1株野生高效纖維素降解菌篩選、鑒定其酶活力測定

摘 要：為從腐熟的土壤中分離出產(chǎn)纖維素酶的細(xì)菌，并進(jìn)一步研究該菌株的纖維素降解能力。采用羧甲基纖維素 （CMC）-剛果紅染色法，篩選出 1 株野生纖維素降解菌 ZG2-3，采用 16S rRNA 分子鑒定其種類，同時(shí)從促腐劑中篩選出 4 株商品纖維素降解菌，比較野生纖維素降解菌與商品纖維素降解菌的酶活差異。結(jié)果表明：從婁底市珠山公園桂花樹林下腐熟的土壤中采集分離，通過羧甲基纖維素 （CMC）-剛果紅染色法，篩選得到了纖維素降解能力較高的 1 株細(xì)菌 ZG2-3。經(jīng)鑒定 ZG2-3為枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis。ZG2-3 的羧甲基纖維素酶 （CMCase） 活力和濾紙酶 （FPA） 活力分別為 0.054 IU·mL?1 和 0.02 IU·mL?1，其中 ZG2-3 的 CMCase 活力顯著高于商品纖維素降解菌。

關(guān)鍵詞：纖維素；枯草芽孢桿菌；篩選；鑒定；酶活力

中圖分類號(hào)：S141.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0253?2301（2024）05?0016?04

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.05.003

Screening and Identification of a Wild Cellulose-degrading Strain with High Efficiency and Determination of Its Enzyme Activity

LIAO Kai1，XIAO Tian1，YAN Jian-hong2，ZHENG Hui-xin1，JING Yuan-rong1，LIU Xiu1， NI Xian-zhi1，JIN Chen-zhong1，GUO Kai-fa1 ＊

（1. Key Laboratory of Green Prevention and Control for Pests， Hunan University of Humanities and Technology，Loudi， Hunan 417000， China; 2. Loudi Bureau of Agriculture and Rural Affairs， Loudi， Hunan 417000， China）

Abstract： In order to isolate cellulase-producing bacteria from the overrotten soil and further study the cellulose degradation ability of the strain， a wild cellulose-degrading strain ZG2-3 was screened by using the carboxymethyl cellulose （CMC） - congo red staining method. Then， the 16 S rRNA molecular identification was used to identify the species， and four commercial cellulose-degrading bacteria strains were screened from the promoting-decomposing agent. Last， the enzyme activity differences between the wild cellulose-degrading bacteria and the commercial cellulose-degrading bacteria were compared. The results showed that one strain of bacteria with high cellulose degradation ability， ZG2-3， was screened by using the carboxymethyl cellulose （CMC） - congo red staining method，which was collected and isolated from the overrotten soil under the osmanthus forest in Zhushan Park， Loudi City.ZG2-3 was identified as Bacillus subtilis. The carboxymethyl cellulase （CMCase） activity and filter paper enzyme（FPA） activity of ZG2-3 were 0.054 IU·mL?1and 0.02 IU·mL?1， respectively， and the CMCase activity of ZG2-3 was significantly higher than that of the commercial cellulose-degrading bacteria.

Key words： Cellulose；Bacillus subtilis；Screening；Identification；Enzyme activity

木質(zhì)纖維素是一種廣泛存在于自然界中的、由葡萄糖組成的天然多聚糖[1]，在人類社會(huì)中主要以蔬菜渣、水果渣、農(nóng)作物秸稈和中藥渣等廢棄物形式存在[2?5]。纖維素是一種分布廣泛、存量巨大、可再生的物質(zhì)資源，可以作為生產(chǎn)生物燃料和生物化學(xué)品的原材料[6]，而纖維素的降解是其能夠充分被利用的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一[7]。目前，運(yùn)用微生物降解纖維素是一條有效的途徑[8]，雖然細(xì)菌的纖維素酶分泌能力普遍不及真菌、放線菌，但細(xì)菌繁殖快，具有很大的纖維素降解能力[9]。因而篩選高效纖維素降解細(xì)菌是微生物降解纖維素的關(guān)鍵。

本研究從婁底珠山公園土壤中，通過羧甲基纖維素 （CMC）-剛果紅染色法，分離篩選高產(chǎn)纖維素酶的菌株，以革蘭氏染色和 16S rRNA 生物學(xué)手段對(duì)其進(jìn)行鑒定，并與促腐劑中商品纖維素降解菌的透明圈直徑 （D） 和菌落直徑 （d） 比值、羧甲基纖維素酶 （CMCase） 活力和濾紙酶 （FPA） 活力進(jìn)行比較分析，為纖維素降解菌對(duì)纖維素類廢棄物資源化利用研究提供了理論和參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1菌種來源 野生纖維素降解菌采集于婁底市珠山公園多年自然生長桂花樹林下腐熟的土壤。商品纖維素降解菌來源于促腐劑（鶴壁市人元生物技術(shù)發(fā)展有限公司）。

