鄱陽湖周邊農(nóng)田生境中越冬白鶴和鴻雁腸道微生物多樣性研究

摘 要：為了掌握鄱陽湖周邊農(nóng)田生境中越冬白鶴（Leucogeranus leucogeranus）和鴻雁（Anser cygnoides）的腸道微生物多樣性，利用高通量測序技術(shù)，對來自五星墾殖場和康山墾殖場的200份白鶴、鴻雁糞便樣品進行檢測。結(jié)果表明：厚壁菌門（Firmicutes）是白鶴腸道菌群的絕對優(yōu)勢菌門，厚壁菌門和變形菌門（Proteobacteria）是鴻雁腸道菌群的絕對優(yōu)勢菌門，白鶴腸道菌群多樣性低于鴻雁，且二者腸道菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異。白鶴和鴻雁共攜帶184種病原菌，包括動物病原菌、人獸共患病病原菌和植物病原菌。白鶴攜帶的病原菌種類和數(shù)量均少于鴻雁，其中解沒食子酸鏈球菌巴氏亞種（Streptococcus gallolyticus subsp. pasteurianus）、糞腸球菌（Enterococcus faecium）和鉛黃腸球菌（E. casseliflavus）是白鶴和鴻雁攜帶的主要病原菌。研究結(jié)果為了解鄱陽湖越冬候鳥腸道微生物結(jié)構(gòu)提供了依據(jù)，并對制定越冬候鳥保護管理策略具有一定的參考價值和現(xiàn)實意義。

關(guān)鍵詞：鄱陽湖；農(nóng)田生境；白鶴；鴻雁；腸道微生物多樣性

中圖分類號：Q93

文獻標識碼：A

文章編號：2310 - 1490（2024）- 03 - 0551 - 10

DOI：10.12375/ysdwxb.20240311

腸道微生物與宿主在長期的進化過程中形成了一種協(xié)同進化且復雜的共生關(guān)系［1?2］。鳥類腸道菌群易受到多方面因素的影響而處于動態(tài)變化之中，其主要影響因素有種類、棲息環(huán)境、遷徙路線和食性等［3?5］。近年來，受氣候變化、水文條件改變等因素影響，鄱陽湖自然濕地呈現(xiàn)不同程度退化，鄱陽湖區(qū)域的越冬候鳥逐漸離開自然生境，前往周邊農(nóng)田覓食，其中鶴類和雁類數(shù)量最多［6?7］。鄱陽湖區(qū)域周邊農(nóng)田中以五星墾殖場和康山墾殖場的越冬候鳥分布最為集中。五星墾殖場地處南昌市東郊鯉魚洲，臨近湖區(qū)，全場總面積52 km2，場內(nèi)水域廣闊，水草資源豐富［7］。康山墾殖場位于余干縣西南部，鄱陽湖東南岸，全境面積約42 km2，是鄱陽湖與三江交互影響形成的濱湖灘地［7］。在鄱陽湖周邊農(nóng)田分布的越冬候鳥的食物組成與自然生境中的存在差異，且越冬候鳥分布呈現(xiàn)高密度、長時間集群特征，與人、家畜和家禽接觸的機會較多。食性和生境的改變顯著影響候鳥的腸道微生物結(jié)構(gòu)，而且鳥類作為病原微生物的天然載體，其獨特的飛行能力和極強的地理擴散能力為病原微生物的傳播和擴散提供了有利條件［8］。在鄱陽湖周邊農(nóng)田生境中，候鳥高密度集群及與人、家畜和家禽的頻繁接觸進一步提升了病原微生物傳播和擴散的風險。因此，掌握鄱陽湖周邊農(nóng)田生境中越冬候鳥腸道微生物結(jié)構(gòu)，對于制定候鳥保護策略、維護候鳥安全越冬具有重要意義。本研究以在五星墾殖場和康山墾殖場覓食、棲息的白鶴（Leucogeranus leucogera?nus）和鴻雁（Anser cygnoides）為研究對象，利用高通量測序技術(shù)，對其腸道微生物結(jié)構(gòu)進行研究，以期為鄱陽湖越冬候鳥保護管理及安全越冬提供依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 樣品采集

2022年10月—2023年3月，于五星墾殖場和康山墾殖場白鶴、鴻雁棲息密度較大的區(qū)域采集新鮮糞便樣品200 份，其中白鶴和鴻雁糞便樣品各100份（圖1）。在所有樣品的采集過程中全部使用一次性用具，以避免樣品交叉污染。糞便樣品采集后置于裝有無水乙醇的離心管中，其他死亡鳥類及羽毛樣品用一次性塑封袋采集后標記必要信息，所有樣品采集后快速低溫運送至實驗室于冰箱中-80 ℃保存。

