脊髓性肌萎縮癥（SMA）基因篩查檢測的臨床應用研究

【摘要】目的：對廣東省陽江地區育齡人群進行脊髓性肌萎縮癥（SMA）基因篩查，分析本地區攜帶率，為臨床提供科學的數據。方法：采用熒光定量PCR法，分別對SMN1基因第7和第8外顯子的拷貝數進行相對定量檢測，篩選出SMA攜帶者，進而篩選出高危夫婦，引導其進行產前診斷。結果：1115名受檢者中，共檢測出SMN1突變攜帶者18例（1.61%），其中SMN1基因第7外顯子和第8外顯子雜合缺失15例（1.35%），單純SMN1基因第8外顯子雜合缺失3例（0.27%）。結論：初步闡明陽江地區育齡人群SMA基因攜帶率，本研究的數據可為本地區開展遺傳咨詢和產前診斷提供參考資料。

【關鍵詞】脊髓性肌萎縮癥；運動神經元存活基因1；熒光定量PCR法；攜帶者篩查

基金項目：陽江市醫療衛生類科技計劃項目《脊髓性萎縮癥（SMA）基因篩查檢測的臨床應用研究》（SF2021089）

Clinical application study of genetic screening and testing for spinal muscular atrophy（SMA）

LIANG Weimin， LIU Qiuhua， XIE Wenguang， ZENG Zhaoshan， SITU Youfa， HE Xiaoyan Yangjiang Maternal and Child Health Hospital， Yangjiang， Guangdong 529500， China

【Abstract】Objective：To screen the gene of spinal muscular atrophy （SMA） in child-bearing population in Yangjiang，Guangdong，and to analyze the local carrier rate and provide scientific data for clinical practice.Methods：The copy numbers of exon 7 and exon 8 of SMN1 gene were relative quantitative detected by fluorescence quantitative PCR to screen out SMA carriers，then screen out high risk couples and guide them for prenatal diagnosis.Results：Among the 1115 subjects，18 cases （1.61%） were found to be carriers of SMN1 mutation，of which 15 cases （1.35%） were heterozygous deletion in exon 7 and exon 8 of SMN1 gene，and 3 cases （0.27%） were pure heterozygous deletion in exon 8 of SMN1 gene.Conclusion：The preliminary elucidation of the SMA gene carrier rate among the child-bearing population in Yangjiang area can provide reference materials for genetic counseling and prenatal diagnosis in this region.

【Key Words】SMA； SMN1； Fluorescence quantitative PCR； Carrier screening

脊髓性肌萎縮癥（spinal muscular atrophy，SMA）是因運動神經元存活基因1（SMN1）缺失/變異導致SMN蛋白缺乏致病的神經肌肉疾病，屬于嚴重的常染色體隱性遺傳疾病，具有很高的致死率。臨床表現一般為進行性的肌肉無力和肌肉萎縮，并經常有消化、呼吸、營養、骨骼等多個系統的器官損害[1-2]。有研究表明：95%的SMA患者是因為SMN1基因第7外顯子純合缺失或第7和第8外顯子同時出現純合缺失致病；5%的患者是因為SMN1基因突變和點突變共同存在而患病[3-4]。對陽江地區育齡人群進行SMN1攜帶者基因篩查，篩選出高危夫婦進行產前診斷，是降低出生缺陷率的有效手段。

1 資料與方法

1.1 基本資料

收集2022年3月—2023年7月在陽江市婦幼保健院孕、產檢的婦女及其丈夫外周血樣1115例。所有受檢者經過告知知情并簽署了脊髓性肌萎縮癥基因篩查檢測知情同意書后抽取外周血2mL進行基因檢測。所有流程符合陽江市婦幼保健院倫理委員會要求并獲得批準。

1.2 方法

1.2.1 標本制備

取受測者EDTA-K2抗凝外周血各200μL用血液基因組DNA提取試劑盒（潮州凱普生物化學有限公司）提取DNA，采用德國的NanoDrop微量紫外分光光度計（Thermo）對提取的DNA進行濃度測定，用純水按照倍數對DNA的濃度進行稀釋，直至濃度變為10～20ng/μL。

