糖化白蛋白檢測方法的研究進展

摘要糖尿病是一組以持續性高血糖為特征的慢性代謝性疾病，糖尿病及其并發癥已成為嚴重的全球性公共衛生問題，但目前仍缺乏有效的治療手段。血糖水平監測是糖尿病病情監測的一種有效手段。人血清白蛋白（HSA）與血液中的葡萄糖經非酶促糖基化反應的產物為糖化白蛋白（GA），因GA 可反映過去2～3 周內的總體血糖水平，可作為血清標志物，在糖尿病患者短期血糖控制評估、療效觀察以及治療方案調整等方面具有重要價值。因此， GA 的簡便、快速、低成本、高靈敏和高選擇性檢測對糖尿病的治療和病情監測意義重大。本文系統歸納總結了GA 的檢測方法，重點闡述了各種檢測方法的原理及優缺點，對GA 檢測方法近年來的研究進展進行了評述，最后對其發展趨勢進行了展望。

關鍵詞糖化白蛋白；糖化血紅蛋白；糖尿病；血糖監測；非酶促糖基化；評述

糖尿病是一組由多病因引起的以持續性高血糖為特征的代謝性疾病。糖尿病及其并發癥（如心臟病、中風、腎衰竭、糖尿病足、白內障、失明和神經損傷等）嚴重影響全球數億人的健康及生活質量，已成為嚴重的全球性公共衛生問題[1]。國際糖尿病聯盟（IDF）的報告顯示[1]， 2019 年，我國20～79 歲成年人糖尿病患病人數約為1.16 億（患病率高達10.9%），已成為全球糖尿病患病人數最多的國家；同時，由于不健康的飲食習慣等因素，我國糖尿病患病人數仍在持續快速增長，預計到2030 年，該年齡段糖尿病患病人數將高達1.41 億。目前尚無根治糖尿病的方法，一經確診，需終身治療。現階段，血糖監測是糖尿病管理的一種重要手段。

目前，臨床常用的血糖監測指標包括即刻血糖（包括指尖快速血糖和靜脈血糖）水平和糖化蛋白（如糖化血紅蛋白和糖化白蛋白）含量等。即刻血糖水平只能體現靜態的某一瞬時的血糖值，無法反映一段時間內的血糖水平，并且檢測結果易受飲食、藥物和情緒等因素的影響[2]。糖化蛋白是血糖與蛋白質發生非酶促糖基化反應的產物[3]（糖化蛋白形成過程如圖1 所示）。非酶促糖基化是一種重要的翻譯后修飾，該過程始于還原糖（主要是葡萄糖）的羰基與賴氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）或N 端氨基之間的親核加成反應，且沒有糖基轉移酶的參與[3-4]。非酶促糖基化的過程為：還原糖的羰基與蛋白質上的氨基基團發生縮合反應，形成熱力學不穩定的席夫堿，隨后轉變成相對穩定的Amadori 產物；后者經歷如脫水、氧化、重排和異構化等一系列自發反應可生成多種羰基化合物（如乙二醛、3-脫氧葡萄糖酮和脫氫抗壞血酸等），并最終形成晚期糖基化終末產物（AGEs）[3-4]。糖化蛋白的含量（即非酶促糖基化蛋白占該蛋白質總量的百分數）與血糖水平密切相關，一旦形成，與蛋白質結合的葡萄糖分子將持續存在于該蛋白質分子的整個生命周期中，因此可有效反映一段時間內的血糖水平。其中，糖化血紅蛋白（GHb）是血糖與紅細胞中的血紅蛋白（Hb）結合的產物[5]，其含量能夠反映過去8～12 周內的總體血糖水平，并且與抽血時間、患者是否空腹以及是否使用胰島素等因素無關。GHb 由HbA1a、HbA1b 和HbA1c 組成，其中，HbA1c 約占70%。HbA1c 結構穩定，其含量是國際上公認衡量長期血糖控制的“金標準”（正常范圍為4.0%～6.5%）。糖化白蛋白（GA）是血糖與人血清白蛋白（HSA）相結合的產物[5-6]，其含量能夠反映過去2～3 周內的總體血糖水平（正常范圍為11%～17%）。因此，與HbA1c 相比， GA 在短期血糖控制評估、療效觀察以及治療方案調整等方面更具優勢[6]。此外，在溶血性貧血等Hb 代謝異常的情況下， HbA1c 的含量無法準確反映患者的真實血糖水平，而GA 含量的檢測結果則不受影響[7]。因此，探索建立操作簡便、成本低廉、靈敏度高且選擇性好的GA 含量檢測方法，對于糖尿病患者短期血糖控制評估、療效觀察以及治療方案調整等均具有重要意義。

