黃芪總黃酮對柯薩奇B3病毒誘導的病毒性心肌炎小鼠TLR4/NF-κB信號通路和細胞凋亡的影響

摘要目的：探究黃芪總黃酮（TFA）對柯薩奇B3病毒（CVB3）誘導的病毒性心肌炎（VMC）小鼠模型Toll樣受體4（TLR4）/核因子κB（NF-κB）信號通路和細胞凋亡的影響。方法：將40只小鼠隨機分為對照組、VMC組、VMC＋低劑量TFA組、VMC＋高劑量TFA組，每組10只。VMC組、VMC＋低劑量TFA組、VMC＋高劑量TFA組經CVB3誘導建立VMC小鼠模型，VMC＋低劑量TFA組、VMC＋高劑量TFA組分別以15、30 mg/kg TFA灌胃，VMC組、對照組以等量生理鹽水灌胃。CVB3感染后第11 天超聲檢查小鼠心臟功能，處死小鼠后采用蘇木精-伊紅（HE）染色和脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）染色觀察心肌形態學變化和凋亡情況，酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法檢測心肌組織勻漿液中白細胞介素6（IL-6）、白細胞介素1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平，蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測心肌組織中TLR4、NF-κB p65（p65）、磷酸化NF-κB p65（p-p65）、切割后半胱氨酸蛋白酶-3（Cleaved-Caspase-3）、切割后半胱氨酸蛋白酶-9（Cleaved-Caspase-9）表達。結果：與對照組比較，VMC組小鼠CVB3 mRNA、左室收縮末期內徑（LVESD）、心肌細胞凋亡率、心肌組織中IL-6、IL-1β、TNF-α、TLR4、p-p65/p65、Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9相對表達量明顯升高，左室射血分數（LVEF）明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與VMC組比較，VMC＋低劑量TFA組和VMC＋高劑量TFA組CVB3 mRNA、LVESD、心肌細胞凋亡率、心肌組織中IL-6、IL-1β、TNF-α、TLR4、p-p65/p65、Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9相對表達量明顯降低，LVEF明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；MC＋高劑量TFA組CVB3 mRNA、IL-6、TNF-α水平，細胞凋亡率，TLR4、p-p65/p65和Cleaved-Caspase-9相對表達量明顯低于VMC＋低劑量TFA組，LVEF明顯高于MC＋低劑量TFA組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論：TFA可減輕CVB3誘導的VMC小鼠心肌病理損傷，減少心肌炎癥反應和細胞凋亡，其作用機制與TLR4/NF-κB信號通路、Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9表達的抑制有關。

關鍵詞病毒性心肌炎；黃芪總黃酮；炎癥反應；細胞凋亡；Toll樣受體4；核因子κB；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.15.009

柯薩奇B3病毒（CVB3）是一種無包被的微小RNA病毒，可入侵心肌細胞，誘導病毒性心肌炎（VMC），病理表現為心肌間質存在大量的炎癥細胞浸潤，并伴有心肌細胞壞死［1］。臨床調查發現，VMC可在人群中暴發流行，并發生于各個年齡階段，但在嬰幼兒中具有較高的病死率。雖然多數VMC病人治療效果良好，但部分會遺留心功能異常，還有病人病情可進展為擴張型心肌病，導致不良預后［2］。黃芪是中醫中經典的補氣生肌藥物，現代藥理學研究表明，黃芪總黃酮（TFA）作為黃芪主要活性成分，具有抗病毒、抗氧化應激、抗心律失常等豐富的生物學活性［3-4］。Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）信號通路在VMC的發生發展中有重要作用，可直接介導炎癥反應、細胞凋亡等，參與心肌病理過程［5］。已有研究顯示，TFA在VMC細胞及動物模型有重要的心肌保護作用［6-7］。本研究將從TLR4/NF-κB信號通路角度，進一步驗證TFA改善VMC的效果及機制。鑒于此，本研究初步探討TFA對VMC小鼠TLR4/NF-κB信號通路和細胞凋亡的影響。現報道如下。

1材料與方法

1.1實驗動物及材料

雄性BALB/c小鼠40只，8周齡，體質量20～24 g，由北京維通利華實驗動物公司提供［SCXK（京）2020-0015］。小鼠飼養于20～24 ℃、相對濕度50%～60%的動物房中，晝夜周期為12 h，使用高壓滅菌處理的墊料、飼料及飲水，適應性喂養3 d進入實驗。病毒株 CVB3病毒（Nancy株）購自中國國家實驗細胞共享平臺。