1.2.2 熒光定量PCR

運動神經元存活基因1（SMN1）外顯子缺失的檢測試劑盒來自上海五色石醫學科技有限公司。試劑盒借助MGB探針多重實時熒光定量PCR方法。被檢測人的RPP40基因是內標基因，對SMN1基因E8（目的基因）、E7分別進行擴增，并對拷貝數進行定量檢測。在操作時要嚴格按照流程進行，熒光定量PCR擴增儀選用上海宏石公司的SLAN-96S型號，對內標基因以及目的基因的信號進行 收集。

1.2.3 結果判斷

對SMN1基因E7以及E8反應中存在的內標基因ΔCt值進行對比（ΔCt=Ct_FAM- Ct_VIC），將正常對照品在三個不同梯度的ΔCt平均值用ΔCt_a表示，用ΔCt_s表示待測樣本值，用ΔΔCt=ΔCt_s-ΔCt_a對待測樣本結果進行表示。有以下任意一項滿足則代表檢測人是缺失SMN1基因外顯子：若ΔΔCt>0.8或者FAM無信號通道則是E7；若ΔΔCt>1.5或者FAM無信號通道則是E8。此外，還要滿足以下幾個條件才能對受檢者的結果進行判定；正常對照組的內標CT值以及最小梯度目標基因值<28；正常對照品的三個梯度VIC通道信號以及FAM通道信號的線性相關系數都>0.95；受檢者的樣本內標基因內的CT值<28。

1.2.4 數據分析

采用上海五色石醫學科技有限公司提供的SMA報告生成系統軟件v2.5.0.0對實驗結果進行分析，判斷受檢者SMN1基因第7、8外顯子（E7、E8）缺失情況。

2 結果

2.1 篩查結果

1115名受檢者中，共檢測出脊髓性肌萎縮癥SMN1突變攜帶者18例（1.61%），其中SMN1基因第7外顯子和第8外顯子雜合缺失15例（1.35%），單純SMN1基因第8外顯子雜合缺失3例（0.27%），見表1。

2.2 遺傳咨詢

檢出15例孕婦攜帶者并引導其進行遺傳咨詢，其丈夫檢測結果均未見突變，未進一步進行產前介入性診斷。

3 討論

美國FDA于2016年12月批準在全球范圍內上市首個對SMA有治療效果的藥物--美國Biogen Idec公司的Nusinersen，這一藥品可以對兒童以及成人SMA患者進行治療[5]。該藥第一年需要用藥6次，之后每年用藥3次，一般家庭難以承受長期的經濟負擔和日常照顧護理。患者即使在后期接受了專業的修正治療，遏制了運動神經元的凋亡情況，但是因為神經肌肉接頭的功能并沒有被改善，所以患者的運動功能恢復效果還是不明顯[6]，患者需反復鞘內注射、終身用藥[7]，患者依然要承受身體疾病和心理精神健康的雙重壓力。

SMA在治療層面困難重重，但在預防層面上，致病基因明確。根據孟德爾遺傳規律，可以推斷出常染色體隱性遺傳病攜帶者的父母之一為攜帶者、兒女和兄弟姐妹都有50%概率為攜帶者。為了保證篩查結果的準確性，本研究剔除攜帶者做家系分析的驗證性數據，僅對1115名育齡夫婦進行篩查分析，其中發現15名孕婦為SMA攜帶者，攜帶率約為1.35%。查詢比對，發現廣東陽江地區SMA攜帶率僅比廣西柳州市的1.24%[8]略高，低于茂名市的2.58%[9]、太原市的2.20%[10]、深圳市的2.09%[11]、云南省的2.03%[12]、江門市的2.34%[13]、江蘇省的1.73%[14]和佛山市的1.48%[15]，各地區存在一定差異。夫妻雙方為SMA攜帶者，生下SMA患兒概率為25%、攜帶者概率為50%和正常兒為25%。陽江地區篩查出15例孕婦為SMA攜帶者，經過遺傳咨詢，引導孕婦丈夫進行SMA基因篩查，結果均未發現突變，未進一步進行有創性產前診斷并告知受檢夫婦可能存在的風險。考慮到篩查成本，本研究采用熒光定量PCR方法進行SMA攜帶者篩查。人群中很少有SMA攜帶者是因為SMN1突變以及SMN1“2+0”型基因突變所致（1+1D）[16]，由于方法缺陷性，本研究未能準確地篩查出這些攜帶者。本研究如果篩選出高危夫婦，最終還需使用MLPA方法進行疾病診斷與產前診斷。

