響應面法優化超聲輔助提取煙葉廢渣蛋白工藝條件

摘 要：煙葉廢渣提取蛋白是其綜合利用途徑之一，超聲輔助堿提有助于獲得更多的煙葉廢渣蛋白。在單因素試驗基礎上，采用響應面法優化煙葉廢渣超聲輔助提取蛋白工藝。結果表明：當緩沖液 pH 為 10、緩沖液體積為 32.77 mL、超聲溫度為 70.9℃、超聲時間為 46.1 min 時，煙葉廢渣的蛋白提取量達（19.13±0.21）mg·g?1，相比優化前提高了 140.6%，該工藝能為再造煙葉脫蛋白提供技術參考。

關鍵詞：煙葉廢渣；響應面法；超聲提取；廢物利用；煙葉蛋白

中圖分類號：TS49 文獻標志碼：A

文章編號：0253?2301（2024）05?0043?06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2024.05.008

Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction Process Conditions of Protein from Tobacco Waste Residue by Response Surface Methodology

LIAO Kuan-qi1，DING Ning3，NIE Li-xuan2，JIANG Zhen-kun2，LI Lin-wei1， LU Bin4，ZHOU Kang-xi2，CHEN Yu-zhou1 ＊

（1. Xiamen Tobacco Industrial Co.， Ltd.， Xiamen， Fujian 361026， China; 2. China Tobacco Fujian Industrial Co.， Ltd.，Xiamen， Fujian 361021， China; 3. Longyan Tobacco Industrial Co.， Ltd.， Longyan， Fujian 364000， China;4. Xiamen Tongxian Industrial Co.， Ltd.， Xiamen， Fujian 361021， China）

Abstract： The extraction of protein from tobacco waste residue is one of its comprehensive utilization ways. The ultrasonic-assisted alkaline extraction is helpful to obtain more protein from the waste residue tobacco leaves. On the basis of single factor experiment， the response surface method was used to optimize the ultrasonic-assisted extraction process of protein from the waste residue of tobacco leaves. The results showed that： when the pH of buffered solution was 10， the volume of buffered solution was 32.77 mL， the ultrasonic temperature was 70.9 °C， and the ultrasonic time was 46.1 min， the protein extraction amount of tobacco leaf waste residue reached （19.13 ± 0.21） mg·g?1， which was140.6 % higher than that before optimization. This process could provide technical reference for removing protein from the reconstituted tobacco leaves.

Key words： Tobacco waste residue；Response surface method；Ultrasonic extraction；Waste utilization；Tobacco leaf protein

煙草是一種經濟價值較高的農作物[1]，除了能制作香煙外，也用于萃取高附加值的煙葉香精[2]。煙葉中含有醇類、酯類、酮類、酸類和萜烯類等多種香氣成分[3?5]，這些香氣成分多數水溶性較差，通常使用乙醇等安全性較高的有機溶劑進行提取[6]。但煙葉香精萃取之后，其剩余的煙葉殘渣難以被有效利用。

近年來，隨著再造煙葉技術的改進，煙葉廢渣成為再造煙葉的原料之一，經過醇提的煙葉殘渣有望被回收利用。煙葉廢渣中含有豐富的蛋白質，多數蛋白質在醇提過程中會發生變性沉淀留在煙葉細胞內，在燃燒過程中會產生燒焦羽毛的臭味及苦澀、辛辣的感覺[7]，對煙草制品品質不利。在制作再造煙葉前，將煙葉廢渣進行蛋白質提取，既能將處理后的廢渣作為再造煙葉的纖維原料，又能將煙葉蛋白作為發酵工業或飼料工業的蛋白原料[8]，實現煙草多用途利用。基于此，本研究在單因素優化的基礎上，采用響應面法優化煙葉廢渣超聲提取蛋白質的工藝條件，為再造煙葉脫蛋白提供技術參考，也為煙葉蛋白的多用途利用提供原料供給。

