電分離/富集-信號放大一體化策略用于農藥殘留精準檢測

摘要 表面增強拉曼散射（SERS）作為一種高靈敏分析技術，在環境分析和食品安全等領域具有良好的應用潛力。SERS 傳感器極易受到環境基質的干擾，因此，采用前處理等方法消除環境因素的干擾非常重要。其中，構建電分離/富集-檢測一體化分析策略是實現復雜樣本中痕量荷電分子精準檢測的重要策略之一。本研究以絲網印刷電極（SPCE）為載體，采用電化學還原一步法制備還原氧化石墨烯（RGO）和金納米顆粒（AuNPs）復合物（Au-RGO）負載的SPCE，結合電動捕獲技術進行荷電分子的選擇性分離和高效富集，利用Au-RGO 的信號放大作用，實現了對西瑪津、殺草強、甲基對硫磷和馬拉硫磷4 種農藥殘留的高靈敏SERS檢測。本方法的線性檢測范圍寬（0.001～500 μmol/L），檢出限為0.3～2.0 nmol/L。將本方法用于果蔬樣品的檢測，檢測結果與氣相色譜-質譜方法的檢測結果一致。本方法避免了傳統SERS 傳感器用于環境和食品分析時面臨的復雜基質干擾和前處理繁瑣等問題，為環境污染物的現場快速檢測提供了技術參考。

關鍵詞 表面增強拉曼散射；傳感器；電富集；石墨烯；農藥

農藥對保護作物和減少產量損失發揮了重要作用[1-2]。但是，農藥濫用會對人類健康和生態環境造成嚴重危害[3-4]。因此，建立農藥殘留快速準確的檢測方法意義重大。傳統的農藥殘留快速檢測方法包括比色法和電化學分析法等，具有操作簡便、測定快速和分析范圍廣等優勢，但是這些方法選擇性低，并且所用試劑或材料會污染環境[5-8]。表面增強拉曼光譜（Surface enhanced Raman spectroscopy， SERS）作為一種可用于現場快速檢測的分析技術，具有高靈敏度、高選擇性、無損以及可實時快速檢測等優勢，在環境污染物即時檢測領域備受關注[9-11]。目前， SERS 傳感器用于環境分析的常規方式是將納米材料與樣本共孵育后進行檢測，該方法雖然簡單，但是極易受到環境基質的干擾，從而影響SERS 信號的重現性和準確性[12]。為了有效解決該問題，常需要采用復雜的樣品前處理步驟，由于需要多步操作，容易產生假陽性和假陰性結果[13]。

電分離技術是一種利用外加電場實現分析物有效分離的方法，具有可精準調控和綠色環保等特點[14-15]。結合SERS 和電分離各自的優點，有望實現復雜樣品中痕量組分的精準檢測。目前，文獻報道的對于農藥的SERS 檢測中的常規預濃縮過程通常耗時且復雜，并且大多只能在特定條件下使用[16]。電動捕獲（Electrokinetic trapping， EKT）提供了一種通過靜電力將帶電分子驅動至SERS 基底的新策略[17-18]。Lacharmoise 等[19]利用外加電場實現了染料分子的選擇性吸附和SERS 檢測，靈敏度為500 nmol/L。Li 等[20]利用電沉積法制備Ag-SPE 電極，并用于苯胺和苯酚衍生物的電富集SERS 分析，檢測時間小于5 min。但是，目前電富集-SERS 技術也面臨一些亟待解決的問題，如樣品用量大、穩定性和重現性較差、檢測靈敏度低等，構建分離/富集-檢測一體化裝置是解決該問題的關鍵。

本研究以絲網印刷碳電極（Screen-printed carbon electrode， SPCE）為載體，采用電化學還原一步法制備了還原氧化石墨烯和金納米顆粒復合物（Gold nanoparticles-reduced graphene oxide， Au-RGO）負載的SPCE 芯片，結合EKT 的特異捕獲和SERS 的多組分同時檢出的優勢，可實現對多種荷電農藥的原位選擇性分離和高效富集，利用Au-RGO 的信號放大作用，實現痕量農藥的高靈敏SERS 檢測。與文獻報道的分析方法相比[21-22]，本方法利用EKT 可精準調控荷電分子的吸附行為，實現亞nmol/L 級農藥的快速篩查。將EKT 和SERS 技術相結合，可實現在一滴水樣中多種農藥殘留的同時檢測，有效降低了假陽性和假陰性的發生率，為現場監測提供了準確可靠的分析技術。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

