響應面法優化紅曲酸奶的發酵工藝

肖昌貴，劉志彬，張雯，倪莉

（福州大學食品科學技術研究所，福州350108）

響應面法優化紅曲酸奶的發酵工藝

肖昌貴，劉志彬，張雯，倪莉*

（福州大學食品科學技術研究所，福州350108）

利用超聲輔助浸提法獲得紅曲米有效成分，用于酸奶的發酵，制備新型紅曲酸奶。通過單因素試驗篩選出紅曲米添加量、菌種接種量、發酵時間為影響紅曲酸奶感官品質的主要因素，并采用中心組合設計和響應面法優化參數。結果表明，最優發酵工藝為紅曲米添加量4.8%，菌種接種量4.2%，發酵時間5.5h，在此條件下，發酵所得產品組織細膩，顏色均勻，酸甜適中，感官評分95.3分，與模型預測值基本相符。

超聲輔助浸提法；響應面法；紅曲酸奶；感官評定

紅曲（Monascus）是一種腐生絲狀真菌，最早發現于中國，至今已有一千多年的應用歷史。紅曲米是以秈稻、粳稻、糯米等稻米為原料，經接種紅曲霉屬真菌發酵制備而成的棕紅色或紫紅色米粒，因其含有紅色色素，已經在世界范圍內廣泛應用[1]。近幾十年來，科學家先后發現紅曲霉能夠產生多種具有生理活性的次級代謝產物，如麥角固醇、莫納可林K（Monacolin K）和γ-氨基丁酸等，其產物不僅營養豐富，而且具有抗氧化、抗衰老、降血壓、降膽固醇、參與機體代謝和免疫調節等生理功效[2-7]，因此在食品、醫藥等領域有著重要的應用價值。

酸奶是以全脂乳或脫脂乳作為發酵基料，經過乳酸菌或其他益生菌發酵而成的酸性凝乳狀飲料，具有營養豐富、易于消化吸收等特點，是一種可以提高人體免疫力，降低血液中的膽固醇，調節腸道菌群平衡的健康食品[8-10]。目前以紅曲米為原料進行酸奶發酵工藝的研究，國內外的文獻鮮有報道。成劍峰[11]將紅曲制劑與發酵好的酸奶成品直接混合，均質后得到具有紅曲復合香氣的新型酸奶。王榮榮等[12]將紅曲米磨成粉末，制成了新型紅曲米南瓜發酵酸奶，成品色澤誘人、組織狀態良好、風味獨特，營養價值高。這類產品由于沒有對紅曲米進行前處理，成品易產生紅曲米沉淀。同時發酵時可利用的紅曲米量過少，對酸奶的整體品質影響較小；而當添加量過大時，酸奶易分層、口感不佳難以入口，這大大的限制了紅曲米在酸奶發酵體系的應用范圍。本研究通過對紅曲米進行粉碎、超聲浸提、抽濾等前處理，克服了現有的制備工藝中易產生紅曲沉淀、分層難以入口的不足，并以紅曲酸奶感官品質評分為考察指標，通過響應曲面法（response surface methodology，RSM）[13]對發酵工藝進行優化，使制得的產品色澤均一、口感順滑、香氣協調，為紅曲酸奶的研制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全脂奶粉：光明乳業有限公司；紅曲米：市售可食紅曲米；酸奶濃縮凍干發酵劑（嗜熱鏈球菌2×1011CFU/g、保加利亞乳桿菌5×1010CFU/g）：杜邦丹尼斯克公司；太古優級白砂糖：市售。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2FD型雙人單面超凈工作臺：蘇州圣金凈化科技有限公司；HZP-150型全溫培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；HX-100型高速中藥粉碎機：浙江省永康市溪岸五金藥具廠；BSA124S分析天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；KQ-100DE型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；YXQ-LS-7 5SII立式蒸汽滅菌鍋：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；SHB-III循環水式多用真空泵：鄭州長城科工貿有限公司；BCD-212（KK21V21TI）冰箱：博西華家用電器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 紅曲酸奶的制備工藝流程

1.3.2 紅曲米的前處理

將精選的市售可食用紅曲米經粉碎機磨碎并過80目篩，得到紅曲米粉；然后在紅曲米粉中加入蒸餾水，在超聲裝置中超聲20min，充分提取紅曲米中的營養成分[14]，并在室溫條件下充分浸提2h，整個過程不斷攪拌；將所得到的溶液進行抽濾，即得紅曲米粉濾液。

