黃連防治鴨病毒性腸炎機制的網(wǎng)絡藥理學分析及動物試驗驗證

摘 要：旨在探討黃連防治鴨病毒性腸炎（duck viral enteritis，DVE）的作用機制，本研究首先應用中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（Traditional Chinese Medicine System Pharmacology Analysis Platform，TCMSP）篩選黃連活性成分及作用靶點，GeneCards數(shù)據(jù)庫分析DVE相關靶點，Venny和Cytoscape3.7.2軟件繪制黃連與DVE交集靶點及構建“藥物-成分-疾病-靶點”網(wǎng)絡，利用STRING數(shù)據(jù)庫建立蛋白相互作用網(wǎng)絡（protein interaction network，PPI），借助DAVID數(shù)據(jù)庫進行靶點GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，然后分正常對照組、病毒感染組和黃連防治組進行動物干預試驗，采集組織樣本進行病理組織學觀察和相關細胞因子測定，結果表明：篩選出黃連14個活性成分和212個作用靶點，其中，與DVE交集的靶點25個，涉及RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄、序列特異性DNA結合轉錄因子活性、免疫應答、炎癥反應和細胞凋亡等生物學過程，富集在Toll樣受體信號通路、炎癥性腸病、細胞因子-細胞因子受體相互作用、單純皰疹病毒感染等信號通路，核心靶點是IL-6、IL-10和STAT1；病毒感染組鴨肝、脾和十二指腸發(fā)生不同程度的病理損傷，且這些組織中IL-6含量較正常對照組鴨顯著提升（P≤0.05），IL-10和STAT1含量顯著降低（P≤0.05），而黃連防治組鴨肝、脾和十二指腸組織病理損傷明顯減輕，IL-6、IL-10和SYAT1含量趨于正常水平。由此可見，黃連能有效緩解鴨病毒性腸炎所致的鴨機體組織病理損傷，其作用機制涉及到多種炎癥反應信號通路。

關鍵詞：黃連；網(wǎng)絡藥理學；鴨病毒性腸炎；作用機制

中圖分類號：S853.74

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）07-3225-09

收稿日期：2023-10-18

基金項目：國家自然科學基金項目（32360872；31560703）；貴州省科技平臺人才項目（黔科合人才[2016]4009號）

作者簡介：文安林（1996-），貴州雷山人，碩士生，主要從事獸醫(yī)病理學研究，E-mail：381554077@qq.com

*通信作者：歐德淵，主要從事獸醫(yī)病理學研究，E-mail：dyou@gzu.edu.cn；文 明，主要從事獸醫(yī)微生物學與免疫學研究，E-mail：mwen@gzu.edu.cn

Network Pharmacologic Analysis and Experimential Verification on the Mechanism of

Coptidis Rhizoma in Preventing Duck Viral Enteritis

WENAnlin¹，YANGYunyun¹，LUOYongrong²，YANGYing^1，3，CHENGZhentao^1，3，

OUDeyuan^1，3*，WENMing^1，3*

（1.College of Animal Science，Guizhou University，Guiyang550025，China;

2.Anshun Academy of Agricultural Science，Anshun561000，China;

3.Guizhou Research Center of Animal Biologicals Engineering and Technology，Guiyang550025，China）

