寧夏部分地區犢牛腹瀉樣本大腸桿菌分離菌株的毒力因子檢測與分析

王瑋 王景松 郭亞男 高樂 王玲玲 陳燦 王健霖 王建東 馬科 李繼東

摘 要：旨在調查寧夏地區犢牛腹瀉性大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）流行情況及毒力因子流行特點。對寧夏地區共采集332份腹瀉犢牛直腸糞便進行病原分離，利用PCR方法對156株大腸桿菌分離株進行13種相關毒力基因檢測。結果共分離出156株大腸桿菌（46.99%），共檢出136株含有毒力因子的大腸桿菌，表明目前寧夏地區腹瀉犢牛大腸桿菌陽性率較高，毒力因子組合復雜，優勢毒力因子為irp2。

關鍵詞：犢牛；腹瀉性；大腸桿菌；毒力因子

中圖分類號：S852.612

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）07-3261-06

收稿日期：2023-08-30

基金項目：寧夏回族自治區重點研發計劃項目（2022BBF03024）

作者簡介：王 瑋（1999-），女，河南南陽人，碩士生，主要從事動物疾病診斷與防控技術研究，E-mail：wei_wang2022@163.com

*通信作者：李繼東，主要從事動物傳染病的診斷與防治研究，E-mail：lijidongi@foxmail.com；郭亞男，主要從事獸醫臨床診斷技術研究，E-mail：gyn330@126.com

Toxicity Factor Detection and Analysis of Escherichia coli Isolated Strains from

Calf Diarrhea Samples in Some Areas of Ningxia

WANGWei^1，2，WANGJingsong^1，2，GUOYa’nan^1*，GAOLe²，WANGLingling²，

CHENCan²，WANGJianlin²，WANGJiandong¹，MAKe³，LIJidong^2*

（1.Institute of Animal Science，Ningxia Academy of Agriculture and Forestry，

Yinchuan750002，China; 2.School of Animal Science and Technology，Ningxia University，

Yinchuan750021，China; 3.Ningxia Tongxin County Science and

Technology Service Center，Tongxin751300，China）

Abstract：The aim of this study was to investigate the prevalence and virulence factors of Escherichia coli（E.coli）in calves in Ningxia region.A total of332samples of diarrhea calf rectal feces were collected in Ningxia region for pathogen isolation，and156strains of E.coli were detected for13related virulence genes using PCR method.The results show that atotal of156strains（46.99%）of E.coli were isolated，and atotal of136strains containing virulence factors were detected.This indicates that the current positive rate of E.coli in diarrhea calves in Ningxia is relatively high，and the combination of virulence factors is complex，with irp2being the dominant virulence factor.

Key words：calves; diarrhea; Escherichia coli; toxicity factor

*Corresponding authors：LI Jidong，E-mail：lijidongi@foxmail.com; GUO Ya’nan，E-mail：gyn330@126.com

在國內，引起犢牛腹瀉的致病性大腸桿菌被廣泛研究，然而，近幾年的研究僅限于少數畜群，集中在病原的流行病學調查、血清型鑒定、耐藥性分析等研究^[1-3]。國內外對于牛源性大腸桿菌毒力因子的研究僅限于單一毒力因子或者一類毒力因子的研究^[3-9]。目前，尚未見對寧夏地區犢牛腹瀉源性大腸桿菌毒力因子的系統性調查。

1 材料與方法

1.1 主要材料

2022—2023年，對寧夏西吉縣、青銅峽市、利通區、紅寺堡區、同心縣地區出現腹瀉的20個規模化場和13個散養戶，用無菌棉拭子采集3月齡左右犢牛直腸糞便，將單個肛拭子置于15mL無菌離心管中，并記錄采樣犢牛數量和其腹瀉情況等信息。參考菌株大腸桿菌標準菌株ATCC25922由寧夏農林科學院動物科學研究所提供。