1 材料與方法

1.1 供試材料

煙葉廢渣：津巴布韋片煙經乙醇提取煙葉香精后的殘渣，由福建中煙工業有限責任公司提供；HCl、NaOH、三羥甲基氨基甲烷（Tris）均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司，所用 Tris 緩沖 液 均 用 蒸 餾 水 配 制 ， 經 2 mol·L?1 的 HCl 或2 mol·L?1 的 NaOH 調至所需 pH 后再用蒸餾水將Tris 定容至 0.1 mol·L?1；總蛋白（TP）測定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；S300H 型通用超聲波清洗器（德國 Elma 公司）；SpectraMax?i3x 酶標儀（美國 Molecular Devices 公司）；CF16-RXII 型高速冷凍離心機（日本 Hitachi 公司）；Hei-VAP Core 型 旋 轉 蒸 發 儀 （ 德 國 Heidolph 公司）；AB23 型 pH 計（美國 OHAUS 公司）；919E 型低溫研磨機（余姚市海蒂詩家用電器有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1煙葉廢渣的預處理 取 50 g 煙葉廢渣于旋轉蒸發儀中 60℃ 真空旋蒸去除煙葉廢渣中殘留的乙醇，再將濕煙葉繼續旋蒸去除水分，直至其重量不再變化，低溫（≤40℃）研磨并過 40 目篩剔除大顆粒雜質獲得煙葉廢渣細粉。重復上述操作，直至獲得 300 g 上述細粉。

1.2.2超聲輔助提取煙葉廢渣蛋白

（1）單因素試驗

分別考察 Tris 緩沖液的 pH 及體積、超聲溫度及時間 4 個因素對提取煙葉廢渣蛋白的影響。取0.5 g 煙葉廢渣細粉于 50 mL 離心管中，初始工藝參 數 為 ： 加 入 20 mL、 pH 7.0 的 Tris 緩 沖 液 ，30℃ 超聲 30 min。在單因素試驗時，依次將緩沖液 pH 設置為：4、5、6、7、8、9、10、11、12；緩沖液體積設置為：10、15、20、25、30、35mL；超聲溫度設置為：30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃；超聲時間設置為：10、20 、30、40、50、60 min。通過單因素試驗結果選擇響應面參數優化范圍。

（2）響應面試驗

由單因素試驗獲得較佳的蛋白提取工藝參數范圍，使用 Design-Expert.V8.0.6 軟件中 Box-Behn ken 方法進行 4 因素 3 水平的響應面試驗（表 1），根據軟件設定參數進行蛋白提取和測定，將蛋白提取量作為賦值并用軟件進行響應面模型擬合和最優工藝參數計算。

1.3 測定項目及分析方法

蛋白提取量的測定：將超聲后的樣品 10 000r·min?1、4℃ 離心 10 min，用總蛋白（TP）試劑盒測定上清液中蛋白質濃度，具體操作方法參照試劑盒說明書。蛋白質提取量的計算方法如下：

蛋白提取量=上清液蛋白濃度×緩沖液體積/廢渣質量

2 結果與分析

2.1 緩沖液 pH 對煙葉廢渣超聲提取蛋白的影響煙葉細胞壁主要由果膠、纖維素、半纖維素、木質素構成[9] ，其中，纖維素、半纖維素和木質素主要作為結構骨架，維持細胞壁結構的完整性，而果膠作為填充介質充滿其中[10] 。堿液對果膠具有破壞作用，能使果膠發生 β-消除反應，將聚半乳糖醛酸長鏈降解成小片段[11] ，還能使果膠發生脫酯作用[12]，打破細胞屏障，利于提取胞內蛋白。

由圖 1 可知，在酸性條件下難以提高蛋白提取量，而在堿性條件下蛋白提取量明顯增加，驗證了堿提法通過破壞果膠來提取胞內蛋白的合理性；但當pH 值過高時（pH≥9），蛋白提取量不再增加，推測過量的堿也可能水解蛋白[13] ，需要對其進行控制。因此，選擇 pH 8～10 作為響應面工藝參數優化范圍。

2.2 緩沖液體積對煙葉廢渣超聲提取蛋白的影響

固定緩沖液 pH 為 9，對其添加體積進行單因素優化。由于試驗過程中固定煙葉廢渣細粉為 0.5g，緩沖液體積的變化可視為料液比的變化。當緩沖液體積增加時，料液比降低，利于稀釋緩沖液中蛋白質的濃度，增加細胞內外濃度差，從而促進胞內蛋白向胞外溶出；但過低的料液比不利于后期蛋白富集。由圖 2 可知，當緩沖液體積在 10～30 mL范圍內時，蛋白提取量呈現上升趨勢；但當緩沖液增加至 35 mL 時，蛋白提取量不再增加。因此，選擇緩沖液體積 25～35 mL 作為響應面工藝參數優化范圍。