Abstract：To explore the mechanism of Coptidis Rhizoma treating duck viral enteritis（DVE），the active ingredients and targets of Coptidis Rhizoma were firstly screened by the Traditional Chinese Medicine System Pharmacology Analysis Platform（TCMSP），and the DVE related targets and their intersection targets with Coptidis Rhizoma were analyzed and drew using the GeneCards database and Venny and Cytoscape3.7.2software，which constructed a\"drug component disease target\"network.And the protein interaction network（PPI）were established by STRING databases and their GO function and KEGG pathway were analyzed with the DAVID database.Then，the results of network pharmacology were verified by animal experiments which narmol group，virus infection group and drug intervention group，and their tissue samples were collected for histopathological observation and related cytokine determination.The results showed that14active components and212action targets of Coptidis Rhizoma were selected，including25targets that intersect with DVE，involving biological processes such as RNA polymerase II promoter transcription，sequence specific DNA binding transcription factor activity，immune response，inflammatory response，and cell apoptosis，enriched in signaling pathways such as Toll like receptor signaling，inflammatory bowel disease，cytokine-cytokine receptor interaction，and herpes simplex virus infection，the core targets are IL-6，IL-10，and STAT1.By animal experiments，there were the varting degrees of pathological damage in liver，spleen and duodenum in virus infection group ducks，and IL-6content was significantly increased compared to the normal control group ducks（P≤0.05），while the IL-10and STAT1contents were significantly reduced（P≤0.05）.However，the pathological damage was significantly reduced in drug intervention group ducks，the levels of IL-6，IL-10，and SYAT1tended to normal levels.These results indicated that Coptidis can effectively alleviate the pathological damage of duck tissues caused by duck viral enteritis，and its mechanism may involves various inflammatory response signaling pathways.

Key words：Coptidis Rhizoma; network pharmacology; duck viral enteritis; mechanism

*Corresponding authors：OU Deyuan，E-mail：dyou@gzu.edu.cn；WEN Ming，E-mail：mwen@gzu.edu.cn

病毒性傳染病如鴨病毒性腸炎、鴨病毒性肝炎、鴨坦布蘇病毒病等，是威脅和危害水禽養(yǎng)殖健康發(fā)展的重要因素，其中，鴨病毒性腸炎（duck viral enteritis，DVE）危害較大。鴨病毒性腸炎是由鴨腸炎病毒（duck enteritis virus，DEV）引起鴨、鵝等雁形目禽類的一種急性敗血性接觸性傳染病，具有較高的發(fā)病率和死亡率^[1]。DEV又稱鴨瘟病毒（duck plagues virus，DPV）或鴨皰疹病毒1型（anatid herpesvirus1），為皰疹病毒科（Herpesviridae）α皰疹病毒亞科（Alphaherpesvirinae）馬立克病毒屬（Mardivirus）成員^[2]。DEV侵入動物機體的第一步是在消化道進行復制，再散布全身引起全身感染，因此DEV感染的重要病理變化是消化道黏膜炎癥及其壞死性病變^[3-5]。針對畜禽宿主，病毒性傳染病防控關鍵措施有兩點：一是疫苗預防注射，抵御病毒感染；二是使用藥物干預，減輕病理損害。現(xiàn)代藥理學研究表明，中藥具有良好的抗病毒作用：一方面是中藥能阻止病毒的吸附與穿入，抑制病毒的自我復制，達到抑制病毒作用；另一方面是中藥通過提高動物機體非特異免疫功能，間接達到抗病毒作用。黃連（Coptidis Rhizoma）是目前發(fā)現(xiàn)具有良好抗病毒作用的中藥之一，屬毛茛科多年生草本植物，主產(chǎn)于四川、重慶、云南、貴州等地，具有清熱燥濕、瀉火解毒等功效，并已證實在病毒性疾病防治中發(fā)揮抗病毒和抗炎等作用^[6-8]，但由于黃連有效成分復雜，作用靶點及其作用機制尚未明晰，嚴重限制了黃連等中藥的開發(fā)利用。網(wǎng)絡藥理學是從系統(tǒng)生物學和生物網(wǎng)絡平衡角度出發(fā)，采用疾病-基因-靶點-藥物相互作用網(wǎng)絡，將單個靶點或多個靶點在整個生物網(wǎng)絡進行定位，以發(fā)現(xiàn)藥物的作用靶點和預測作用機制，在諸多研究領域上顯示出重要的理論和實際應用價值，已廣泛應用到藥物研發(fā)中^[9-11]。項目組在前期臨床研究中發(fā)現(xiàn)，黃連對鴨病毒性腸炎具有良好的防治效果，但其作用機制尚未清楚。因此，本研究采用網(wǎng)絡藥理學預測和動物試驗探究黃連活性成分、預測和驗證黃連防治DVE的作用機制，以期為黃連在防治DVE的開發(fā)利用上提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、藥物和試驗動物

