甘肅省甘藍黑腐病的病原分離及鑒定

摘要：為明確甘肅省張掖市甘藍黑腐病的病原菌種類，采用平板劃線法對采集到的甘藍典型發病葉片進行病原菌分離、致病性測定及基因序列分析鑒定。結果表明，從具有典型黑腐病的甘藍葉片上分離純化獲得6個分離株，其中菌株GL3-2為引起該病害的病原菌，為革蘭氏陰性菌，菌落近似圓形，初呈淡黃色，后漸變為蜜黃色，菌落邊緣整齊光滑， 有隆起，且具光澤；菌體多呈短桿狀， 大小為（0.5～1.0）μm×（1.0～3.0）μm，無芽孢，單生或鏈生。根據培養性狀、形態特征以及16S rDNA和特異性基因序列分析，確定致病菌菌株GL3-2為野油菜黃單胞菌野油菜致病變種（Xanthomonas campestris pv. campestris）。

關鍵詞：甘藍黑腐病菌；病原菌；分離；鑒定

中圖分類號：S635；Q938 文獻標志碼：A 文章編號：2097-2172（2024）08-0779-06

doi：10.3969/j.issn.2097-2172.2024.08.015

Isolation and Identification of the Pathogen Causing Black Rot of

Cabbage in Gansu Province

HE Shuwen 1， WEI Xingying 2， XU Yongfeng 1， YANG Chengde 2， WANG Zehao 1， HUA Jun 1

（1. Zhangye Plant Protection and Phytosanitary Station， Zhangye Gansu 734000， China; 2. College of Plant Protection，

Gansu Agricultural University， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract： To clarify the pathogen causing cabbage black rot in Zhangye City， Gansu Province， the cabbage leaves with typical disease symptoms were collected for pathogen isolation， purification by using plate scribing method. The pathogenicity was determined， and pathogen also was identified by morphological characteristics and molecular biology methods. The results showed that 6 isolates were obtained， among which GL3-2， Gram-negative， was pathogenic bacteria. Its colony was round， light yellow at first， and then honey yellow gradually. The colony edges were neat， smooth， and glossy; Most of the bacteria were short rods with the size of（0.5 to 1.0） μm ×（1.0 to 3.0） μm. No spores， solitary or chained， extremely solitary flagella. GL3-2 was identified as Xanthomonas campestris pv. campestris based on culture traits， morphological characteristics， 16S rDNA and specific genes sequence analysis.

Key words： Black rot of cabbage; Pathogen; Isolation; Identification

甘藍（Brassicao leracea var. capitata）屬十字花科蕓薹屬，草本植物，最早發現于地中海至北海沿岸地區，16世紀左右由俄羅斯以及東南亞地區傳入我國，因其口感美味且具有極高的食用價值和營養價值而深受人們喜愛［1 ］。甘藍在全球各地均廣泛種植，尤其在中國更具有悠久的種植栽培文化歷史，播種面積逐年增加［2 ］，目前我國甘藍播種總面積在93.6萬hm2以上，且栽培總面積連年遞增，在我國蔬菜的供給以及進出口貿易中占據市場主導地位［3 ］。黑腐病是危害甘藍生長的重要病害之一，感病后導致幼苗期和成株期甘藍不能正常生長。成株期感染，出現葉斑和葉脈變黑，影響植株正常生長，嚴重時可導致大面積死亡，給甘藍生產帶來極大危害。20世紀50年代末，甘藍黑腐病（Xanthomonas campestris）在我國華北地區被首次發現，至20世紀70年代中期，甘藍黑腐病在我國山西、北京以及山東等地區大面積傳播，造成適宜甘藍栽培的種植區域不斷減少［4 ］。至20世紀80年代，甘藍黑腐病在我國各栽培地區全面暴發，使得甘藍及其他十字花科蔬菜產業受到嚴重威脅，發生嚴重時造成甘藍減產近70%，極大地降低了甘藍的品質和出口量，這也成為影響甘藍經濟效益的主要因素之一［5 ］。近年來，由于部分甘藍生產地區多年連作，加之夏季陰雨連綿，甘藍黑腐病大面積發生和傳播，且逐年加重［6 ］。有關甘藍黑腐病的研究國內外均有較多報道，但關于引起甘肅省甘藍黑腐病的病原種類是否與國內外報道一致，還需有待進一步確定。因此，我們以采自甘肅省張掖市甘藍種植基地具備甘藍黑腐病典型特征的標本為研究對象，對其進行癥狀描述、病原菌分離、致病性測定及基因序列分析鑒定，以期為甘肅省甘藍黑腐病田間診斷提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 供試甘藍品種為甘中11號，購自甘肅省蘭州市安寧區農資市場。 供試甘藍黑腐病標本采自甘肅省張掖市黨寨鎮汪家鋪村甘藍大田。將甘藍種子經過浸種、催芽處理后，播種于直徑為20 cm的花盆內（栽培基質為蛭石和營養土按體積比為1∶1的比例混合而成），每盆8～12株，出苗后每盆保苗6株。