FEI-Sirion 200 場發射掃描電子顯微鏡（美國FEI 電子光學公司）；BWS415-785S 便攜式拉曼光譜儀（美國必達泰克公司）；CHI 660D 電化學工作站（上海辰華儀器有限公司）；UV2600 紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；DS-1 高速組織搗碎機（上海標本模型廠）；Milli-Q 超純水凈化系統（上海泰坦科技股份有限公司）。

HAuCl4·3H2O、Na2HPO4、NaH2PO4、K3Fe（CN）6、H3BO3、H3PO4、氧化石墨烯（Graphene oxide，GO）粉末和冰醋酸（阿拉丁試劑（上海）有限公司）；孔雀石綠（Malachite green， Mal）、蘇丹紅Ⅲ（Sudanred Ⅲ， SR）、甲基對硫磷（Methyl-parathion， Mep）、西瑪津（Simazine， Sim）、殺草強（Amitrole， Ami）、馬拉硫磷（Malathion， Mal）、3，5-二氯苯酚（3，5-Dichlorophenol， 3，5-DCP）、4-硝基-1H-吡唑-3-甲酸（4-Nitro-1H-pyrazole-3-carboxylic acid， 4-NPC）、4-硝基苯基膦酸二鈉（Disodium 4-nitrophenylphosphonate，4-NPP）和4-膦酰基丁酸三乙酯（4-Phosphonylbutyrate triethyl ester， 4-PPB）均為分析純試劑（分子結構見電子版文后支持信息圖S1），購自國藥集團化學試劑有限公司。110 型絲網印刷電極（SPCE，西班牙Metrohm DropSens 公司）的工作電極和對電極均為碳，參比電極為Ag/AgCl。實驗用水為超純水（18.2 MΩ·cm）。

準確稱取適量農藥標準品，加入5 mL 無水乙醇，西瑪津和殺草強用Britton-Robinson 緩沖液（pH=5.0±0.5）定容至50 mL， 甲基對硫磷和馬拉硫磷用Britton-Robinson 緩沖液（pH=9.0±0.5）定容至50 mL，得到1 mg/L 的農藥標準溶液。避光冷藏保存，使用時稀釋至所需濃度。

1.2 實驗方法

1.2.1 電沉積液的制備

將4 mg GO 粉末分散在4 mL 超純水中，超聲2 h， 逐滴加入80 μL HAuCl4 溶液（0.5 mg/mL），常溫條件下攪拌5 min， 制得電化學沉積液。

1.2.2 Au-RGO@SPCE 電極的制備

將SPCE 在超純水中超聲清洗3 min， 氮氣吹干。將SPCE 工作區域完全浸入0.5 mol/L H2SO4 中，在–1.0 ～ +1.0 V 電位范圍內循環伏安掃描直至得到較穩定的電化學信號，用超純水沖洗， N2 吹干后備用。

將預處理好的SPCE 電極浸入制備的電沉積液中，在–1.5 ～ +0.6 V 電位范圍內循環伏安掃描20 圈（掃描速度50 mV/s）后，用超純水沖洗， N2 吹干，即得Au-RGO@SPCE。為了進一步比較， 將電沉積液替換為1 mg/mL GO 或0.5 mg/mL HAuCl4，采用同樣的方法制備RGO@SPCE 或Au@SPCE。

1.2.3 荷電分析物的EKT-SERS分析

以乙醇-水（1∶1， V/V）為溶液稀釋液，采用分級稀釋法配制不同濃度的農藥溶液。為了實現正電荷分析物（ Mal、Ami 和Sim）的選擇性分離， 將20 μL 含有不同濃度正電荷分析物的溶液滴加到Au-RGO@SPCE 上恒壓處理5 min， 電壓為?0.15 V （vs. Ag/AgCl）；用于富集負電荷分析物（SR、Mep 和Mal）時，將20 μL 含不同濃度負電荷分析物的溶液滴加到Au-RGO@SPCE 上，在+0.15 V （vs. Ag/AgCl）下恒壓處理5 min，采用超純水沖洗電極表面， N2 吹干后進行SERS 分析。測試條件如下：785 nm 激光（10 mW）， 積分時間35 s， 放大倍數/數值孔徑為10×/0.25 的顯微物鏡聚焦。