鴨腸炎病毒貴州株（DEV-GZ，TCID₅₀=3.16×10^-9·0.1mL^-1），由貴州省動物生物制品工程技術研究中心贈送；黃連粉劑（批號200920，主要成分是小檗堿、黃連堿、甲基黃連堿等），購自陜西海益斯生物科技有限公司；1d清潔級三穗麻鴨60只，購自貴州省貴陽市花溪區(qū)董家堰塘蛋鴨孵化場，隔離飼養(yǎng)至30d時備用。

1.1.2 主要試劑與儀器

鴨源IL-6間接ELISA檢測試劑盒（批號LY3926-A）、鴨源IL-10間接ELISA檢測試劑盒（批號LY3949-A）和鴨源STAT1間接ELISA檢測試劑盒（LY7596-B）購自江蘇綠葉生物科技有限公司；超凈工作臺（SW-CJ-2D）購自蘇州凈化設備有限公司；臺式高速冷凍離心機（D3024R）購自北京大龍興創(chuàng)實驗儀器股份公司；酶標檢測儀（Epoch）購自美國伯騰儀器有限公司。

1.1.3 數(shù)據(jù)庫與分析平臺

本研究所用的數(shù)據(jù)庫和分析平臺主要有TCMSP數(shù)據(jù)庫（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）、GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）、UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）、STRING數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david-d．ncifcrf．Gov）、Cytoscape3.7.2軟件、Venny圖（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）和微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn/）。

1.2 基于網(wǎng)絡藥理學分析黃連防治DVE的作用機制

首先通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選黃連的活性成分和作用靶點，篩選標準為口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18；然后應用GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索“Duck plague”和篩選DVE相關靶點，并采用Uniprot數(shù)據(jù)庫和Venny圖篩選并繪制黃連作用靶點與DVE相關靶點交集圖，獲得黃連防治DVE的作用靶點；將黃連作用靶點與DVE相關靶點交集信息導入Cytoscape3.7.2軟件，構建黃連活性成分-作用靶點-疾病相互作用網(wǎng)絡圖；再通過STRING數(shù)據(jù)庫和Cytoscape3.7.2軟件將交集靶點信息限定在物種“ducks”上，構建可視化的交集靶點間蛋白互作網(wǎng)絡圖；最后利用DAVID數(shù)據(jù)庫，限定物種為“Falcated Duck”，對黃連與DVE的交集靶點進行GO功能與KEGG通路富集分析，預測黃連防治DVE的作用機制。

1.3 動物試驗驗證黃連防治DVE的作用機制

將60只30d健康三穗麻鴨隨機分為3組，即空白對照組、病毒感染組和藥物防治組，每組20只，相對隔離，常規(guī)飼料常規(guī)方法飼養(yǎng)。空白對照組鴨飼養(yǎng)至38d時腿部肌肉注射量滅菌生理鹽水，0.2mL·只^-1；病毒感染組鴨按照文獻[12]動物感染模型建立方法，于38d時肌肉注射鴨腸炎病毒貴州株細胞培養(yǎng)液（TCID₅₀=3.16×10^-9·0.1mL^-1），0.2mL·只^-1；藥物防治組鴨于31d起灌喂黃連膠囊[含黃連粉（0.60±0.02）g·粒^-1]至試驗結束，1粒·只^-1，每日1次，在38d時腿部肌肉注射鴨腸炎病毒液，0.2mL·只^-1。三組試驗鴨繼續(xù)飼養(yǎng)至42d時進行捕殺，每組5只，觀察組織器官大體病變后收集肝、脾和十二指腸組織樣本，以4%多聚甲醛溶液固定過夜，石蠟包埋，切片后進行HE染色，光學顯微鏡下觀察組織病變和炎性細胞浸潤情況；稱取組織樣本0.5g，加入液氮研磨后，以滅菌生理鹽水1.0mL充分混合，離心收集上清液，根據(jù)網(wǎng)絡藥理學預測結果指標，按照IL-6、IL-10和STAT1間接ELISA檢測試劑盒說明書進行肝、脾和十二指腸組織IL-6、IL-10和STAT1含量檢測，分析黃連防治鴨病毒性腸炎的作用機制。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)應用SPSS26.0軟件進行分析，計量資料以“x-±s”表示，單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 黃連活性成分與作用靶點