1.2 主要試劑

50×TAE緩沖液（20220110），購自金克隆（北京）生物技術有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒（Y1127）購自天根生化科技（北京）有限公司；DL1000DNA Marker（AM51180A）、DL2000DNA Marker（AM31176A）購自TaKaRa公司；豆粉瓊脂（10803）購自青島日水生物技術有限公司；伊紅美藍瓊脂培養基（EMB）（20230417）、營養肉湯培養基（NB）（20210311）購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司；無菌脫纖維羊血（HQ60071）購自廣州鴻泉生物科技有限公司。

1.3 細菌分離與鑒定

將采集單個直腸肛拭子（n=332）接種于5mL NB液體培養基中，37 ℃恒溫培養12h。然后用接種環按照常規細菌分離方法分別接種于伊紅美藍培養基，37 ℃恒溫培養18～24h。挑取典型單個菌落接種于5mL NB液體培養基中，37 ℃恒溫培養12h，劃線接種到無菌脫纖維羊血瓊脂培養基中，37℃恒溫培養18～24h，觀察菌株情況，同時接種到NB液體培養基中備用。通過對寧夏西吉縣、青銅峽市、利通區、紅寺堡區、同心縣地區的腹瀉樣本，進行大腸桿菌病原分離；分離菌DNA的提取；16S rRNA PCR擴增與序列測定；大腸桿菌毒素的檢測：采用PCR方法對K88、K99、987P、fedA、HPI（irp2）、LEE（eae）、ST1、ST2、LT1、VT1、VT2all、SLT2毒素進行特異性檢測^[10]。引物見表1，PCR體系為50μL：25μL2×Premix Taq，2μL10μmol·L^-1上、下引物，4μL細菌DNA模板，17μL超純水。PCR程序：95℃預變性5min；95℃變性30s，退火（H88、F41、K99、987P、fedA、LT1、ST1、ST2、Stxl、VT2all56℃，F1860℃，LEE、HPI58℃）30s，72℃延伸1min，32個循環；72℃終延伸10min；4℃保存。

2 結 果

糞便樣品經分離培養基后結果顯示，從332份腹瀉糞便樣本中分離出156株大腸桿菌。大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂培養基上長出金屬光澤的黑色單一菌落；血平板上有中等大小、具有溶血圓的灰色圓形單一菌落。16S rRNA擴增檢測到約1500bp目標片段，與預期相符。

對不同地區、不同規模飼養場樣品的分離情況分析結果見表2。分離情況分析結果顯示，寧夏西吉縣、青銅峽、紅寺堡、同心縣，大腸桿菌檢出率分別為47.83%（22/46）、46.03%（58/126）、52.78%（38/72）、48.39%（30/62），利通區為30.77%（8/26）明顯低于其他地區；采集樣本犢牛腹瀉率紅寺堡為最高（50.00%），利通區腹瀉率為最低（26.92%）。

不同地區散養戶中大腸桿菌總檢出率為57.14%（32/56），規模場中大腸桿菌總檢出率為44.93%（124/276）。表明散養戶中更易存在大腸桿菌，這可能與散養戶飼養環境較差有關。

通過對156株腹瀉源性大腸桿菌菌株K88、K99、HPI（irp2）、LEE（eae）、ST1、ST2、VT1、VT2all、SLT2進行擴增，均能擴增出大小約為841、543、280、425、183、360、664、484、281bp的片段（結果未展示），與預期結果一致。由表3可知，毒力基因K88、K99、HPI（irp2）、LEE（eae）、ST1、ST2、VT1、VT2all、SLT2的檢出率分別為19.23%、3.85%、52.56%、25.64%、3.85%、1.28%、24.36%、21.79%、12.82%。未擴增出987P、fedA、LT1、VT1的預期片段，這表明合成的引物可以用于K88、K99、HPI（irp2）、LEE（eae）、ST1、ST2、VT1、VT2all、SLT2毒素特異性檢測。

對各菌株毒力基因組合分布進行統計，結果如表4所示，未檢出毒力因子的菌株有20株（12.82%），含有一個毒力因子的菌株有80株（51.28%），含有兩個毒力因子的菌株有20株（12.82%），含有三個毒力因子的菌株有22株（14.10%），含有三個以上的毒力因子的菌株有14株（8.97%），在組合類別中，含有一個毒力因子的菌株所占的比例最高，為51.28%。