針對GA 的檢測，科研人員開展了大量的研究工作[8-10]。根據檢測原理的不同，現有的GA 檢測方法主要分為比色分析法[11–13]、熒光分析法[7，14]、液相色譜（LC）法[15-16]、液相色譜-質譜聯用（LC-MS）法[17-18]、拉曼光譜法[19-20]、電化學發光（ECL）法[21]和電化學生物傳感器[22–24]等。本文對GA 的檢測方法進行了歸納與總結，重點闡述了各種檢測方法的原理及優缺點，綜述了其在近年的研究進展，并對GA檢測方法的未來發展趨勢進行了展望。

1 GA的檢測方法

1.1 比色分析法

比色分析方法具有操作簡便、成本低、快速、重現性好以及適合大批量樣品檢測等優勢[25-27]，在分析檢測領域應用廣泛[28-30]。Mcfarland 等[11]報道了一種以硫代巴比妥酸（TBA）為顯色底物的比色分析方法，其檢測原理為在草酸等溶液中， GA 經加熱水解釋放出5-羥甲基糠醛（HMF）， HMF 與TBA 發生反應，產物吸收峰位于443 nm， 溶液呈黃色。然而，研究發現，臨床樣品中的葡萄糖等組分會對檢測結果造成嚴重干擾[12]。由于葡萄糖與蛋白質上氨基酸側鏈結合所形成的酮胺結構具有還原性，在堿性條件下能將硝基藍四唑（NBT）還原并生成紫色的甲臜（吸收峰位于546 nm）， 因而可將NBT 用作GA 比色分析的顯色底物[13]。然而，臨床血清樣品中的丙酮醛和抗壞血酸等還原性物質會對該方法造成嚴重干擾。在加熱條件下， GA 中的酮胺結構經肼處理會轉變成2-酮基葡萄糖，其與苯肼反應可生成淡黃色的葡萄糖苯脎（吸收峰位于390 nm）[31]。雖然該原理已被用于GA 的比色分析，但是臨床血清樣品中的膽紅素、Hb、抗壞血酸和葡萄糖等組分會導致假陽性。GA 經蛋白酶水解產生的糖化氨基酸在酮胺氧化酶的作用下可產生過氧化氫（H2O2），其與N，N-雙（4-磺丁基）-3-甲基苯胺（TODB）在辣根過氧化物酶（HRP）的催化下反應生成藍紫色的醌亞胺化合物（吸收峰位于546 nm）[32]。日本旭化成株式會社基于該方法已開發出商品化的Lucica?GA-L 產品[33]。然而，蛋白酶和過氧化物酶存在價格高、穩定性差等不足。此外，上述比色分析方法均無法有效地區分GA 與GHb 以及其它糖綴合物（如糖蛋白、糖肽和糖類抗原等），因此，檢測前需要對樣品進行預處理，以消除其它組分對檢測結果的干擾。