1. 2 樣品處理及核酸提取

樣品恢復至室溫，使用液氮將樣品充分研磨，從每份研磨后的樣本中稱取0. 1 g糞便粉末進行同物種十合一混樣，最終得到白鶴、鴻雁糞便混合樣本各10 份。使用TaKaRa MiniBEST Universal GenomicDNA Extraction Kit試劑盒提取糞便樣品總DNA，提取的DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性和大小，并利用紫外分光光度計對DNA進行定量。

1. 3 細菌16S rRNA 基因擴增

選用長度約為468 bp的細菌16S rRNA 基因高度可變的V3—V4區(qū)進行擴增。PCR擴增選用細菌16S rRNA V3—V4區(qū)特異性引物，338F（5′-barcode+ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′），806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。上游引物中的barcode是一個7個堿基的寡核苷酸序列，用來區(qū)分同一文庫中的不同樣品。PCR擴增產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切取目的片段后用Axygen凝膠回收試劑盒回收目的片段。

1. 4 文庫構(gòu)建及質(zhì)檢

利用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit對PCR產(chǎn)物定量，然后使用TruSeq Nano DNA LT LibraryPrep Kit 建庫。取1 μL 文庫，在Agilent Bioanalyzer上用Agilent High Sensitivity DNA Kit 對文庫做2100質(zhì)檢，確保構(gòu)建的文庫具有單一峰，無接頭，最后利用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit對文庫定量，合格的文庫計算后濃度應(yīng)在2 nmol/L以上。

1. 5 文庫測序

在Illumina NovaSeq上利用NovaSeq 6000 SP ReagentKit（500 cycles）進行2×250 bp的雙端測序。首先將上機的文庫（Index 不可重復）梯度稀釋到2 nmol/L，然后按所需數(shù)據(jù)量比例混樣。混好的文庫經(jīng)0. 1 mol/L NaOH變性成單鏈進行上機測序。所上文庫量的多少可根據(jù)實際情況控制在15～18 pmol/L。

1. 6 數(shù)據(jù)處理與分析

使用QIIME2 2019. 4軟件對微生物組生物學信息進行分析。原始序列數(shù)據(jù)使用demux插件解碼處理，用cutadapt插件切除引物，然后使用DADA2插件對序列進行質(zhì)量過濾、去噪、拼接和嵌合體去除等數(shù)據(jù)處理。對上述獲得的序列按100%的序列相似度進行歸并，生成特征性序列ASVs（amplicon sequencevariants）以及豐度數(shù)據(jù)表格。通過采用Greengenes2數(shù)據(jù)庫將ASV特征序列與數(shù)據(jù)庫中的參考序列相比對，獲取每個ASV所對應(yīng)的分類學信息。將豐度值低于全體樣本測序總量十萬分之一的ASV去除，獲得去除了稀有ASV的豐度矩陣。使用QIIME2軟件對ASV豐度矩陣中每個樣本的序列總數(shù)在不同深度下隨機抽樣，以每個深度下抽取到的序列數(shù)及其對應(yīng)的ASV數(shù)繪制稀疏曲線，然后計算每個樣本的Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Pielou’s均勻度指數(shù)，比較不同樣品的豐富度和均勻度。使用R軟件和QIIME2軟件，基于UniFrac距離度量進行β 多樣性分析，通過主坐標分析（PCoA）進行可視化，并使用ANOSIM分析評價各組間微生物群落結(jié)構(gòu)差異的顯著性。通過將特征性序列ASVs與MBPD數(shù)據(jù)庫中的參考序列比對來鑒定病原菌。MBPD數(shù)據(jù)庫是一個基于16S rRNA基因測序檢測動植物及人獸共患類病原細菌的多病原細菌檢測系統(tǒng)，其涵蓋了1 986種已報道病原細菌的72 685條序列［9］。在進行病原菌鑒定時，將序列一致性閾值設(shè)置為99%，經(jīng)BLAST比對后生成病原分類學信息和豐度數(shù)據(jù)表，對獲得的病原信息再進行人工核對，以確保病原鑒定結(jié)果的準確性。使用R軟件和Origin pro軟件進行數(shù)據(jù)分析和作圖。

2 結(jié)果

2. 1 測序結(jié)果

通過測序，20個樣本共獲得1 875 930條原始數(shù)據(jù)，經(jīng)過質(zhì)量過濾、去噪、拼接和嵌合體去除等數(shù)據(jù)處理，共獲得1 454 949條有效序列（表1）。