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索得到黃連活性成分共有48種，符合口服生物利用度（OB）和類藥性（DL）設定條件的有14種（表1）；通過Swiss TargetPredication預測上述14種活性成分作用靶點并利用Excel進行作用靶點重復項刪除，共獲得黃連活性成分的作用靶點212個。

2.2 DVE相關靶點及與黃連交集靶點

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索“Duck virus enteritis”去重后共得到DVE相關靶點181個；應用UniProt數(shù)據(jù)庫和Venn在線軟件將黃連有效成分作用靶點與DVE相關靶點構建韋恩圖，得到黃連-DVE交集靶點25個（圖1）。

2.3 黃連-DVE靶點網(wǎng)絡分析與PPI網(wǎng)絡圖構建

應用Cytoscape3.7.2軟件構建黃連防治DVE的“藥物-成分-疾病-靶點”互作網(wǎng)絡圖（圖2），發(fā)現(xiàn)黃連的有效活性成分主要有槲皮素（quercetin）、黃連堿（coptisine）、小檗堿（berberine）、R-氫化小檗堿[（R）-canadine]和黃麻苷A（corchoroside A_qt），這些活性成分可能是黃連防治DVE的作用靶點；將25個交集靶點導入STRING數(shù)據(jù)庫并刪除無關聯(lián)節(jié)點，得到蛋白質(zhì)互作（PPI）網(wǎng)絡圖（圖3），發(fā)現(xiàn)網(wǎng)絡圖包含27個節(jié)點和59條連接線，提示存在27個蛋白59項互作關系，平均節(jié)點度值為4.37；將PPI網(wǎng)絡數(shù)據(jù)導入Cytoscape3.7.2軟件，發(fā)現(xiàn)黃連防治DVE的核心靶點是IL-6、IL-10和STAT1。

2.4 黃連與DVE交集靶點GO功能和KEGG通路富集分析

經(jīng)DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO功能分析，得到GO條目85條（P＜0.05），其中，生物過程（BP）67條、細胞組成（CC）3條和分子功能（MF）15條。選擇BP、CC和MF富集高的前15條進行可視化分析發(fā)現(xiàn)，黃連與DVE交集靶點GO功能涉及RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄正調(diào)控（positive regulation of transcription from RNA polymeraseⅡpromoter）、免疫應答（immune response）、轉錄（transcription）、序列特異性DNA結合轉錄因子活性正調(diào)控（positive regulation of sequence-specific DNA binding transcription factor activity）、炎癥反應（inflammatory response）、細胞凋亡（apoptotic process）、藥物反應（response to drug）等，提示黃連防治DVE的靶點主要與調(diào)節(jié)轉錄、細胞免疫、炎癥反應和藥物反應等密切相關。

KEGG通路富集分析得到47條信號通路（P＜0.05），將前15條信號通路進行可視化并生成氣泡圖（圖4），涉及Toll樣受體信號通路（toll-like receptor signa-ling pathway）、炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）、細胞因子-細胞因子受體相互作用（cytokine-cytokine receptor interaction）、單純皰疹病毒感染（herpes simplex infection）等信號通路，提示黃連活性成分通過Toll樣受體、炎癥性腸病等多個信號通路發(fā)揮對DVE的防治作用。