3 討 論

盡管腹瀉源性大腸桿菌通常集中于某些特定的血清型，但大腸桿菌的致病性并不完全與血清型有關，而主要是取決于其特定的毒力因子，如毒素、菌毛以及毒力島等。控制這些毒力因子的基因位于染色體上某些特殊的位點或染色體以外的基因（如質粒）。傳統的檢測方法是直接處理病料，分離鑒定病原，檢測毒力因子，其費時費力，檢出率低，特異性差，PCR方法用于大腸桿菌毒力因子的檢測具有敏感、特異、快速等優點。大腸桿菌致病性與其所攜帶的毒力基因密切相關，本研究對犢牛腹瀉大腸桿菌的毒力因子進行檢測，在156株大腸桿菌分離株中，菌毛基因K88檢出率為19.23%，在37℃時表達良好，能凝集多種動物的紅細胞。腸毒素VT1（stx1特異性片段）、VT2all（stx2/stx2e特異性片段）、SLT2（stx2特異性片段）檢出率偏高，含有stx1⁺和stx2⁺兩種毒素的大腸桿菌屬于EHEC，在本次分離的大腸桿菌中發現是50株（32.05%），含有stx1⁺和stx2⁺兩種毒素的大腸桿菌人感染的重要病原體，部分是由于細菌與宿主細胞的緊密附著，由緊密蛋白介導，所述的緊密蛋白由eae基因以及至少一種志賀毒素基因（stx1/stx2）編碼，兩種毒素導致嚴重腹瀉，且攜帶毒素數量與菌株的毒力呈正比，stx1檢出率均高于stx2。

HPI毒力島、LEE毒力島檢出率較高，毒力島并不是先天的，是后天在進化過程中獲得的，并且可以在不同菌株之間水平傳播，HPI（irp2）作為鐵調節基因，僅存在于強致病株中，與毒力密切相關，是判斷和檢測其它病源菌是否存在HPI（irp2）的標志基因。本研究中毒力基因irp2的檢出率為52.56%。本試驗中LEE（eae）檢出率為25.64%，與國內外報道的檢出率相似^[12]。VT1、VT2all、SLT2檢出率分別為24.36%、21.79%、12.82%，高于國內外報道的檢出率^[13-14]。

本試驗中共檢測出26種陽性毒力譜，高于國內外報道的檢出率^[13-14]。毒力因子組合復雜，各個組合檢出率較低，要研究犢牛的毒力譜與腹瀉率的關系需要進行更深入的探索。由于K88、HPI、LEE、VT1、VT2all、SLT2檢測率較高，針對五種毒力因子對犢牛進行大腸桿菌病針對性治療，并對發生該病的牛場和養殖戶采取積極的防制措施。上述檢測出的毒力因子與EHEC菌株高檢出率提示應重視牛源大腸桿菌的監測及其對公共衛生的威脅。并且認為寧夏地區牛場存在潛在風險，需要加強管理。菌株間毒力基因的差異是導致大腸桿菌致病力差異的重要原因，有必要對毒力因子進行定期檢測，以便有效地防治大腸桿菌引起的犢牛腹瀉，為其防治提供參考依據。本試驗對寧夏地區犢牛腹瀉源性大腸桿菌毒力因子組合類型研究進行相關數據調查，對該疾病的診斷和有效預防提供一定的科學依據。

4 結 論

本試驗通過對寧夏部分地區犢牛源腹瀉源性大腸桿菌進行細菌病原分離、16S rRNA PCR和相關毒力因子PCR的分子生物學試驗等一系列研究方法，表明大腸桿菌在寧夏部分地區發生腹瀉牛群中具有很高的流行率，分離株毒力因子組合復雜。K88、HPI、LEE、VT1、VT2all、SLT2是從腹瀉犢牛分離的大腸桿菌中檢出率較高的毒力因子，發現26種不同的毒力譜，毒力基因種類多樣。有必要對犢牛源腹瀉性大腸桿菌的流行情況進行持續的調查研究，為犢牛源大腸桿菌病的防治提供依據和參考。

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（編輯 白永平）