將有效數(shù)據(jù)按100%的序列相似度進行歸并，生成特征性序列ASVs。ASV通過與數(shù)據(jù)庫比對進行物種注釋后，各樣本最終注釋到界、門、綱、目、科、屬、種水平上的ASVs數(shù)目見圖2。20個樣本注釋的ASV 平均為436個，其中樣本Yan10最少（194個），Yan9樣本最多（1 189個）。

從樣本中隨機抽取一定測序量的數(shù)據(jù)，統(tǒng)計它們所代表的物種數(shù)目，以抽取的測序數(shù)據(jù)量與對應(yīng)的物種多樣性來構(gòu)建稀疏曲線，結(jié)果見圖3。從稀疏曲線可以看出，當測序深度達到20 000以后，觀測樣本多樣性逐漸趨于平緩。本研究中每個樣本的平均測序深度約為93 000條（表1），說明本研究中的測序深度能夠反映白鶴和鴻雁糞便樣本中的微生物構(gòu)成。

2. 2 白鶴和鴻雁腸道微生物種類差異

20個樣本共注釋到43門746屬933種細菌，其中白鶴樣本注釋到34門465屬555種細菌，鴻雁樣本注釋到39門634屬786種細菌。在門水平上，白鶴樣品中厚壁菌門（Firmicutes）是絕對優(yōu)勢菌門，在所有白鶴樣品中的平均相對豐度為93. 14%；鴻雁樣品中厚壁菌門和變形菌門（Proteobacteria）是絕對優(yōu)勢菌門，在所有鴻雁樣品中的平均相對豐度為91. 07%（厚壁菌門為57. 14%，變形菌門為33. 93%）（圖4A）。在屬水平上，白鶴樣品的優(yōu)勢菌屬有乳桿菌屬（Lactobacillus）、鏈球菌屬（Streptococcus）、腸球菌屬（Enterococcus）和Turicibacter；鴻雁樣品的優(yōu)勢菌屬有乳桿菌屬、鏈球菌屬、腸球菌屬、歐文氏菌屬（Erwinia）和假單胞菌屬（Pseudomonas）（圖4B）。所有樣本相對豐度排名前10的菌屬見表2。

2. 3 白鶴和鴻雁腸道菌群結(jié)構(gòu)差異

α 多樣性分析表明，白鶴和鴻雁腸道菌群多樣性存在顯著差異，鴻雁腸道菌群在豐富度（Chao1指數(shù)）、多樣性（Shannon指數(shù)）和均勻度（Pielou’s均勻度指數(shù)）上均顯著高于白鶴（圖5）。

通過PCoA 分析白鶴和鴻雁腸道菌群的β 多樣性。從圖6A 中可以看出，第1 主成分（PCo1）和第2主成分（PCo2）對所有樣本差異的貢獻率分別為37. 3% 和14. 2%，累積貢獻率為51. 5%。白鶴和鴻雁樣本在圖中均能獨自聚類，且沒有重疊，表現(xiàn)為獨立分布。ANOSIM 也表明，白鶴和鴻雁腸道菌群在組間存在顯著差異（圖6B）。

在所有注釋的腸道細菌中，白鶴和鴻雁共有的腸道細菌有353屬，白鶴獨有的腸道細菌有112屬，鴻雁獨有的腸道細菌有281屬（圖7A）。根據(jù)所有樣本在其屬水平的物種注釋和豐度信息，選取豐度排名前10的屬，根據(jù)其在每組樣本的平均豐度信息，在物種層面進行聚類，繪制熱圖（圖7B）。從圖7B中可以看出，白鶴和鴻雁腸道微生物種類在屬水平上存在較大差異。白鶴樣本中土壤桿菌屬（Agrobacterium）、冷桿菌屬（Psychrobacter）、鏈球菌屬和Turicibacter 的豐度較高，鴻雁樣本中不動桿菌屬（Acinetobacter）、歐文氏菌屬、乳桿菌屬、假單胞菌屬、乳球菌屬（Lactococcus）和腸桿菌屬（Enterobacter）的豐度較高。以上結(jié)果表明，白鶴和鴻雁腸道菌群結(jié)構(gòu)存在顯著差異。

