小反芻獸疫LAMP 反應結果可視化檢測方法比較研究

摘 要：環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術是一種可應用于各種病原體檢測、基因分型等領域的等溫擴增技術。該技術所需設備簡單且易于操作，因此具有較大的發展潛力。根據目前已經存在的判定LAMP結果的可視化方法，以可能對野生小反芻動物造成威脅的小反芻獸疫病毒（Peste des petits ruminantsvirus，PPRV）cDNA為檢測對象，選擇合適的引物組，比較評估均可在日光或紫外光下區分陰陽性結果的SYBR Green I、SYBR Safe Stain 和羥基萘酚藍（hydroxynaphthol blue，HNB）3種指示劑方法的適用性與靈敏度。結果表明：3種方法的靈敏度都很高，均與瓊脂糖凝膠電泳相當。其中，SYBR Green I結果區分度高、不受體系成分影響且無須額外設備，但成本較高；SYBR Safe Stain具有良好的結果區分度，成本相對較低，但需要額外的紫外照射設備；HNB成本最低，但顏色區分度較低，且易受多種因素影響。建議在選擇LAMP指示劑時，綜合考慮成本、使用便利性、結果準確性及實驗條件，通過充分的體系優化和驗證，確保LAMP檢測的準確性和可靠性。研究結果突顯了不同方法的特征和適用場景，為研究人員根據不同場所與條件選擇高效、便捷的LAMP反應結果可視化方法提供參考。

關鍵詞：環介導等溫擴增；SYBR Green I；SYBR Safe Stain；羥基萘酚藍；小反芻獸疫病毒

中圖分類號：S855. 3

文獻標識碼：A

文章編號：2310 - 1490（2024）- 03 - 0664 - 06

DOI：10.12375/ysdwxb.20240324

環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術是由Notomi等于2000年研發的一種新型恒溫擴增技術［1］，其作為一種新興的核酸擴增技術，可在等溫條件下實現目的產物的擴增，因而備受關注。該技術利用兩對引物，在bst 聚合酶的作用下首先形成具有莖環結構的啞鈴狀產物，其后內引物再次結合莖環結構上的部分單鏈，同時模板鏈延伸并剝離新形成的單鏈，該過程多次重復最終得到長度不等的花菜樣的結構產物，目前已經應用于各種病原體檢測［2?3］、基因分型［4］等領域，由于這種技術不需要復雜昂貴的熱循環儀，并且可以在較短的時間內產生大量擴增產物，因此在野外檢測與基層檢測領域展現出了巨大的發展潛力。為了進一步提高LAMP檢測的實用性，研究人員開發了不同類型的結果判定方法，旨在實現更為靈敏、特異和便捷的結果判定，如基于DNA染料結合核酸時被激發出強烈熒光原理的嵌合染料法，基于金屬離子濃度變化的金屬離子指示劑法［5］和基于pH 變化的pH指示劑顯色法［6］等。

小反芻獸疫（peste des petits ruminants，PPR）是一種由副黏病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒屬（Morbillivirus）的小反芻獸疫病毒（Peste des petits ruminantsvirus，PPRV）引起的烈性病毒性傳染病［7］，目前發現該病的野生宿主有巖羊（Pseudois nayaur）、盤羊（Ovis ammon）和蒙古賽加羚羊（Saiga tatarica mon?golica）等［8?10］，傳染性與致死率極高，嚴重威脅畜牧業發展與野生動物安全［11］。一種快速簡便、可應用于野外與基層的檢測方法有利于預防小反芻獸疫的傳播，因此已有多組研究人員開發了不同的小反芻獸疫LAMP檢測方法［12?14］。

本研究收集分析已開發的小反芻獸疫病毒的LAMP引物組，并選擇可以檢測全部4個譜系PPRV的引物組進行檢測，比較評估SYBR Green I、SYBRSafe Stain 和羥基萘酚藍（hydroxy naphthol blue，HNB）3種指示劑的適用性與靈敏度，并對這3種方法與瓊脂糖凝膠電泳法進行對比和總結，突顯不同方法的特征和適用場景，為研究人員根據不同的場所與情況選擇合適的方法提供參考，為野生動物保護提供重要的技術支持。

1 材料

1. 1 主要試劑

PPRV cDNA 受贈于哈爾濱獸醫研究所的尹鑫研究員。Bst 2. 0 WarmStart DNA 聚合酶和10 mmol/LdNTPS購自New England Biolabs公司；羥基萘酚藍購自上海麥克林生化科技股份有限公司；SYBR Green I購自Biosharp公司；SYBR Safe Stain 購自APExBIO公司。

1. 2 實驗儀器

電泳儀（型號：PowerPac HV）購自Bio-Rad（美國）公司；凝膠成像系統（型號：KETA GL）和PCR儀（型號SEDI G）購自威泰克（中國香港）有限公司；干式恒溫器（型號：MK-20）購自杭州奧盛儀器（中國）有限公司；紫外分光光度計（型號：NanoDrop One）購自賽默飛（美國）公司。

2 方法

2. 1 引物篩選

通過檢索分析已發表LAMP檢測小反芻獸疫病毒的文獻，最終選擇Rajko-Nenow 等［12］設計的引物組進行分析。使用常規PCR 引物（Primer F/R）對N基因片段進行PCR擴增。引物均由北京睿博興科生物技術有限公司合成（表1）。

2. 2 LAMP 初始反應體系

LAMP總反應體系為25. 0 μL，各組分濃度分別為FIP、BIP 各0. 8 μmol/L，F3、B3 各0. 1 μmol/L，dNTPS 1. 4 μmol/L，MgSO4 6. 0 mmol/L，1×IsothermalAmplification buffer，Bst 2. 0 WarmStart DNA 聚合酶8. 0 U，PPRV 模板1. 0 μL，無菌水補充至25. 0 μL。反應參數設定為65 ℃，60 min，然后升至95 ℃，2 min，以終止反應。