1.2方法

1.2.1動物分組與處理

將小鼠隨機分為對照組、VMC組、VMC＋低劑量TFA組、VMC＋高劑量TFA組，每組10只。對照組注射生理鹽水，其他組小鼠腹腔注射100倍稀釋的CVB3病毒稀釋液0.2 mL，建立VMC小鼠模型，感染72 h后各組隨機取2只小鼠檢測心肌組織中CVB3病毒水平，確定造模是否成功［8］。VMC＋低劑量TFA組、VMC＋高劑量TFA組在造模成功后分別以15、30 mg/kg的TFA灌胃，連續給藥7 d，對照組和VMC組以等量生理鹽水灌胃。

1.2.2實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測心肌組織中CVB3 mRNA水平

感染72 h后各組隨機取2只小鼠采用頸椎拉脫法處死，取心肌組織，加入Trizol溶液（美國Inviteogen公司）提取總RNA，逆轉錄合成cDNA后進行聚合酶鏈式反應（PCR）擴增，CVB3 mRNA正向引物序列為5′-AATCCCTATGGCTGAACG-3′，反向引物序列為5′-GGAGAACACCCTCTTTGC-3′。反應條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共38個循環，最后72 ℃延伸10 min收集擴增產物，采用2－△△Ct法計算CVB3 mRNA水平。

1.2.3小鼠心臟超聲檢測

CVB3感染后第11 天進行心臟超聲檢查，吸入2%異氟烷麻醉小鼠，經高分辨率小動物超聲成像系統（型號為Vcvo2100，加拿大Visualsonics公司）探查，檢測左室射血分數（LVEF）、左室收縮末期內徑（LVESD）和左室舒張末期內徑（LVEDD）。

1.2.4心肌形態學變化的觀察

超聲檢測結束后處死小鼠，快速取出心臟固定，再制成4 μm石蠟組織切片，行蘇木精-伊紅（HE）染色，脫水、封片后鏡下觀察。

1.2.5脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）染色檢測心肌細胞凋亡

取心肌組織石蠟切片，脫水后添加蛋白酶K室溫孵育30 min，滴加TUNEL反應試劑（武漢艾美捷公司）反應，然后3，3′-二氨基聯苯胺（DAB）顯色，蘇木精復染20 s，脫水、封片后鏡下觀察，并計數凋亡細胞。

1.2.6酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法檢測心肌組織勻漿液中炎性因子水平

取心肌組織混入生理鹽水（1∶9比例）勻漿，離心分離上清，參照ELISA測試盒（南京建成生物技術公司）檢測白細胞介素6（IL-6）、白細胞介素1β（IL-1β）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平。

1.2.7蛋白免疫印跡法 （Western Blot）檢測心肌組織中相關蛋白表達

取心肌組織，加入放射免疫沉淀法（RIPA）裂解液（上海碧云天生物技術公司）提取總蛋白，各組定量取30 μg變性蛋白電泳、電轉后，置于5%脫脂牛奶中封閉2 h，分別置于1∶1 000稀釋的TLR4、NF-κB p65（p65）、磷酸化NF-κB p65（p-p65）、切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3（Cleaved-Caspase-3）、切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-9（Cleaved-Caspase-9）和β-actin一抗（美國Abcam公司）中，4 ℃搖床震蕩過夜，再置于1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）二抗，室溫下搖床震蕩1 h，最后暗室曝光顯示蛋白條帶，掃描蛋白條帶灰度值后計算目的蛋白相對表達量。

1.3統計學處理

采用SPSS 21.0軟件進行統計分析。符合正態分布的定量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析比較，進一步多重比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1各組小鼠CVB3 mRNA及心功能指標比較

與對照組比較，VMC組CVB3 mRNA、LVESD明顯升高，LVEF明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與VMC組比較，VMC＋低劑量TFA組和VMC＋高劑量TFA組CVB3 mRNA、LVESD明顯降低，LVEF明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；VMC＋高劑量TFA組CVB3 mRNA明顯低于VMC＋低劑量TFA組，LVEF明顯高于MC＋低劑量TFA組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。但各組LVEDD比較差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見表1。

2.2各組心肌病理變化比較

對照組心肌組織結構完整，心肌纖維排列整齊，未見炎癥細胞浸潤；VMC組心肌纖維溶解、成片，大量炎癥細胞浸潤；VMC＋低劑量TFA組和VMC＋高劑量TFA組仍存在部分心肌纖維溶解和炎癥細胞浸潤，但心肌病變程度較VMC組明顯減輕。詳見圖1。