2. 4 白鶴和鴻雁腸道病原菌差異

白鶴和鴻雁樣本共鑒定病原菌184種，包括植物病原菌、動物病原菌和人獸共患病病原菌。在剔除植物病原菌后，還剩余156種病原菌，其中白鶴攜帶動物病原菌90種，人獸共患病病原菌8種，共計98種；鴻雁攜帶動物病原菌122種，人獸共患病病原菌10種，共計132種。鴻雁攜帶的動物病原菌和人獸共患病病原菌均高于白鶴。所有樣本中豐度排名前10的病原菌分別是解沒食子酸鏈球菌巴氏亞種（Streptococcus gallolyticus subsp. pasteurianus）、成團泛菌（Pantoea agglomerans）、糞腸球菌（Enterococcusfaecium）、鉛黃腸球菌（E. casseliflavus）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、魯氏不動桿菌（Acinetobacter lwof?fii）、格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）、居中克呂沃爾氏菌（Kluyvera intermedia）、菠蘿泛菌（Pantoea anana?tis）和盲腸腸球菌（Enterococcus cecorum）（表3）。

2. 5 白鶴和鴻雁腸道病原菌群落結(jié)構(gòu)差異

對白鶴和鴻雁攜帶病原菌的群落結(jié)構(gòu)進行分析表明，白鶴和鴻雁共同攜帶74種病原菌，白鶴單獨攜帶24 種病原菌，鴻雁單獨攜帶58 種病原菌（圖8A）。在所有樣本相對豐度排名前20的病原菌中，白鶴和鴻雁共同攜帶的病原菌有17種，說明白鶴和鴻雁攜帶的病原菌雖然在種類和數(shù)量上存在較大差異，但攜帶的主要病原具有較高的一致性。白鶴攜帶的主要病原有解沒食子酸鏈球菌巴氏亞種、糞腸球菌和鉛黃腸球菌，這3種病原菌的平均相對豐度占白鶴攜帶病原菌的97. 82%。鴻雁攜帶的主要病原有解沒食子酸鏈球菌巴氏亞種、成團泛菌、鉛黃腸球菌、糞腸球菌、蠟樣芽孢桿菌、魯氏不動桿菌和格氏乳球菌，這7種病原菌的平均相對豐度占鴻雁攜帶病原菌的81. 92%。在共有的高豐度病原中，白鶴樣本中解沒食子酸鏈球菌巴氏亞種和糞腸球菌的平均相對豐度均高于鴻雁樣本（圖8B）。以上數(shù)據(jù)表明，鄱陽湖周邊農(nóng)田生境中白鶴攜帶的病原菌數(shù)量和種類均少于鴻雁，且攜帶的關(guān)鍵高豐度病原菌數(shù)量也更少。

3 結(jié)論與討論

腸道微生物能夠與宿主共同進化，是宿主腸道微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在調(diào)節(jié)宿主新陳代謝、生長、發(fā)育、免疫功能、病原體防御、生態(tài)適應(yīng)和進化方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［10?12］。腸道微生物的組成和多樣性受到各種內(nèi)外因素的影響，如年齡、遺傳背景、性別、食物、季節(jié)、地理和環(huán)境等［13?15］。分析野生動物腸道微生物組成和病原菌攜帶水平，對于了解野生動物種群生理健康狀況并制定相應(yīng)保護管理對策至關(guān)重要。細菌16S rRNA基因的V3—V4可變區(qū)是鑒定微生物群落使用最廣泛的區(qū)域，因為該區(qū)域長度適中且異質(zhì)性小，相較于其他可變區(qū)，能在更低的測序深度下獲得更高的文庫覆蓋率［16?17］。因此，在本研究中，使用來自該區(qū)域的基因序列對鄱陽湖周邊農(nóng)田白鶴和鴻雁的腸道微生物進行高通量測序和分析。