1.3.3 發酵劑的準備

超凈工作臺上選用嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌以1∶1的比例接種到經過121℃、5min滅菌處理后冷卻的脫脂奶培養基中進行培養，在37℃培養24h，充分活化乳酸菌，置于4℃保存，待用。

1.3.4 紅曲酸奶的發酵

在質量濃度為12%的全脂奶粉中，按比例依次加入紅曲浸提液8%的蔗糖以及0.1%的復合穩定劑，在無菌室溫條件下水化2h，充分溶解，得到酸奶發酵液；將發酵液分裝到滅菌瓶中，在90℃水浴保溫5min；發酵液冷卻至37～43℃時，在無菌條件下添加酸奶發酵劑，接種后不斷攪拌2min，使菌種均勻分布于滅菌瓶中；將所述滅菌瓶置于40～43℃恒溫發酵，直至pH值為4.3～4.5，或滴定酸度在70～80°T，在無菌條件下冷卻至室溫，然后移入4℃冰箱中后熟12～24h，即得紅曲酸奶。

1.3.5 紅曲酸奶感官評定

采用五分標度法對紅曲酸奶感官值進行分析[15]。根據紅曲酸奶的香氣、滋味、色澤以及凝乳狀態等能反映其質量的評價指標，由經過嚴格感官培訓的10人組成的評價小組進行感官評分（滿分100分），感官評分標準見表1。

表1 紅曲酸奶感官評分標準Table 1 Sensory evaluation standard ofMonascusyogurt

1.3.6 單因素試驗確定影響因素

[16]，固定全脂奶粉添加量為12%，選定紅曲米添加量、發酵時間、菌種接種量、蔗糖添加量這四個因素分別考察對紅曲酸奶感官的影響，根據單因素試驗結果和實際情況從中篩選因素進行中心組合試驗。

1.3.7 響應曲面優化紅曲酸奶發酵工藝

確定試驗因素后，根據Box-Behnken中心設計原理設計試驗，以感官評分為響應值，確立酸奶的最佳工藝條件。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 紅曲米添加量對酸奶感官品質的影響

固定酸奶發酵劑接種量5%、蔗糖添加量8%，在發酵時間5h條件下，研究紅曲米添加量（3%、4%、5%、6%、7%）對酸奶感官評分的影響，結果見圖1。

圖1 紅曲米添加量對酸奶感官品質的影響Fig.1 Effect ofMonascusrice addition on sensory quality of yogurt

由圖1可知，隨著紅曲米添加量的增加，酸奶感官評分提高；當紅曲米添加量為5%時，酸奶凝乳狀態良好，組織細膩不分層，感官品質最優；當紅曲米添加量超過5%時，酸奶感官評分開始下降，這可能是由于紅曲米添加量過大導致酸奶有輕微澀感造成。因此，選擇5%紅曲米添加量進行后續試驗。

2.1.2 接種量對酸奶感官品質的影響

固定紅曲米添加量5%，發酵時間5h，蔗糖添加量為8%，研究接種量（2%、3%、4%、5%、6%、7%）對紅曲酸奶的感官評分的影響，結果見圖2。

圖2 菌種接種量對酸奶感官品質的影響Fig.2 Effect of inoculum on sensory quality ofMonascusyogurt

由圖2可見，接種量對紅曲酸奶感官品質影響很大。當接種量為2%時，酸奶發酵5h后還未凝結，發酵未完全，此時酸奶感官評分值低。當接種量大于2%時，酸奶感官評分開始增加，酸奶的凝乳狀況開始變好；當接種量達到4%時，此時酸奶的感官評分最高；接種量繼續增大后，酸奶滋味開始變酸，感官評分開始下降。這可能是因為菌種接種量的增大，使單位面積內的乳酸菌含量增多，乳酸含量增多，當接種量過低時，產生的乳酸較少，體系內pH達到蛋白等電點，酸奶凝乳不完全，口感較差；接種量過高時，產生的乳酸過多，整體酸度過大，不適入口。因此，選擇4%的酸奶發酵劑接種量進行后續試驗。

2.1.3 發酵時間對酸奶感官品質的影響

固定紅曲米添加量為5%，菌種接種量為4%，蔗糖添加量為8%，研究發酵時間（3h、4h、5h、6h、7h）對酸奶感官品質的影響，結果見圖3。

圖3 發酵時間對酸奶感官品質的影響Fig.3 Effect of fermentation time on sensory quality ofMonascusyogurt