綜上所述，本文研究廣東陽江地區SMA基因篩查檢測的臨床應用，通過篩查攜帶者，可將高風險的夫妻篩查出來并進行產前診斷，降低新生兒攜帶SMA的概率，可為本地區出生缺陷一、二級防控工作中預防措施、診斷、遺傳咨詢等提供科學的數據。

參考文獻

[1] 北京醫學會罕見病分會，北京醫學會醫學遺傳學分會，北京醫學會神經病學分會神經肌肉病學組，等.脊髓性肌萎縮癥多學科管理專家共識[J].中華醫學雜志，2019，99（19）：1460-1467.

[2] 毛姍姍.精準醫學時代中國脊髓性肌萎縮癥診治發展之路[J].臨床兒科雜志，2022，40（3）：165-169.

[3] QU Y J，BAI J L，CAO Y Y，et al.Mutation spectrum of the survival of motor neuron 1 and functional analysis of variants in chinese spinal muscular atrophy[J].J Mol Diagn，2016， 18（5）：741-752.

[4] LIU W L，LI F，HE Z X，et al.Molecular analysis of the SMN gene mutations in spinal muscular atrophy patients in China[J].Genet Mol Res， 2013，12（3）：3598-3604.

[5] AARTSMA-RUS A.FDA Approval of Nusinersen for Spinal Muscular Atrophy Makes 2016 the Year of Splice Modulating Oligonucleotides[J].Nuclc Acid Therapeutics，2017，27（2）：67.

[6] 戴毅，崔麗英.脊髓性肌萎縮癥的昨天、今天與明天[J].罕見病研究，2022，1（1）：28-33.

[7] 利婧，張成.脊髓性肌萎縮癥治療臨床研究進展[J].中國現代神經疾病雜志，2019，19（6）：385-392.

[8] 譚建強，張旭，王遠流，等.廣西柳州地區4931例孕婦脊髓性肌萎縮癥突變攜帶者的篩查及產前診斷[J].中華醫學遺傳學雜志，2018（35）：467-470.

[9] 李祝坤，譚滿勝，唐玉芬，等.茂名地區育齡婦女脊髓性肌萎縮癥SMN1突變攜帶者篩查與分析[J].熱帶醫學雜志，2023，23（6）：776-779.

[10] 鄧洋，郭進升，張眉花.太原地區910例孕婦脊髓性肌萎縮癥攜帶者篩查及一例家系驗證[J].生殖醫學雜志，2022，31（2）：197-201.

[11] 王麗娟，宋雅琴，高慧，等.深圳地區孕產前人群脊髓性肌萎縮癥基因檢測及產前診斷[J].現代婦產科進展，2023，32（5）：360-364.

[12] 章印紅，王蕾，賀靜，等.云南地區3049名育齡人群脊髓性肌萎縮癥攜帶者篩查結果分析[J].中華醫學遺傳學雜志，2020，37（4）：384-388.

[13] 李秋麗，石海弘，孫淑湘，等.江門地區14378例育齡婦女的脊髓性肌萎縮癥基因攜帶者篩查情況[J].中國優生與遺傳雜志，2022，30（3）：509-511.

[14] 張菁菁，王玉國，馬定遠，等.江蘇地區5776例孕婦脊髓性肌萎縮癥攜帶者篩查及產前診斷[J].現代婦產科進展，2021，30（6）：434-437.

[15] 周成，宋春林，黃湘，等.廣東佛山地區19297名孕婦脊髓性肌萎縮癥攜帶者篩查及產前診斷[J].中國優生與遺傳雜志，2022，30（2）：241-245.

[16] SHENG -YUAN Z，XIONG F，CHEN Y J，et al.Molecular characterization of SMN copy number derived from carrier screening and from core families with SMA in a Chinese population[J].Eur J Hum Genet，2010，18（9）：978-984.