1.1.2培養(yǎng)基 （1）篩選培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）2.00 g·L?1、NaCl 0.50 g·L?1、（NH4）2SO43.00 g·L?1、 K2HPO40.50 g·L?1、 MgSO4·7H2O 0.50g·L?1、瓊脂 20.00 g·L?1、蒸餾水 1 000 mL，121℃滅菌 30 min。（2）富集培養(yǎng)基：Whatman 濾紙條10g·L?1、 NaNO3 3.00 g·L?1、 CaCl2 0.20 g·L?1、K2HPO40.50 g·L?1、NaCl 0.20 g·L?1、MgSO4·7H2O0.50 g·L?1、蒸餾水 1 000 mL，121℃ 滅菌 30 min。（3）發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：CaCl2 0.20 g·L?1、酵母粉1.00 g·L?1、（NH4）2SO4 1.50 g·L?1、蛋白胨 2.50g·L?1 、 KH2PO4 3.00 g·L?1、 MgSO4·7H2O 0.50g·L?1，蒸餾水 1 000 mL，121℃ 滅菌 30 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1纖維素降解菌的富集、分離與純化 將土壤樣品粉碎除雜后，稱量 2.00 g 土壤樣品于無菌環(huán)境下放入富集培養(yǎng)基中， 37℃、180 r·min?1 培養(yǎng)。待富集培養(yǎng)基中濾紙條完全崩解，取培養(yǎng)后的富集培養(yǎng)基，加滅菌后的蒸餾水配成 10?4、10?5 、10?6 稀釋液，取稀釋液 150 μL 均勻涂布到篩選培養(yǎng)基上，37℃ 恒溫培養(yǎng)，隨機(jī)挑選長出的單菌落轉(zhuǎn)接到新鮮的篩選培養(yǎng)基純化 3 次。

商品纖維素降解菌的富集、分離與純化方法同上。

1.2.2纖維素降解菌的篩選 將純化后的菌株點(diǎn)接至篩選培養(yǎng)基平板，于 37℃ 恒溫培養(yǎng) 3 d。用1.00% 的剛果紅溶液染色長有菌株的篩選培養(yǎng)基平板 45 min，再用 1 mol·L?1NaCl 溶液脫色 45 min，觀察染色并脫色后的透明圈大小[10]。采用十字交叉法測量透明圈直徑 （ D）和菌落直徑 （ d），并通過其比值（D/d）初步判定其纖維素降解能力[11]，選取比值大的菌株進(jìn)行斜面保存。

1.2.3纖維素降解菌株的鑒定 革蘭氏染色：將纖維素降解菌株接種到篩選培養(yǎng)基，于 37℃ 培養(yǎng)2 d，觀察菌落培養(yǎng)特征，進(jìn)行革蘭氏染色。

分子生物學(xué)鑒定：提取纖維素降解菌 DNA，利 用 細(xì) 菌 通 用 引 物 7F： 5'-C AGAGTTTGATCC TGGCT-3'和 1540R： 5'-AGGAGGTGATCCAGCC GCA-3'對(duì)菌株 16S rDNA 序列進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件：95℃ 預(yù)變性 4 min；95℃ 變性 30 s，56℃退火 30 s，72℃ 延伸 90 s，循環(huán) 30 次后，于 72℃下最后延伸 10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測定，將測序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中進(jìn)行 BLAST 比對(duì)分析，使用 MEGA7 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，確定菌株的種屬。

1.2.4纖維素降解菌酶活的測定 纖維素酶活的測定：酶活力為在相應(yīng)條件下，1 mL 粗酶液每分鐘水解相應(yīng)的底物，產(chǎn)生相當(dāng)于 1 μmol 葡萄糖的還原糖量，定義為 1 個(gè)酶活力單位，表示為 IU·mL?1[12]。

粗酶液的制備：挑選透明圈直徑 （ D）和菌落直徑 （ d）比值大的菌株的單菌落接入發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于搖床恒溫 37℃、180 r·min?1 培養(yǎng) 2 d，最后 6 000 r·min?1 離心 15 min，得到粗酶液。

采用 DNS 比色法，分別測定纖維素降解菌粗酶 液 中 纖 維 素 內(nèi) 切 酶 （ CMCase） 和 濾 紙 酶（FPA）的活性[13]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用 Excel 2021 軟件整理數(shù)據(jù)，使用 SPSS26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析（ ANOVA） 和 最 小 顯 著 性 差 異 法 配 對(duì) 比 較（LSD 檢驗(yàn)），試驗(yàn)結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌的富集、分離與純化

土壤樣品經(jīng)富集培養(yǎng)基培養(yǎng)，將富集培養(yǎng)基稀釋后涂布到篩選培養(yǎng)基上，純化后共得到 7 株野生纖維素降解菌，從促腐劑共得到 4 株纖維素降解菌。