為實現對GA 的高選擇性比色分析， Cohen 等[34]報道了一種基于雙抗體“夾心型”酶聯免疫吸附分析（ELISA）的方法，其檢測原理為將可與GA 發生特異性親和識別的捕獲抗體作為固定化的分子識別元件，與GA 發生免疫結合后，加入HRP 標記的檢測抗體， HRP 催化H2O2 與顯色底物對苯二胺（pPDA）或3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺（TMB）反應，引起檢測液顏色發生顯著變化，基于此實現GA 的檢測。上海酶聯生物等公司已基于該方法開發出可用于GA 檢測的商品化ELISA 試劑盒。類似地， Kim 研究組[35]構建了一種基于雙抗體“夾心型”ELISA 的側流分析（LFA）裝置，通過分別檢測HSA 和GA 的濃度，實現了對GA 含量的直接檢測。基于抗原-抗體免疫識別的比色分析方法具有很高的選擇性。然而，抗體和酶標抗體具有制備過程復雜、批間差異大、價格高以及穩定性差等不足。為克服上述缺陷， Belsare 等[36]報道了一種基于核酸適配體的比色分析方法，將末端生物素化的適配體通過生物素-親和素相互作用修飾到鏈霉親和素包被的硝酸纖維素膜上，可特異性捕獲由GA 與適配體功能化的金納米粒子（AuNPs）探針結合形成的復合物，使該區域的顏色發生改變。與抗體相比，將適配體作為特異性分子識別元件具有可化學合成、易修飾、成本低及穩定性好等優勢[37-40]。但是，該方法需要使用生物素化的適配體以及鏈霉親和素，存在檢測成本高及穩定性差等不足。

1.2 熒光分析法

相較于比色分析，熒光分析法具有檢測靈敏度高的優勢[41]。研究者分別以丹酰化的苯硼酸衍生物DnsPBA[42]和苯并噻唑-吩噻嗪偶聯物的氰基衍生物TCNP[43]為熒光探針，用于檢測GA 的濃度。這兩種方法盡管操作簡便，但存在選擇性差等不足，無法區分GA 與GHb 等其它糖綴合物。Apiwat 等[7]報道了一種基于核酸適配體的熒光分析方法，以末端修飾有Cy5 的核酸適配體作為特異性分子識別元件，適配體在氧化石墨烯（GO）表面的非特異性吸附能使熒光信號淬滅；在GA 存在的情況下，其與適配體的結合引起后者從GO 表面脫離，從而使得熒光信號恢復，基于此實現了對GA 的高選擇性檢測，檢出限為50 μg/mL。Ghosh 等[14]將適配體的兩端分別修飾CdSe/ZnS 量子點與AuNPs，適配體與GA 的特異性結合使量子點與AuNPs 之間的距離增大，導致兩者之間的熒光共振能量轉移（FRET）效率下降，基于此實現了對GA 的熒光信號增強型檢測。上述基于核酸適配體的熒光方法雖然選擇性好，但是都只能檢測GA的濃度，無法直接確定樣品中GA 的含量（GA 占總HSA 的百分數）。

1.3 LC及LC/MS法

LC 法具有分析速度快、重現性好和操作簡便等優勢，可用于GA 含量的直接檢測。Ducrocq 等[44]基于硼酸鹽親和色譜法，實現了對GA 的高選擇性檢測，并證實了GA 含量與平均血糖水平之間具有很好的關聯性。研究者報道了一種基于陰離子交換柱和硼酸鹽親和層析柱聯用的LC 法[15，45]。該方法利用填充含有二乙氨基的乙烯醇共聚物的陰離子交換柱（AsahipakES-502N）分離HSA 和GA，然后利用硼酸鹽親和柱選擇性吸附分離GA，從而實現對GA 含量的直接檢測。該方法具有分析速度快、準確度高以及所需樣品量少等優良特性。Koyama 等[16]利用苯硼酸（PBA）基團功能化的多孔聚合物顆粒作為色譜交換柱的填充材料，用于GA 含量的直接檢測。由于可實現對GA 含量的直接檢測， LC 法具有很好的臨床應用價值，但是仍存在設備復雜、需要標樣、成本高以及日常維護費用較高等不足。Takei 等[18]將賴氨酸（Lys）和果糖基-Lys 的同位素標記物作為內標加入到HSA 和GA 的混合樣品中，進行氫化、水解處理，獲得脫氧果糖基-Lys（DOF-Lys）和Lys，利用LC/MS 檢測DOF-Lys 和Lys 的濃度，并根據同位素比例即可計算得到樣品中GA 的含量。該方法具有準確度高和重復性好等優點，但需要對樣品進行分離純化處理，并且操作復雜。Brede 等[46]利用胰蛋白酶同時消化HSA 與GA，得到非糖基化和糖基化的兩種短肽，采用基于質譜多反應監測（MRM）模式的LC/MS 分析這兩種短肽的濃度，實現了對GA 含量的直接檢測。在這兩種方法的基礎上， Shin 等[47]將同位素標記的兩種短肽（RQIKKQTALV（D8）E 和RQIKK（fructosyl）QTALV（D8）E）作為內標加入到含有HSA 和GA 的樣品中，利用Glu-C 蛋白酶消化樣品得到非糖基化和糖基化的兩種短肽，采用LC/MS 檢測這兩種短肽的濃度，采用同位素內標，實現了對GA 含量的直接檢測。但是，該方法存在操作復雜、成本高以及需要使用有放射性標記試劑等不足。