2.5 黃連干預對DVE感染鴨器官組織病變的影響

觀察發(fā)現(xiàn)，正常對照組鴨肝、脾和十二指腸組織均無明顯的病理損傷，病毒感染組鴨器官組織呈現(xiàn)不同程度的病理變化，黃連干預組鴨器官組織病變得到一定程度的改善（圖5）。

肝：正常對照組鴨肝臟組織結構正常，肝細胞形態(tài)清晰（圖5A1）；病毒感染組鴨肝小葉界限不清，有大量的空泡，肝細胞核濃縮或溶解等（圖5B1）；與病毒感染組相比，黃連干預組鴨肝組織病變出現(xiàn)一定程度的減輕（圖5C1）。

脾：正常對照組鴨的脾組織結構清晰，未見病變（圖5A2）；病毒感染組鴨脾竇內(nèi)大量充血，淋巴細胞數(shù)量極度減少，呈現(xiàn)明顯的淀粉樣物質(zhì)，導致正常結構完全消失，伴有大量炎性細胞浸潤和出血（圖5B2）；與病毒感染組相比，黃連干預組鴨脾僅見白髓內(nèi)少量淤血，部分細胞核溶解，淋巴細胞含量增加（圖5C2）。

十二指腸：正常對照組鴨十二指腸組織結構清晰，腸絨毛均未出現(xiàn)明顯損傷（圖5A3）；病毒感染組鴨十二指腸腸道內(nèi)充滿脫落壞死的上皮細胞，腸絨毛發(fā)生斷裂脫落，并有少量血細胞和炎性細胞浸潤（圖5B3）；與病毒感染組相比，黃連干預組鴨十二指腸腸絨毛斷裂脫落明顯減輕，血細胞和淋巴細胞浸潤明顯減少（圖5C3）。

2.6 黃連干預對DVE感染鴨器官組織IL-6、IL-10和STAT1含量的影響

采用ELISA方法檢測黃連干預鴨器官組織樣本IL-6、IL-10和STAT1含量，結果如表2所示：與正常對照組相比，病毒感染組鴨肝、脾和十二指腸組織IL-6含量顯著或極顯著提高（Plt;0.05或Plt;0.01），而IL-10和STAT1含量呈顯著降低（Plt;0.05）；經(jīng)黃連干預后，DEV感染鴨肝、脾和十二指腸組織IL-6和STAT1含量趨于正常，而IL-10含量較正常對照組有所提高（Pgt;0.05）。這些結果提示，黃連可能是通過影響IL-6、IL-10和STAT1等分泌以緩解DEV對感染鴨造成的病理損傷。

3 討 論

鴨病毒性腸炎（DVE）是由鴨腸炎病毒（DEV）引起的以組織器官變性壞死和退行性變化為主要特征的一種接觸性傳染病。DEV在宿主感染中沒有特定的靶組織和靶器官，但主要靶細胞是上皮細胞和B淋巴細胞^[13]。腸道是消化器官的重要組成部分，也是DEV入侵的重要場所，DEV感染后可引起嚴重的炎癥反應和病理損害^[14]。黃連作為傳統(tǒng)的抗菌消炎藥物，被發(fā)現(xiàn)含有130多種化學成分，其中多種活性成分具有抗菌、抗病毒和抗炎等作用，在保護腸上皮黏膜屏障、調(diào)節(jié)腸道炎癥細胞因子和抵御炎癥反應等方面發(fā)揮重要作用^[15]。

本研究通過網(wǎng)絡藥理學分析發(fā)現(xiàn)，黃連含有多種活性成分如槲皮素、小檗堿和黃連堿等，其中：槲皮素能顯著提高細胞抗氧化酶類活性以緩解外源物質(zhì)對宿主上皮細胞的氧化損傷，同時可通過抑制趨化因子CXCL8表達，或抑制TLR2、TLR4/MyD88/NF-κB信號通路激活，進而抑制炎性細胞因子分泌而發(fā)揮抗炎癥作用^[16]；小檗堿通過參與調(diào)節(jié)NF-κB、MAPK、PPAR-γ等信號通路，影響免疫細胞調(diào)節(jié)性T細胞和輔助性T細胞之間平衡，抑制IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性因子分泌，阻礙白細胞與內(nèi)皮的黏附和遷移，減輕中性粒細胞浸潤和促進細胞凋亡，達到抗炎作用^[9]。