1.2.4 實際樣品分析

蘋果、橙子和蔬菜購自本地超市。將果皮切成1 cm×1 cm 大小，用組織搗碎機勻漿處理，準確稱取勻漿1.0 g 于10 mL 離心管中，加入5 mL 無水乙醇，渦旋振蕩2 min， 以4500 r/min 離心5 min， 取2 mL 上清液用0.22 μm 濾膜過濾，濾液用Britton-Robinson 緩沖液（pH=5.0±0.5 或pH=9.0±0.5）定容至10 mL，隨后進行SERS 測試。對于添加回收實驗，移取10 μL 不同濃度的農藥標準溶液，滴加在1 cm×1 cm 的果皮表面，在室溫下自然晾干，后續處理與上述方法相同。

2 結果與討論

2.1 Au-RGO@SPCE的制備與表征

制備的RGO@SPCE、Au@SPCE 和Au-RGO@SPCE 的掃描電鏡（SEM）圖如圖1A～1C 所示，可見電極表面沉積了多層褶皺狀RGO 及高密度金納米顆粒（Gold nanoparticles， AuNPs）結構， AuNPs 粒徑在10～30 nm 之間。如圖1D 所示， GO、RGO 和Au-RGO 在1300 和1600 cm–1 處均出現明顯的拉曼位移，分別對應石墨烯結構的D 帶和G 帶，其中， Au-RGO 中RGO 的D/G 的強度（ID/IG=1.9）最大，表明GO 已被還原為RGO[23]。采用電化學阻抗譜進一步研究了Au-RGO@SPCE 的界面特性。如圖1E 所示， Au-RGO 修飾SPCE 的電荷轉移電阻（Charge transfer resistance， Rct）最小，這可能是由于RGO 和AuNPs 具有良好導電性能[24]。X 射線光電子能譜（電子版文后支持信息圖S2A～S2C）顯示， AuNPs 已成功負載在RGO 表面。此外，由X 射線光電子能譜（圖1F）的高分辨C1s 譜可見， RGO 導致285.7 eV 的C—N 峰強度增加，并且286.1 eV 處C—OH 峰強度明顯降低，這主要歸因于GO 轉變為RGO[25]。紫外-可見吸收光譜（見電子版文后支持信息圖S3）顯示， Au-RGO@SPCE 在245 和520 nm 處具有明顯的吸收峰，分別歸屬于C=C 鍵的π → π *躍遷[ 26]和AuNPs 的表面等離子共振信號[ 27]。以上結果表明，已成功制備Au-RGO@SPCE 材料。

2.2 Au-RGO@SPCE的電分離/富集-SERS性能研究

考察了沉積循環圈數、HAuCl4 濃度和掃描速率對Au-RGO@SPCE 的SERS 性能的影響（電子版文后支持信息圖S4 和S5），結果表明，循環掃描20 圈、HAuCl4 濃度為60 μmol/L、掃描速率為50 mV/s 時，MG 在795 cm–1 處的拉曼信號強度最大。進一步探究了外加電壓對Au-RGO@SPCE 的SERS 性能的影響，結果見電子版文后支持信息圖S6 和S7。當外加電壓分別為–0.15 V 和+0.15 V （vs. Ag/AgCl）時， MG和SR 的SERS 信號強度達到最大值。

為了進一步探究富集時間對Au-RGO@SPCE 的SERS 性能影響，測定了不同初始濃度（1000、100 和10 nmol/L）的MG 在不同富集時間時的SERS 光譜。由圖2 可見，隨著富集時間延長， MG 在795 和1365 cm–1 處的的拉曼特征峰強度逐漸增加，約5 min 后達到穩定。SR 分子也顯示出相似的結果（電子版文后支持信息圖S8）。上述結果表明，在極低的待測物濃度下，通過施加電位可以對荷電分子進行高效分離和富集，從而實現高靈敏度和高特異性檢測。

為了進一步驗證Au-RGO@SPCE 的SERS 性能，選擇Sim、Ami、Mep 和Mal 4 種農藥進行測試，結果如圖3 所示。結合EKT 和SERS，可實現對4 種農藥的高特異性檢測，農藥濃度與SERS 特征峰強度呈良好的線性關系， Sim、Ami、Mep 和Mal 的檢出限分別為2.0、0.6、0.3 和0.8 nmol/L， 此傳感器檢測上述4 種農藥的線性范圍和檢出限優于文獻報道方法（見電子版文后支持信息表S1）。