2.3各組心肌細胞凋亡比較

與對照組比較，VMC組心肌細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與VMC組比較，VMC＋低劑量TFA組和VMC＋高劑量TFA組心肌細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05），且VMC＋高劑量TFA組心肌細胞凋亡率低于VMC＋低劑量TFA組（P＜0.05）。詳見圖2、表2。

2.4各組心肌組織IL-6、IL-1β和TNF-α水平比較

與對照組比較，VMC組心肌組織中IL-6、IL-1β和TNF-α水平明顯升高（P＜0.05）；與VMC組比較，VMC＋低劑量TFA組和VMC＋高劑量TFA組IL-6、IL-1β和TNF-α水平明顯降低（P＜0.05），且VMC＋高劑量TFA組IL-6和TNF-α水平低于VMC＋低劑量TFA組（P＜0.05）。詳見表3。

2.5各組心肌組織TLR4/NF-κB通路和凋亡相關蛋白表達比較

與對照組比較，VMC組心肌組織中TLR4、p-p65/p65、Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9相對表達量明顯升高（P＜0.05）；與VMC組比較，VMC＋低劑量TFA組和VMC＋高劑量TFA組TLR4、p-p65/p65、Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9相對表達量明顯降低（P＜0.05），且VMC＋高劑量TFA組TLR4、p-p65/p65和Cleaved-Caspase-9相對表達量明顯低于VMC＋低劑量TFA組（P＜0.05）。詳見表4、圖3。

3討論

目前，VMC主要以抗病毒治療為主，再對癥治療結合抗心力衰竭以及非類固醇抗炎、免疫抑制治療等，但這些療法特異性差，且存在較大毒副作用，臨床仍需探索開發安全有效的新型藥物［9］。TFA包含β-谷甾醇、芒柄花素等6種單體化合物，其在心肌［10］、肝臟［11］等組織疾病中發揮抗氧化作用已有報道。本研究通過對VMC小鼠模型進行藥物干預，觀察TFA對VMC小鼠的影響，結果表明，TFA可明顯抑制VMC小鼠心肌組織中CVB3，緩解CVB3感染引起心肌病理損傷，改善心功能，與既往研究結果［12］相符。

CVB3感染后，人體自身免疫系統中TLR4可與配體結合，通過激活NF-κB信號通路，啟動強效炎癥反應，并導致靶細胞凋亡。梁建軍等［13］研究發現，紅花注射液可通過抑制TLR4、NF-κB表達，減輕VMC大鼠炎癥反應，從而改善心肌組織損傷。Liu等［14］研究發現，黃芪多糖對CVB3誘導的心肌損傷和炎癥有一定的保護作用，其作用機制可能與抑制TLR4/NF-κB通路有關。上述研究結果表明，干預TLR4/NF-κB通路可能是治療VMC的有效途徑。TFA也具有抗炎作用。周鴻緣等［15］以體外構建炎癥細胞模型，發現TFA可調控絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信號通路，發揮抗炎作用。Ma等［16］研究顯示，TFA可通過雙重抑制NF-κB炎癥通路和miR-133表達，以及部分抑制巨噬細胞清除受體減輕動脈粥樣硬化，還可改善肝臟脂肪變性和脂質紊亂，可能作為心血管疾病的新型治療方法。本研究結果顯示，VMC小鼠心肌組織中TLR4和p-p65/p65過表達，且炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平明顯升高，TFA干預后可明顯抑制上述表現，提示TFA可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路，減少炎性因子表達，對VMC小鼠心肌損傷發揮保護作用。

心肌細胞在病毒感染過程中，伴隨著非裂解性程序性死亡，即細胞凋亡。Caspase家族在細胞凋亡過程中占據重要地位，上游凋亡信號刺激Caspase-9、Caspase-10等進行異源活化，啟動并放大凋亡信號，并同源活化下游Caspase-3、Caspase-6等，促進細胞凋亡［17］。本研究經TUNEL染色發現，對照組僅少量心肌細胞凋亡，而VMC組存在大量的心肌細胞凋亡，VMC＋低劑量TFA組和VMC＋高劑量TFA組心肌細胞凋亡率明顯降低，提示TFA或可緩解CVB3感染誘導的心肌細胞凋亡。進一步觀察TFA對VMC小鼠凋亡相關蛋白表達的影響，發現TFA可下調Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9表達，這可能是其抑制心肌細胞凋亡的作用途徑。

綜上所述，TFA可減輕CVB3誘導的VMC小鼠心肌病理損傷，可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路改善心肌炎癥損傷，下調Cleaved-Caspase-3和Cleaved-Caspase-9表達，減少心肌細胞凋亡。但本研究僅局限于從TLR4/NF-κB信號通路及細胞凋亡角度觀察，未能檢測自噬、細胞焦亡等生物學行為在TFA保護VMC心肌損傷中的作用，未來將從自噬、細胞焦亡的角度展開研究，進一步豐富TFA治療VMC的藥理學作用。

參考文獻：

［1］NIE X，LI H H，WANG J，et al.Expression profiles and potential functions of long non-coding RNAs in the heart of mice with Coxsackie B3 virus-induced myocarditis［J］.Frontiers in Cellular and Infection Microbiology，2021，11：704919.