1.1.2 儀器及器材 打孔器、接種針、滅菌鍋、培養箱、培養皿、搖床、錐形瓶、移液槍、Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒（B518259-0100）由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，光學顯微鏡（Ni-U 顯微鏡）由日本 Nikon 公司提供。

1.1.3 供試培養基 牛肉膏蛋白胨培養基（NA培養基）：瓊脂18 g，葡萄糖8 g，蛋白胨6 g，牛肉膏3 g，蒸餾水1 000 mL；NB培養基：瓊脂18 g，酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，蒸餾水1 000 mL，NaCl 10 g；LB培養基：NaCl 10 g，胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 甘藍黑腐病菌的分離

采用平板劃線分離法進行分離。在無菌條件下，用滅菌的手術刀切取甘藍葉片病健交界處組織（1 cm×1 cm），利用1 g/kg升汞表面消毒1 min，無菌水連續反復沖洗3次，置于無菌研缽中研磨后靜置2～3 min，用滅菌的接種針（或滅菌竹簽）蘸取上清液，并在NA培養基上劃線，28 ℃下培養3～5 d，純化后進行編號，并于4 ℃保存備用［7 ］。

1.3 致病性測定

采用致傷接種法進行致病性測定。將分離物接種于NA培養基上進行活化培養，28 ℃培養3～5 d。經活化的分離物接種至NB培養液中（50 mL），180 r/min振蕩培養2～3 d，獲得細菌懸浮液。利用分光光度計將菌懸液濃度調整至1×105個/mL（利用培養液進行稀釋），并針刺致傷后噴霧接種，以接種無菌水的植株作為對照（CK），3次重復，室內保濕48 h后，逐天觀察發病情況，對出現癥狀的植株進行再分離，將再分離物的菌落形態以及菌體形態等與接種分離物進行比較，利用柯赫氏法則進行病原菌鑒定。

1.4 病原菌的形態學觀察

參照董漢松等［8 ］的《植病研究方法》將分離和純化的甘藍黑腐病菌株接種至NA培養基上，進行四區劃線，觀察單菌落的形態、大小以及顏色等，記錄并拍照。對病原菌（菌齡18～24 h）進行革蘭氏染色，觀察病原菌菌體的顏色和形狀，測量菌體的大小。

1.5 病原菌的16S rDNA基因序列分析鑒定

1.5.1 基因DNA的提取 參照Alvarez等［9 ］的方法，選用Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒及其方法提取病原菌的基因組DNA［10 ］，具體方法按試劑盒說明進行。

1.5.2 PCR擴增 利用通用引物27F（5'-AGA GTTTGATCCTGGCTCAG-3）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）進行16S rDNA的PCR擴增，參考楊麗萍等［11 ］的方法并經優化后應用于本試驗。擴增體系為：Master Mix 22 μL；DNA 1 μL；1492R 1 μL；27F 1 μL。

擴增產物檢測方法：取6 μL擴增產物在含有1.2%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，由西安擎科生物工程有限公司對具特異性條帶的擴增產物進行測序，所得序列于BLAST比對，用Mega 7.0采用鄰接法（Neighbor-Joining methods）構建系統發育 樹［12 ］，初步確定病原菌的分類地位。