2.3 Au-RGO@SPCE的選擇性、重復性及穩定性

為了驗證Au-RGO@SPCE 的選擇性，考察了調控外加電位對MG 和SR 混合溶液的SERS 譜圖的影響，結果如圖4 所示。當外加電位為–0.15 V（vs. Ag/AgCl）時，隨著電富集時間延長， MG 的信號逐漸增強；當電位切換為0.15 V （vs. Ag/AgCl）時， MG 的信號逐漸降低，而SR 的信號逐漸增強，這主要歸因于外加電場誘導的荷電分子的選擇性吸附[28]。考察了干擾物對于荷電農藥SERS 檢測的影響。采用Au-RGO@SPCE 測試混合溶液的SERS 光譜，混合溶液包括帶正電農藥及干擾分子（Sim、Sim、4-NPC 和3，5-DCP）、帶負電農藥及干擾分子（Mep、Mal、4-PPB 和4-NPP），結果見電子版文后支持信息圖S9。當外加電壓為–0.15 V （vs. Ag/AgCl）時， Sim（623 和980 cm–1）和Ami（1044 和1289 cm–1）的特征峰清晰可見（電子版文后支持信息表S2 和S3）。類似地，當外加電壓為+0.15 V （vs. Ag/AgCl）時，出現Mep（657 和1351 cm–1）和Mal（1030 和1078 cm–1）的特征峰（電子版文后支持信息表S4 和S5），帶相同電荷的干擾物（4-NPC、3， 5-DCP、4-PPB 和4-NPP）對上述特征峰不產生干擾。

考察了Au-RGO@SPCE 的批內和批間信號重現性，在同一個Au-RGO@SPCE 上隨機選取8 個點采集SERS 光譜，如電子版文后支持信息圖S10A 和S10B 所示， 1350 cm–1 的處的拉曼信號強度的相對標準偏差（RSD）為3.97%。在相同條件下，對同一批次的10 個Au-RGO@SPCE 和5 個不同批次Au-RGO@SPCE進行SERS 測試，測定1 μmol/L MG 標準溶液的響應信號RSD 分別為5.42%和6.72%（電子版文后支持信息圖S10C 和S10D），表明Au-RGO@SPCE 具有良好的批內和批間重現性。考察了儲存時間對傳感器的SERS 性能的影響， Au-RGO@SPCE 保存5 周后，其SERS 檢測性能變化很小（電子版文后支持信息圖S10E 和S10F）。上述結果表明，制備的Au-RGO@SPCE 具有良好的選擇性、重現性和儲存穩定性。

2.4 果蔬樣品中多種農藥殘留的同時檢測

為了驗證EKT-SERS 方法用于實際樣品中多種農藥殘留分析的可行性，采集了Au-RGO@SPCE 檢測不同果蔬樣本的SERS 譜圖。如圖5A 所示，橘子和蔬菜中檢出微量農藥殘留。在果蔬樣品中添加不同濃度的Sim（120 ng/cm2）和Sim（80 ng/cm2）， SERS 譜圖顯示出加標農藥的特征信號（圖5B）， EKT 處理前后農藥的SERS 光譜變化較大（圖5C），同時利用EKT-SERS 方法與GC-MS 方法對加標樣本進行分析，兩種方法檢測結果的偏差小于10%（圖5D）。上述結果證明，基于Au-RGO@SPCE 的EKT-SERS 策略可用于實際樣品中多種農藥殘留的檢測，結果準確、可靠。

3 結論

建立了一種基于Au-RGO@SPCE 的EKT-SERS 的分析新策略，采用電化學還原一步法制備SERS 基底，利用EKT 技術的選擇性分離和富集特點，實現了多種荷電農藥的原位分離和富集，并利用Au-RGO的信號放大能力，實現了多種痕量農藥的高靈敏SERS 檢測。本方法可用于復雜樣本中農藥殘留的現場快速篩查和精準分析，有望在環境分析和食品安全領域得到廣泛應用。

References

[1] YANG Y Q， O′RIORDAN A， LOVERA P. Sens. Actuators， B， 2022， 364： 131851.

[2] FATHI F， LAGUGNé-LABARTHET F， PEDERSEN D B， KRAATZ H B. Analyst， 2012， 137（19）： 4448-4453.

[3] GONG J， MIAO X， ZHOU T， ZHANG L. Talanta， 2011， 85（3）： 1344-1349.

[4] ZHANG Y， YANG L， SUN C， HUANG C， ZHU B， ZHANG Q， CHEN D. Anal. Chim. Acta， 2022， 1221： 340148.