1.4 拉曼光譜法

拉曼光譜法具有分析速度快、無損和靈敏度高等優點[48-49]。由于HSA 的非酶促糖基化會導致其拉曼光譜特定振動條帶發生細微的變化， Dingari 等[19]借助多變量分類技術，開發了一種基于滴涂沉積拉曼（DCDR）光譜的GA 檢測方法（圖2），線性檢測范圍為7～250 μmol/L， 檢出限為13.7 μmol/L。該方法幾乎不需要樣品制備過程，無需其它任何試劑，操作簡單，具有良好的選擇性。Lin 等[20]報道了一種基于表面增強拉曼散射（SERS）的GA 含量檢測方法，將GA 與銀納米粒子（AgNPs）混合，并借助于“咖啡環效應”對GA-AgNP 復合物進行預濃縮，隨后通過測量酪氨酸雙峰區域面積比例實現對GA 的直接檢測。為進一步提高檢測靈敏度， Paria 等[50]通過使用鍍銀無序硅納米線（Ag/SiNWs）對檢測信號進行放大，實現了GA 含量的無標記SERS 檢測，對GA 的檢出限為0.5 μmol/L。拉曼光譜法可實現對GA 含量的直接檢測，但其抗干擾能力和重現性等方面有待進一步提高。

1.5 電化學發光（ECL）法

ECL 法具有背景信號低、靈敏度高、響應速度快和操作簡便等優點[51-52]，但在GA 的檢測方面并未得到廣泛應用，目前僅有少量報道。Tamiya 研究組[21]開發了一種基于酶促反應的ECL 檢測方法（檢測原理如圖3 所示），將GA 經蛋白酶水解釋放出N-果糖基-N-Z-賴氨酸（FZK）片段，在果糖基氨基酸氧化酶（FAOx）的作用下產生H2O2，以魯米諾作為ECL 試劑檢測生成的H2O2，從而實現對GA 的定量分析。在此基礎上，借助于蛋白酶解法檢測HSA 和GA 的總含量，即可實現對GA 含量的檢測。該方法對GA 的檢出限低至0.1 μmol/L。實際唾液樣品中GA 濃度的檢測結果表明，樣品至少需要稀釋5 倍，以降低樣品基質中某些組分對ECL 信號的猝滅效應。由于需要使用FAOx 和蛋白酶，該方法存在成本高和操作復雜等不足。