2.3 超聲溫度對煙葉廢渣超聲提取蛋白的影響

水浴超聲能在細胞壁周圍產生空泡，進而對細胞壁有破壞作用，是破壁常用的物理方法之一[14] 。在超聲過程中，溫度能與超聲協同作用，增強超聲的破壁能力。由圖 3 可知，在 30～70℃ 范圍內，隨著超聲溫度的增加，蛋白提取量逐漸增加，但當溫度超過 70℃ 后，蛋白提取量不再增加。因此，選擇超聲溫度 60～80℃ 作為響應面工藝參數優化范圍。

2.4 超聲時間對煙葉廢渣超聲提取蛋白的影響

由圖 4 可知，隨著超聲時間的延長，煙葉廢渣蛋白提取量緩慢增加，至超聲 50 min 后其提取量不再增加。因此，選擇超聲時間 40 ～60 min 作為響應面工藝參數優化范圍。

2.5 響應面優化煙葉廢渣超聲提取蛋白工藝

基于上述單因素試驗結果及其選取的優化范圍，使用 Design-Expert.V 8.0.6 軟件中 Box-Behnken方法進行響應面試驗設計并檢測響應的試驗結果（表 2），對表 2 試驗結果進行模型擬合并做方差分析（表 3），擬合公式見公式（1）。由表 3 可知，模型擬合顯著且失擬項不顯著，說明模型擬合成功。結合表 3 及公式（1）進行分析：在一次項中，緩沖液 pH 及體積、超聲溫度和時間4 個因素都顯著，其一次性系數為正且數值較高，說明 4 個因素都較大影響了煙葉廢渣的蛋白提取量；在單因素的平方項中，它們對模型的影響都顯著，說明煙葉廢渣的蛋白提取量與 4 個因素之間并非呈現線性關系；在不同因素之間的交互項中，緩沖液 pH 與其他因素之間都存在交互作用，尤其與緩沖液體積之間交互作用最強，而超聲溫度、超聲時間、緩沖液體積三者之間并不存在顯著的交互作用。

Y =?73.47870+1.06829A+0.51872B+1.39712C+3.79633D?0.000746154AB?0.000417949AC ?0.018769AD+0.00118462BC ?0.019231BD+1.0477CD?0.00587068A2 ?0.00338671B2 ?0.037672C2 ?0.24265D2 （1）

公式（1）中，Y 為蛋白提取量（mg·g?1）；A 為 超 聲 溫 度 （ ℃）； B 為 超 聲 時 間 （ min）；C 為緩沖液體積（mL）；D 為緩沖液 pH。

由圖 5 可知，各因素之間的響應曲面均開口向下，且多數曲面的二維投影等高線較為完整，模型的極大值可能位于曲面的極大值處。結合公式（2）進行計算可得，當緩沖液 pH 為 10、緩沖液體積為 32.77 mL、超聲溫度為 70.9℃、超聲時間為 46.1 min 時，煙葉廢渣的蛋白提取量存在極大值，為 19.03 mg·g?1。用所得最優參數進行試驗驗證，煙葉廢渣的實際蛋白提取量為（19.13±0.21）mg·g?1，與理論計算相近。與初始提取工藝蛋白提取量（7.95±0.38）mg·g?1 相比，蛋白質提取量提高了 140.6%。

3 討論與結論

堿提酸沉法常被用于提取煙葉蛋白，王勝優等[15]采用 pH 8.6 的磷酸緩沖液提取煙葉蛋白，其蛋白提取率為 84.95%；董二慧等[16]也用磷酸鹽緩沖液提取煙葉蛋白，其 pH 為 7.48，蛋白提取量為10.96 mg·g?1。本研究在堿提的基礎上，使用超聲輔助提取蛋白，通過單因素試驗篩選，采用響應面法優化煙葉廢渣蛋白提取工藝，最優工藝條件為：緩沖液 pH 10、緩沖液體積 32.77 mL（料液比 50∶3277）、超聲溫度 70.9℃、超聲時間 46.1 min，實際蛋白提取量達（19.13±0.21）mg·g?1，相比于初始提取工藝，蛋白提取量提高了 140.6%。

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（責任編輯：林玲娜）