通過蛋白互作網(wǎng)絡圖顯示，黃連活性成分通過IL-6、IL-10和STAT1等主要靶點干預鴨病毒性腸炎。研究表明，IL-6過表達，可促進STAT3持續(xù)磷酸化和激活，抑制細胞凋亡并促進細胞增殖，同時上調(diào)SOCS1蛋白表達，負反饋調(diào)節(jié)JAK-STAT通路，抑制干擾素分泌，利于病毒復制，促進病毒對宿主組織器官的損傷^[17]；IL-10被激活后，抑制IL-6過度表達，從而發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用^[18]；STAT1作為STAT家族的重要轉導與轉錄激活因子之一，與STAT2和IRF9形成異源三聚體復合物而進入細胞核，誘導ISGs表達，發(fā)揮抗病毒作用^[19]。GO功能富集分析顯示，黃連活性成分作用于鴨病毒性腸炎主要集中在生物過程，主要與轉錄、細胞免疫、炎癥反應、藥物反應等密切相關，提示黃連干預鴨病毒性腸炎不僅作用于轉錄、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等環(huán)節(jié)，還參與藥物發(fā)揮相關作用的藥理過程；KEGG通路分析顯示，黃連干預鴨病毒性腸炎主要是通過Toll樣受體、炎癥性腸病、細胞因子-細胞因子受體互作等信號通路發(fā)揮作用，同時TNF信號通路、一氧化氮樣受體信號通路、JAK-STAT信號通路、RIG-I受體信號通路、NF-κB信號通路和MAPK信號通路也起到至關重要的作用。以上網(wǎng)絡藥理學分析說明，黃連相關有效成分是通過多靶點、多通路來抑制炎性因子的過度釋放，從而減輕DEV感染對鴨機體的損傷。

鴨病毒性腸炎的主要病變特征是實質(zhì)器官退行性變化和消化道出血性炎癥反應。肝是動物機體最大的消化腺，具有代謝、解毒、排泄和免疫等多種功能，也是病毒容易侵害的器官；脾作為最大的外周免疫器官，也是動物機體對病原微生物感染發(fā)生免疫應答反應的重要部位；前期研究發(fā)現(xiàn)，鴨腸炎病毒引起消化道病變最明顯的部位是十二指腸，因此本研究選擇肝、脾和十二指腸作為黃連干預鴨腸炎病毒感染致機體病變的觀察對象。本研究通過病理組織學觀察發(fā)現(xiàn)，通過黃連預先干預，能有效減輕DEV感染對鴨肝、脾和十二指腸等器官組織的病理損傷；經(jīng)ELISA檢測可見，鴨腸炎病毒感染后鴨肝、脾和十二指腸組織IL-6分泌顯著或極顯著提高，而IL-10和STAT1分泌顯著降低；經(jīng)黃連預先干預可使DEV感染鴨肝、脾和十二指腸組織IL-6、IL-10和STAT1分泌趨于正常水平，提示黃連可能是通過調(diào)節(jié)了IL-6、IL-10和STAT1等分泌來緩解DEV對感染鴨造成的病理損傷。

4 結 論

黃連主要含有槲皮素、黃連堿、小檗堿、R-氫化小檗堿和黃麻苷A等活性成分，這些活性成分的核心靶點是IL-6、IL-10和STAT1等；黃連能有效緩解鴨腸炎病毒感染所致的鴨機體器官組織病理損傷，其作用機制可能是，黃連通過其有效成分作用于宿主細胞炎性因子信號通路，調(diào)節(jié)炎性因子分泌，從而實現(xiàn)干預鴨腸炎病毒感染所致病理發(fā)生發(fā)展過程的目的。

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（編輯 白永平）