[5] LIU Bin， HUANG Yong-Xing， LIAN Hui-Ting， WU Hong-Mei. J. Electrochem. ， 2011， 17（3）： 323-328.

劉斌， 黃詠星， 連惠婷， 吳紅梅. 電化學， 2011， 17（3）： 323-328.

[6] JING Chao， LONG Yi-Tao. J. Electrochem. ， 2023， 29（6）： 2218006.

靜超， 龍億濤. 電化學， 2023， 29（6）： 2218006.

[7] REN J， LI H W， CHEN L， ZHANG M， LIU Y X， ZHANG B W， XU R， MIAO Y Y， XU X M， HUA X， SUN X G， YU R J，LONG Y T， HU S S. Research， 2023， 6： 0019.

[8] JING Le-Gang. Food Sci. ， 2002， 23（3）： 148-152.

井樂剛. 食品科學， 2002， 23（3）： 148-152.

[9] ZHENG Si-Qing， LI Dan， DENG Wei， SI Wen-Shuai， BAI Bing. Chin. J. Anal. Chem. ， 2020， 48（12）： 1687-1693.

鄭思傾， 李丹， 鄧維， 司文帥， 白冰. 分析化學， 2020， 48（12）： 1687-1693.

[10] MA X， XIE J， WANG Z， ZHANG Y. Spectrochim. Acta， Part A， 2022， 267： 120542.

[11] CHEN L， GUAN Y， ZHENG S， FODJO E K， DENG W， LI D. Anal. Chem. ， 2023， 95（33）： 12427-12434.

[12] CHEN Ying， MEI Rong-Chao， WANG Yun-Qing， LIU Wan-Hui， CHEN Ling-Xin. Chin. J. Anal. Chem. ， 2023， 51（3）： 356-367.

陳穎， 梅榮超， 王運慶， 劉萬卉， 陳令新. 分析化學， 2023， 51（3）： 356-367.

[13] YAO Y， WANG G， CHU G， AN X， GUO Y， SUN X. New J. Chem. ， 2019， 43（35）： 13816-13826.

[14] LI D， DUAN H， WANG Y， ZHANG Q， CAO H， DENG W， LI D. Microchim. Acta， 2018， 185（1）： 10.

[15] ZHANG Q， LI D， CAO X， GU H， DENG W. Anal. Chem. ， 2019， 91（17）： 11192-11199.

[16] COSTA J C S， ANDO R A， CAMARGO P H C， CORIO P. J. Phys. Chem. C， 2011， 115（10）： 4184-4190.

[17] LI Y T， QU L L， LI D W， SONG Q X， FATHI F， LONG Y T. Biosens. Bioelectron. ， 2013， 43： 94-100.

[18] LI D， CAO X， ZHANG Q， REN X， JIANG L， LI D， DENG W， LIU H. J. Mater. Chem. A， 2019， 7（23）： 14108-14117.

[19] LACHARMOISE P D， LE RU E C， ETCHEGOIN P G. ACS Nano， 2009， 3（1）： 66-72.

[20] LI D， LI D W， FOSSEY J S， LONG Y T. Anal. Chem. ， 2010， 82（22）： 9299-9305.

[21] ZHANG W， RUAN G， LI X， JIANG X， HUANG Y， DU F， LI J. Anal. Chim. Acta， 2019， 1071： 17-24.

[22] ZHAI W， CAO M， XIAO Z， LI D， WANG M. Foods， 2022， 11（22）： 3597.

[23] GUO H L， WANG X F， QIAN Q Y， WANG F B， XIA X H. ACS Nano， 2009， 3（9）： 2653-2659.

[24] YANG Y， LI Y， ZHAI W， LI X， LI D， LIN H， HAN S. Anal. Chem. ， 2021， 93（2）： 946-955.

[25] LIU J， FU S， YUAN B， LI Y， DENG Z. J. Am. Chem. Soc. ， 2010， 132（21）： 7279-7281.

[26] LI D， MüLLER M B， GILJE S， KANER R B， WALLACE G G. Nat. Nanotechnol. ， 2008， 3（2）： 101-105.

[27] SHIMIZU T， TERANISHI T， HASEGAWA S， MIYAKE M. J. Phys. Chem. B， 2003， 107（12）： 2719-2724.

[28] YAN Z， XIA M， WANG P， ZHANG P， LIANG O， XIE Y H. J. Phys. Chem. C， 2016， 120（23）： 12765-12772.