā)現(xiàn)在泥鰍腦、腸、肝臟和胰臟等組織中都有AChE存在，但其活性有較大差異，腦組織中AChE活性遠高于其他組織，這種差異可能與AChE的不同來源有關(guān)。

研究表明，有機磷農(nóng)藥和重金屬等污染物對AChE活性具有抑制作用[8-10]。Lionetto等[11]發(fā)現(xiàn)工業(yè)區(qū)和港區(qū)紫貽貝（Mytilus galloprovincialis）和紅山羊魚（Mullus barbatus）體內(nèi)AChE活性減少，以此推測除殺蟲劑外，水中重金屬具有抑制AChE活性的作用。賈秀英等[12]研究了Cd2+、Cr6+單一及復(fù)合污染對鯽魚腦組織AChE活性的影響，發(fā)現(xiàn)隨著重金屬脅迫濃度的增加以及染毒時間的延長，鯽魚腦組織AChE活性下降；相似抑制現(xiàn)象也出現(xiàn)在對白氏文昌魚中，鎘和鋅對AChE活性的抑制率分別達65%和79%[13]。在本研究中，60 mg/L的Fe3+明顯抑制了泥鰍腦組織中AChE的活性，可見重金屬對淡水魚的神經(jīng)毒性并不是孤立事件，其相關(guān)研究需廣泛開展。

AChE的活性中心由酯解部位、陰離子部位和疏水性區(qū)域3個主要部分成，其中酯解部位含有絲氨酸和組氨酸[14]。關(guān)于重金屬對AChE抑制機理，一般認(rèn)為重金屬暴露引起有機體AChE活性降低的原因一方面可能是重金屬共價結(jié)合乙酰膽堿酯酶活性位點的絲氨酸，導(dǎo)致酶的活性喪失；另一方面可能是由于酶中大量巰基與重金屬結(jié)合引起空間構(gòu)象變化，從而間接引起酶活性降低[15]。盡管這些假說能夠解釋重金屬對AChE活性的抑制現(xiàn)象，但需要更多的直接證據(jù)來支持這些假說。

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[1] LAPPIVAARA J，MARTTINEN S. Effects of waterborne iron overload and simulated winter conditions on acute physiological stress response of whitefish，Coregonus lavaretus[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety，2005，60（2）：157-168.

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[7] 宋世震，彭曉武，范麗蓉. 孕期錳染毒對仔鼠腦、肝AChE的影響[J]. 武漢科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2004，27（1）：84-86.

[8] 劉曉宇，郝強，吳謀成，等. 鯽魚腦乙酰膽堿酯酶（AChE）的活性測定及對有機磷農(nóng)藥的敏感性研究[J]. 食品科學(xué)，2006，27（12）：71-74.

[9] 趙順順，孟范平，王震宇，等. 監(jiān)測水體重金屬污染的分子生物標(biāo)志物研究進展[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報，2010，19（2）：453-458.

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[11] LIONETTO M G，CARICATO R，GIORDANO M E，et al. Integrated use of biomarkers （acetylcholinesterase and antioxidant enzymes activities） in Mytilus galloprovincialis and Mullus barbatus in an Italian coastal marine area[J]. Marine Pollution Bulletin，2003，46（3）：324-330.

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