2.2 纖維素降解菌的篩選

CMC?Na 為底物的培養(yǎng)基并結(jié)合剛果紅染色-透明圈的方法對(duì)纖維素降解細(xì)菌進(jìn)行篩選，經(jīng)剛果紅染色和 NaCl 脫色篩選出了 1 株野生纖維素降解菌 ZG2-3 ，D/d 值為 2.57±0.157，4 株商品纖維素降解菌 CF-2 、 CF-3 、 CF-6 和 CF-7 的 D/d 值依次為 3.223±0.857、3.223±0.857、2.517±0.276 和2.303±0.211，其中菌株 ZG2-3 D/d 值顯著高于CF-7 ，與其他菌株無顯著性差異（P＜0.05）。

2.3 菌株 ZG2-3 的分子鑒定

在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng) 2 d，菌株 ZG2-3 菌落呈灰白色，邊緣鋸齒狀，表面較不光滑，干燥（圖 1-A）；經(jīng)革蘭氏染色后為紫紅色，為革蘭氏陽性桿菌 （圖 2-B 和 2-C）。進(jìn)一步 DNA 提取、PCR 擴(kuò)增后獲得長度為 1 000 bp 左右的 16S rRNA 基因片段。通過 BLAST 序列比對(duì)，菌株 ZG2-3 與枯草芽孢桿菌 Bacillus subtilis 相似度在 99% 以上，選擇相似度＞99.0% 的序列的代表菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖 3），ZG2-3 與枯草芽孢桿菌的進(jìn)化關(guān)系較近，可靠性較高，確定菌株 ZG2-3 為枯草芽孢桿菌 B. subtilis。

2.4 纖維素降解菌的酶活測定由表 1 可知，菌株 ZG2-3 的 CMCase 活力顯著高于其他菌株，菌株 ZG2-3 的 FPA 活力顯著高于 CF-7 ，與其他菌株無顯著性差異（P＜0.05）。

3 討論與結(jié)論

運(yùn)用微生物降解大自然中的纖維素，因其有對(duì)纖維素的高效利用率、綠色無污染特點(diǎn)，已受到人們的廣泛關(guān)注[14]。纖維素降解菌的種類繁多，主要分為 3 大類：真菌、細(xì)菌和放線菌[15]，其中，纖維素降解細(xì)菌在生長過程中能夠產(chǎn)生大量的胞外酶，這些酶在促進(jìn)纖維素降解方面發(fā)揮著重要作用。據(jù)報(bào)道，自然界纖維素的降解主要依賴于微生物產(chǎn)生的降解酶，如內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和 β-葡萄糖苷酶等[16]，這些酶相互協(xié)作，能夠安全、無害地作用于纖維素分子的結(jié)晶區(qū)，最終將其分解成小分子寡糖和葡萄糖[17]。但梅新蘭等[18]認(rèn)為 CMCase 活力和木聚糖酶活力是復(fù)合菌系降解水稻秸稈的重要驅(qū)動(dòng)力，江高飛等[19]認(rèn)為纖維素 CM Case 活力是菌株降解玉米秸稈的主要驅(qū)動(dòng)因素。

本研究從婁底珠山公園腐熟的土壤中篩選得到 1 株野生纖維素降解菌 ZG2-3，具有較強(qiáng)的產(chǎn)酶和降解纖維素能力。同時(shí)從促腐劑（鶴壁市人元生物技術(shù)發(fā)展有限公司）中篩選出 4 株商品纖維素降解菌。野生菌株 ZG2-3 的 D/d 值顯著高于 CF-7 ，與其他菌株無顯著性差異（P＜0.05）。野生菌株ZG2-3 的 CMCase 活力顯著高于 4 株商品纖維素降解菌，菌株 ZG2-3 的 FPA 活力顯著高于菌株 CF-7 ，與其他菌株無顯著性差異（P＜0.05）。因此野生菌株 ZG2-3 具有較好的秸稈降解潛力，后續(xù)將進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)的驗(yàn)證。

本研究通過羧甲基纖維素 （CMC）-剛果紅染色法，篩選出野生纖維素降解菌 ZG2-3，結(jié)合革蘭氏染色和 16S rRNA 序列測定，發(fā)現(xiàn)菌株 ZG2-3 與 B.subtilis 相似度高達(dá) 99%，選擇相似度較高的代表菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，ZG2-3 與枯草芽孢桿菌的進(jìn)化關(guān)系較近，可靠性較高，確定菌株 ZG2-3 為枯草芽孢桿菌 B. subtilis。并進(jìn)一步測定野生纖維素降解菌 ZG2-3 的 CMCase 和 FPA 活力分別為 0.054IU·mL?1 和 0.020 IU·mL?1。

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（責(zé)任編輯：柯文輝）