進一步利用野油菜黃單胞菌的特異性引物（DLH120，DLH125；Zup2309，Zup2310）進行擴增［13 ］。擴增體系參照張娜娜等［14 - 15 ］的方法進行。擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳、測序和比較分析，最終構建系統發育樹，以進一步鑒定。

1.6 數據處理

利用SPSS 25.0和DPS進行數據處理，用Excel 2016軟件進行統計分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 病原菌分離及致病性測定

2.1.1 病害癥狀 甘藍黑腐病苗期、成株期均可發病。幼苗染病，子葉水漬狀，導致枯死或逐漸蔓延至真葉，最后整株枯死。成株期多從葉緣開始，逐步向內擴展，形成V型黃褐色病斑，健部界限不明顯，且病斑周圍組織變黃（圖1A、圖1B）。有時病菌沿葉脈向里擴展，形成網狀黑脈或黃褐色大斑塊；若病菌從植株傷口侵入，可在葉片的任何部位形成不規則形的黃褐色病斑；天氣干燥時，葉片病斑干而脆；濕度較大時，發病部位腐爛，無臭味（圖1C、圖1D）。與已報道癥狀相似［16 - 17 ］。

2.1.2 病原菌分離 從張掖市甘藍種植地采集的具有典型黑腐病的甘藍葉片上分離得到6個分離物，分別命名為GL1、GL2、GL3-1、GL3-2、GL4-1、GL4-2。其中GL1菌落圓形，邊緣整齊，淡黃色（圖2A）；GL2菌落近圓形，淺黃色，表面干燥，粗糙（圖2B）；GL3-1菌落近圓形，扁平，淺白色，菌體濕潤，半透明（圖2C）；GL3-2菌落圓形，偏小，凸起，黃色，有光澤（圖2D）；GL4-1菌落淺白色，光滑，扁平（圖2E）；GL4-2菌落圓形，邊緣光滑，淺黃色，扁平（圖2F）。

2.1.3 致病性測定 將6株分離物進行盆栽致病性測定結果（圖3）可知，接種5～7 d后，接種分離物GL1、GL2、GL3-1的甘藍葉片和CK均未發生明顯癥狀，接種分離物GL4-1和GL4-2的甘藍植株葉片在2 d后逐漸開始失水、萎蔫，皺縮（圖3b、圖3c）；接種GL3-2的甘藍植株葉片3 d后逐漸變黃，且出現病斑，病斑形狀近似“V”字，多呈淡褐色，且邊緣明顯出現黃色暈圈（圖3d、圖3e、圖3f），與田間甘藍黑腐病的典型癥狀一致，并在發病植株上再次分離得到接種分離物GL3-2。依據柯赫氏法則［18 ］，將GL3-2分離菌物確定為甘肅省甘藍黑腐病病原菌。

2.2 病原菌鑒定

2.2.1 病原菌的菌落特征及形態 將病原菌GL3-2接種于NA平板上，28 ℃培養18～24 h后，菌落近圓形，前期淡黃色，后期逐漸變為蜜黃色，菌落邊緣完整，有凸起，且具光澤。通過革蘭氏染色呈陰性，菌體多數呈短桿狀，大小為（0.5～1.0） μm×（1.0～3.0） μm，無芽孢，菌體多為單生或鏈生（圖4Ⅰ、圖4Ⅱ、圖4Ⅲ）。

2.2.2 基因序列分析鑒定 以病原菌GL3-2的基因組DNA為模板，利用27F和1492R通用引物對16S rDNA進行擴增、測序，并在Blast中進行相似性分析、同源性比對，選擇同源性較高的序列，使用Mega7.0軟件采用鄰接法（Neighbor-joining）構建系統發育樹，病原菌與Xanthomonas campestris（登錄號：KR708907.1）和X. arboricola pv. pruni（登錄號：LC388643.1）等同源性均高（相似度達99%），且在系統發育樹上聚在同一分支，初步鑒定為野油菜黃單胞桿菌屬（Xanthomonas sp.）（圖5）。為進一步分析鑒定，利用兩對特異性引物擴增、測序和比較分析，構建系統發育樹，結果（圖6）表明GL3-2與X. campestris pv. campestris（登錄號：CP142008.1、CP017319.1和AP019682.1等）的同源性均很高（相似度達99%），且在系統發育樹上聚在一起。根據形態特征和分子生物學鑒定，確定GL3-2為野油菜黃單胞桿菌野油菜致病變種（X. campestris pv. campestris）。