1.6 電化學生物傳感器

電化學生物傳感器由于具有靈敏度高、設備簡單、響應快速、抗干擾能力強以及易小型化等優勢[53-56]而備受關注[22-24]。Hatada 等[22]利用蛋白酶水解GA 產生ε-果糖基賴氨酸（ε-FK），在FAOx 催化作用下，[Ru（NH3）6]3+被還原為[Ru（NH3）6]2+，通過電化學氧化分析[Ru（NH3）6]2+，進而實現對GA 濃度的高靈敏電化學檢測。由于檢測信號強度與GA 的濃度呈正相關，因而這是一種“信號增強”型方法，可有效避免假陽性結果。然而，蛋白酶和FAOx 存在價格高和穩定性差等不足，臨床血清樣品中的某些還原性物質也會對該方法的檢測結果造成嚴重干擾，而且該方法無法有效區分GA 與GHb，因此檢測前需要對樣品進行預處理，以消除GHb 對檢測結果的干擾。為實現對GA 的高選擇性檢測， Bohli 等[23]以GA特異性抗體為固定化的分子識別元件，與GA 特異性結合，引起電極表面的電荷轉移阻抗發生變化，采用電化學阻抗譜（EIS）對GA 的含量進行檢測，線性范圍為7.49%～15.79%。該方法操作簡便、選擇性好，并且可有效避免假陽性結果，但是存在檢測靈敏度較低、抗體制備過程復雜、價格高和穩定性差等不足。Attar 等[24]將可特異性識別GA 的親和肽通過其末端融合的組氨酸標記的綠色熒光蛋白（His6-GFP）部分連接到電極表面，與GA 結合后，借助于PBA 基團與GA 上的葡萄糖分子中的鄰位羥基位點的選擇性結合將PBA 標記的二氫葉酸還原酶（DHFR）偶聯到電極表面， DHFR 能催化二氫葉酸（DHFA）還原生成四氫葉酸（THFA），通過對THFA 進行電化學氧化分析，實現了對GA 濃度的高靈敏檢測，檢出限低至1.0 nmol/L；通過對HSA 濃度進行免疫分析，即可確定樣品中GA 的含量。該方法盡管具有很高的選擇性，并且對假陽性結果具有較好的耐受性，但是存在傳感器制備過程復雜、檢測成本高、穩定性差等不足。Farzadfard 等[57]將AuNPs 負載的還原氧化石墨烯（RGO）修飾到電極表面，然后通過金-硫鍵自組裝的方式固定適配體，其與GA 的特異性識別阻礙了[Fe（CN）6]4?與電極表面的電子傳遞，因此可利用EIS對GA 濃度進行檢測，線性范圍為2～10 μg/mL， 檢出限為0.07 μg/mL。該方法選擇性好且檢測成本低，但只能單獨檢測GA 的濃度。為實現對GA 含量的直接檢測， Bunyarataphan 等[58]將末端生物素化的核酸適配體通過生物素與親和素的相互作用修飾到經鏈霉親和素功能化的絲網印刷碳電極（SPCE）表面，適配體與GA 或HSA 的特異性識別阻礙氧化還原探針[Fe（CN）6]3?與電極表面的電子傳遞，因此可通過測量氧化還原電流的大小實現對樣品中GA 含量的檢測。

2 結論與展望

血糖水平過高會顯著促進蛋白質的非酶促糖基化，從而影響其結構與功能，并導致一系列糖尿病并發癥。GA 是HSA 經非酶促糖基化反應的產物，其含量在糖尿病患者短期血糖控制評估、療效觀察以及治療方案調整等方面具有重要的參考價值。相較于單獨檢測血清樣品中GA 的濃度， GA 含量的檢測在臨床上更具應用價值。然而，作為新型血糖監測指標，由于相關研究相對較少（與圍繞HbA1c 檢測相關研究相比），并且GA 含量會受到營養不良、腎病綜合征以及肝硬化等低蛋白血癥條件的影響[59]，國際上尚未對GA 含量的臨床檢測與應用建立標準化共識。此外，現階段可用于GA 含量直接檢測的方法較少，并存在諸如檢測靈敏度低、操作復雜、抗干擾能力差和檢測成本高等不足。相較于其它方法，電化學生物傳感器具有靈敏度高、設備簡單、響應快速、抗干擾能力強以及易小型化等優勢，在GA 的檢測研究中獲得了較多的關注。然而，實現對臨床樣品中GA 含量的簡便、快速、低成本、高靈敏和高選擇性電化學檢測，仍是一個亟待解決的難題。為實現對HSA 和GA 的高選擇性電化學檢測，常用的分子識別元件為抗體和核酸適配體。核酸適配體除了具有與抗體同等的特異性與親和力之外，還具有可化學合成、批間差異小、易修飾、成本低和穩定性好等優勢，在GA 含量的直接電化學檢測方面具有很好的應用前景。為實現對GA 含量的直接電化學適配體傳感，可采用陣列電極單獨檢測HSA 和GA 的濃度，再通過計算獲得相應含量；為實現在單一基底上對GA 含量的直接電化學適配體傳感，則需要在傳感原理等方面有更大的突破。此外，具有高親和力、高特異性且可用作固定化分子識別元件的適配體的篩選，仍需要更多的研究與探索。

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