［2］TSCHPE C，AMMIRATI E，BOZKURT B，et al.Myocarditis and inflammatory cardiomyopathy：current evidence and future directions［J］.Nature Reviews Cardiology，2021，18（3）：169-193.

［3］蘇優拉，陳貴林.黃芪中黃酮類成分的研究進展［J］.食品安全質量檢測學報，2021，12（3）：849-857.

［4］WANG Z，LI X L，HONG K F，et al.Total flavonoids of Astragalus ameliorated bile acid metabolism dysfunction in diabetes mellitus［J］.Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine，2021，2021：6675567.

［5］肖文濤，張靜，郭素萍，等.丹參酮ⅡA對CVB3感染的小鼠原代心肌細胞氧化損傷及凋亡的影響及其機制研究［J］.分子診斷與治療雜志，2021，13（9）：1385-1389.

［6］馬奎影，白婷婷，趙強，等.黃芪總黃酮通過網腔鈣結合蛋白調控線粒體鈣循環及內質網應激介導CVB3感染心肌細胞保護作用研究［J］.時珍國醫國藥，2020，31（9）：2065-2067.

［7］劉灝，呼日樂巴特，熊英，等.黃芪總黃酮對病毒性心肌炎小鼠心律失常與內質網應激因子的影響［J］.中國應用生理學雜志，2018，34（1）：16-18;22.

［8］張思思，謝達奇，胡文奕，等.基于PI3K/PKB通路研究EGCG對CVB3感染致病毒性心肌炎小鼠細胞凋亡的影響［J］.病毒學報，2021，37（3）：575-582.

［9］SCHULTHEISS H P，BAUMEIER C，ALESHCHEVA G，et al.Viral myocarditis-from pathophysiology to treatment［J］.Journal of Clinical Medicine，2021，10（22）：5240.

［10］ZHOU X M，XIN Q，WANG Y L，et al.Total flavonoids of Astragalus plays a cardioprotective role in viral myocarditis［J］.Acta Cardiologica Sinica，2016，32（1）：81-88.

［11］AN L，LIN Y F，LI L Y，et al.Integrating network pharmacology and experimental validation to investigate the effects and mechanism of astragalus flavonoids against hepatic fibrosis［J］.Frontiers in Pharmacology，2020，11：618262.

［12］宣麗穎，陶謝鑫，趙雅君，等.黃芪總黃酮對柯薩奇B3病毒感染乳鼠心肌細胞內質網應激及Calumenin蛋白和縫隙連接蛋白CX43的作用［J］.中國應用生理學雜志，2016，32（1）：51-54.

［13］梁建軍，徐元勝，孫守剛，等.紅花注射液對病毒性心肌炎大鼠心肌組織 Bcl-2和Bax基因表達的影響［J］.中華醫院感染學雜志，2021，31（20）：3099-3104.

［14］LIU T L，ZHANG M J，NIU H Y，et al.Astragalus polysaccharide from Astragalus Melittin ameliorates inflammation via suppressing the activation of TLR-4/NF-κB p65 signal pathway and protects mice from CVB3-induced virus myocarditis［J］.International Journal of Biological Macromolecules，2019，126：179-186.

［15］周鴻緣，張賢，王萌，等.黃芪總黃酮體外抗炎作用及對MAPKs信號通路的調控［J］.中國獸醫學報，2020，40（12）：2392-2397.

［16］MA C R，ZHANG J，YANG S，et al.Astragalus flavone ameliorates atherosclerosis and hepatic steatosis via inhibiting lipid-disorder and inflammation in ApoE-/- mice［J］.Frontiers in Pharmacology，2020，11：610550.

［17］WANG Q Y，ZHU Q J，YE Q F，et al.STAT3 suppresses cardiomyocytes apoptosis in CVB3-induced myocarditis via survivin［J］.Frontiers in Pharmacology，2020，11：613883.

（收稿日期：2023-11-07）

（本文編輯郭懷印）