3 討論與結論

蔬菜是人類日常生活必需的副食品，其中，甘藍是居民餐桌上的重要蔬菜之一。甘藍所含營養成分相當豐富，其中包含有優質的蛋白質、纖維素、礦物質以及維生素等，且甘藍所含的植化素還可預防癌癥和冠狀動脈等疾病［19 ］。據報道，20世紀80年代以前，甘肅省甘藍年種植基數基本穩定于666.7 hm2左右。近年來，甘肅省甘藍年種植面積約6 666.7 hm2，在全省各地均已有分布［20 - 21 ］。但是，隨著高原夏菜大面積種植，甘藍病害在很多種植區發生嚴重，嚴重影響甘藍的質量和產量。

黑腐病的寄主范圍相當廣泛，主要危害甘藍、結球白菜和不結球白菜等十字花科蔬菜［22 - 23 ］。本研究從張掖市甘藍種植地采集的具有典型黑腐病的甘藍葉片上分離得到細菌6個分離株，其中菌株GL3-2為引起該病害的病原菌，為革蘭氏陰性菌，菌落近似圓形，初呈淡黃色，后漸變為蜜黃色，菌落邊緣整齊光滑，有隆起，且具光澤；菌體多呈短桿狀，大小為（0.5～1.0）μm×（1.0～3.0）μm，無芽孢，單生或鏈生。根據培養性狀、形態特征以及生物學鑒定，明確了甘肅省甘藍黑腐病病原菌GL3-2為野油菜黃單胞桿菌野油菜致病變種（Xanthomonas campestris pv. campestris），與蘆燕［24 ］、解永梅等［25 ］、鄭學立等［26 ］和Afrin等［27 ］對大白菜黑腐病和甘藍黑腐病病原菌的鑒定結果一致。為了更精確地鑒別了病原菌種類，本試驗參考Burlakoti等［13 ］的方法對甘藍黑腐病的病原鑒定采用多基因序列分析方法，對黃單胞菌屬中的不同種細菌進行快速檢測，與金夢軍等［28 ］通過利用多基因鑒定的方法對高寒草地青藏苔草拮抗內生細菌進行了鑒定類似，有效地避免了利用單一基因鑒定過程中出現的偶然現象。本研究結果為甘肅省甘藍黑腐病的診斷提供了依據，也為后期進一步深入研究奠定基礎。

參考文獻：

［1］ 黃德芬，李成瓊，司 軍，等. 甘藍黑腐病生理小種劃分及其抗病性鑒定研究進展［J］. 中國蔬菜，2011，（18）：6-10.

［2］ 張亞宏，張 巖，張桂榮，等. 優質甘藍型冬油菜新品種天油18號選育報告［J］. 寒旱農業科學，2023，2（11）：1013-1016.

［3］ 王 新. 花椰菜黑腐病的發生癥狀及防治措施［J］. 上海蔬菜，2018（2）：45；79.

［4］ 韓風慶，李占省，劉玉梅，等. 青花菜黑腐病發病規律及綜合防治措施［J］. 中國蔬菜，2019（11）：98-101.

［5］ 張大為，劉 燁，李繼平，等. 蘭州市高原夏菜病蟲害種類調查及防治現狀［J］. 甘肅科技縱橫，2019，48（9）：15-17.

［6］ 胡 燕，周 娜，鄭 陽，等. 甘藍黑腐病研究進展［J］. 南方農業，2019，13（1）：63-65.

［7］ 胡 燕，周 娜，鄭 陽，等. 甘藍黑腐病的發生及綜合防治［J］. 植物醫生，2018，31（12）：35-36.