鄱陽湖周邊農(nóng)田生境中白鶴腸道微生物共有34門465屬555種，鴻雁腸道微生物共有39門634屬786種。厚壁菌門和變形菌門是白鶴和鴻雁腸道微生物群落的優(yōu)勢菌門，該研究結(jié)果與其他許多鳥類的腸道菌群結(jié)構(gòu)一致，如大天鵝（Cygnus cygnus）、白鷺（Egretta garzetta）和黑天鵝（Cygnus atratus）等［18?19］。大量研究也證實，厚壁菌門在幾乎所有脊椎動物的腸道中都是優(yōu)勢菌門，這種現(xiàn)象可能與厚壁菌門的功能相關(guān)。厚壁菌門可降解食物中的糖和脂肪，產(chǎn)生能量和其他營養(yǎng)物質(zhì)，在食物消化、能量代謝、營養(yǎng)物質(zhì)調(diào)控吸收和抵抗病原侵染等方面發(fā)揮重要作用［20?21］。與鴻雁腸道菌群結(jié)構(gòu)不同的是，白鶴腸道菌群中厚壁菌門的平均相對豐度（93. 14%）顯著高于鴻雁（57. 14%）。對比其他已有研究的鶴類，厚壁菌門在丹頂鶴（Grus japonensis）、白枕鶴（Antigonevipio）和白頭鶴（Grus monacha）的腸道菌群中也具有較高的相對豐度（64. 93%～88. 42%）［22?23］。此外，在同域分布的黑頸鶴（G. nigricollis）、灰鶴（G. grus）和斑頭雁（Anser indicus）中，厚壁菌門在黑頸鶴和灰鶴腸道菌群中的相對豐度沒有顯著差異，但顯著高于斑頭雁［24］，表明親緣關(guān)系較近的物種，其腸道菌群結(jié)構(gòu)可能也具有較高的相似性。α 多樣性和β 多樣性分析表明，鄱陽湖周邊農(nóng)田生境中白鶴腸道微生物多樣性顯著低于鴻雁。造成這種差異的原因除了與宿主遺傳背景相關(guān)外，可能也與白鶴和鴻雁的食性有關(guān)。在自然生境中，白鶴主要采食刺苦草（Vallis?neria spinulosa）、眼子菜（Potamogeton distinctus）等沉水植物的塊莖，而在人工生境中主要采食水稻和蓮藕［25］。相較于沉水植物塊莖，水稻和蓮藕的營養(yǎng)價值更高，但營養(yǎng)成分較單一，在滿足相同能量需求的條件下，白鶴在人工生境采食的植物種類和數(shù)量理論上要少于自然生境。相較于白鶴，鴻雁在鄱陽湖的不同生境中均主要以薹草（Carex tristachya）、禾本科（Poaceae）等草類為食，食源種類更為豐富［26］。擬桿菌門和變形菌門通常被認為與禾本科的攝入有關(guān)，而放線菌的含量會隨著宿主纖維素攝入量的增加而增加［27?28］。對比白鶴和鴻雁的腸道菌群可以發(fā)現(xiàn)，雖然鴻雁腸道菌群中厚壁菌門的平均相對豐度顯著低于白鶴，但擬桿菌門、變形菌門和放線菌門的平均相對豐度均高于白鶴。此外，厚壁菌門在白鶴腸道菌群中占有絕對優(yōu)勢也可能是其食物和營養(yǎng)結(jié)構(gòu)單一的體現(xiàn)。因此，筆者認為鄱陽湖周邊農(nóng)田生境中白鶴和鴻雁的腸道菌群結(jié)構(gòu)體現(xiàn)了腸道微生物對宿主食性變化的適應(yīng)機制。

在病原菌攜帶方面，白鶴攜帶病原菌98種，包含90種動物病原菌和8種人獸共患病病原菌；鴻雁攜帶病原菌132種，包含122種動物病原菌和10種人獸共患病病原菌。相較于鴻雁，白鶴攜帶的關(guān)鍵病原菌數(shù)量更少，且豐度更高。解沒食子酸鏈球菌巴氏亞種是白鶴和鴻雁攜帶的最主要病原，其是一種人獸共患病病原菌，在人類感染中主要引起新生兒的腦膜炎和菌血癥，而火雞、鵝等家禽感染該菌會引起脾炎、實質(zhì)性心肌炎、心包膜炎和腦膜炎等組織病變，且死亡率較高［29］。近些年，因鄱陽湖自然生境退化，大量白鶴和鴻雁開始在鄱陽湖周邊農(nóng)田、藕田等人工生境中聚集，且數(shù)量眾多［7，30］。因高密度聚集導致的個體間打斗以及食物競爭導致的免疫力降低等現(xiàn)象均使越冬白鶴和鴻雁易受病原菌的侵染。此外，鄱陽湖周邊農(nóng)田中分布有大量散養(yǎng)的家禽，越冬白鶴和鴻雁時常與家禽混群，而白鶴和鴻雁還攜帶有較多人獸共患病病原，因此具有引起疫病暴發(fā)的潛在威脅。在對鄱陽湖越冬候鳥的保護管理中，建議積極推進白鶴和鴻雁自然棲息地的修復，避免其在人工生境中高密度聚集。同時，保護管理部門應(yīng)出臺相應(yīng)保護管理政策，禁止鄱陽湖周邊農(nóng)戶散養(yǎng)家禽，減少越冬候鳥與人畜接觸的機會，從而降低疫病傳播擴散風險。

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