［8］ 董漢松，劉志恒，朱建蘭. 植病研究法［M］. 北京：中國農業出版社，2012.

［9］ ALVAREZ A M， BENEDICT A A， MIZUMOTO C Y， et al. Serological， pathological， and genetic diversity among strains of Xanthomonas campestris infecting crucifers［J］. Phytopathology， 1994， 84： 1449-1457.

［10］ 魏立娟. 辣椒炭疽病菌的鑒定、綜合防治及互作后辣椒基因差異表達［D］. 蘭州：甘肅農業大學，2019.

［11］ 楊麗萍，金夢軍，崔凌霄，等. 甘肅省櫻桃黑斑病病原菌的分離及鑒定［J］. 果樹學報，2020，37（6）：891-899.

［12］ 丁嘉儀，鄧宇慧，李國豪，等. 毛竹耐鉛內生細菌分離及其16S rDNA鑒定［J］. 寒旱農業科學，2023，

2（8）：740-744.

［13］ BURLAKOTI R R， CHEN J， HSU C， et al. Molecular characterization，comparison of screening methods， and evaluation of cross-pathogenicity of black rot（Xanthomonas campestris pv. campestris） strains from cabbage， choy sum，leafy mustard and pakchoi from Taiwan［J］. Plant Pathology，2018， 67（7）： 1589-1600.

［14］ 張娜娜，溫曉蕾，李雙民，等. 三種鐮刀菌引起的板栗內腐病病原菌鑒定［J］. 中國農業科技導報，2022，

24（7）：117-122.

［15］ 張娜娜，李雙民，溫曉蕾，等. 板栗紅粉病病原菌鑒定及其生物學特性研究［J］. 中國農業科技導報，2021，23（7）：145-52.

［16］ 劉志恒. 十字花科蔬菜軟腐病和黑腐病［J］. 新農業，2002（8）：38-39.

［17］ 王迪軒. 十字花科蔬菜黑腐病無公害防治［J］. 當代蔬菜，2004（4）：35.

［18］ 唐 偉，張成玲，王 芳，等. 甘薯基腐病病原鑒定及生長特性測定［J］. 南方農業學報，2022，53（7）：1917-1924.

［19］ 王 芳，韓浩章，張 穎. 不同藥劑對多肉植物黑腐病和炭疽病的防效研究［J］. 安徽農學通報，2020，

26（7）：86-87；98.

［20］ 梁元凱，夏正麗，劉潤安，等. 甘藍黑腐病識別與綜合防控技術［J］. 西北園藝（蔬菜），2016（1）：43-44.

［21］ 郭鳳霞. 甘肅省甘藍生產現狀與發展對策［J］. 甘肅農業科技，1998（7）：31-32.

［22］ 李永鎬，徐麗波. 甘藍黑腐病苗期抗病性鑒定方法的研究［J］. 東北農學院學報，1990，21（2）：125-129.

［23］ 吳國順. 日本對幾種蔬菜病害抗病性鑒定方法的研究［J］. 中國蔬菜，1994（1）：59-60.

［24］ 蘆 燕. 大白菜黑腐病病原菌鑒定和抗病性鑒定方法研究［D］. 楊凌：西北農林科技大學，2008.

［25］ 解永梅，張成玲，趙永強，等. 山東省大白菜黑腐病病原的鑒定及其生物學特性的研究［J］. 山東農業科學，2007（6）：68-70.

［26］ 鄭學立，謝鑫鑫，林 峰，等. 福建地區不結球白菜黑腐病病原菌的分離與初步鑒定［J］. 福建農業學報，2017，32（12）：1335-1340.

［27］ AFRIN K S， RAHIM M A， RUBEL M H， et al. Development of race-specific molecular marker for Xanthomonas campestris pv. campestris race 3， the causal agent of black rot of rucifers［J］. Canadian Journal of Plant Science， 2018， 98（5）： 1119-1125.

［28］ 金夢軍，李珊珊，田文波，等. 高寒草地青藏苔草拮抗內生細菌篩選、鑒定及其促生作用測定［J］. 植物保護學報，2019，46（4）：779-786.