由圖3可知，發酵時間對酸奶的感官品質影響很大。當發酵時間為3h時，乳酸菌增殖不足，乳酸含量較少，酸奶未完全凝結，口感較差；當發酵時間達到5h時，酸奶的感官評分最高，隨著發酵時間的增加，乳酸菌含量增多，乳酸產量也增大，酸奶凝乳狀況變好；但發酵時間大于6h后，乳酸菌產生的乳酸含量過多，酸奶pH值較低，導致酸奶略酸，同時有少量乳清析出。因此，選擇5h作為酸奶發酵時間比較適宜。

2.1.4 蔗糖添加量對酸奶感官品質的影響

固定紅曲米添加量5%，接種量4%，發酵時間5h，研究蔗糖添加量（6%、7%、8%、9%、10%）對酸奶感官品質的影響，結果見圖4。

圖4 蔗糖添加量對酸奶感官品質的影響Fig.4 Effect of saccharose addition on sensory quality of Monascusyogurt

由圖4可知，蔗糖添加量對酸奶感官品質影響不大，感官評分整體上變化不大；當蔗糖添加量為8%時，此時酸奶口感最佳，感官評分最高，因此蔗糖添加量選擇8%比較適宜。

2.2 響應面優化試驗

綜合單因素試驗所得結果，固定蔗糖添加量為8%，根據Box-Behnken中心組合設計原理，選取對酸奶感官品質有影響的紅曲米添加量（A）、接種量（B）和發酵時間（C）這三個因素為自變量，以酸奶感官評分（Y）為響應值，利用Design-Expert.V8.0.6軟件進行3因素3水平的響應面試驗優化，試驗因素與水平見表2，響應面分析結果見表3。

表2 響應面分析因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface methodology

2.3 回歸模型的建立及方差分析

利用軟件對試驗結果進行二次多元回歸擬合，對表3中的數據進行多元回歸擬合，獲得回歸方程：

軟件分析得到方程的相關系數R2=0.978 4及R2adj= 0.950 6，表明模型可以解釋95.06%的凝固型紅曲酸奶品質的變化，進一步說明了回歸方程的擬合程度較好，可以用此模型對凝固型紅曲酸奶品質進行預測。

表3 響應面分析結果Table 3 Results and analysis of response surface methodology

表4 回歸方程方差分析Table 4 Variance analysis of regression equation

回歸方程方差分析結果見表4。由表4可知，整體模型極為顯著（“P＞F值”＜0.001）；失擬項（P=0.209 3＞0.05）不顯著，說明方程的整體擬合度良好。從表4中還可以看出，二次項A2對結果得影響高度顯著（P＜0.000 1），一次項A、B、C，二次項B2、C2，交互項BC對結果影響是顯著的（P＜0.05），交互項AB，AC對結果影響不顯著。由主因素A、B、C的F值可知，各因素對紅曲酸奶感官品質影響的次序為發酵時間＞接種量＞紅曲米添加量。

2.4 多因素交互作用響應曲面圖分析[17]

圖5～圖7為主要影響因子對響應面值的響應曲面及等高線圖。

圖5 紅曲米添加量與菌種接種量對酸奶感官品質的響應面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour line ofMonascusrice addition and inoculum on the sensory quality of yogurt

由圖5可知，等高線接近圓形，說明紅曲米添加量和接種量兩個因素的交互作用很小；此外，在等高線圖上，菌種接種量變化趨勢更快，可以看出菌種接種量的影響要大于紅曲米添加量對酸奶感官品質的影響。

由圖6可知，等高線圖表現為橢圓形可知，發酵時間與菌種接種量的交互作用顯著，此外，等高線圖上還可以看出發酵時間的變化趨勢大于菌種接種量的變化趨勢，說明發酵時間對紅曲酸奶感官品質的影響要大于菌種接種量對紅曲酸奶感官品質的影響。

由圖7可知，等高線圖接近圓形，說明發酵時間與紅曲米添加量交互作用很小，此外，等高線也可明顯看出發酵時間的變化趨勢快于紅曲米添加量，說明發酵時間比紅曲米添加量對酸奶感官的影響相對較為顯著。所以，選擇適當的發酵時間對紅曲酸奶的品質尤為重要。

圖6 發酵時間與菌種接種量對酸奶感官品質的響應面和等高線Fig.6 Response surface plots and contour line of fermentation time and inoculum on the sensory quality of yogurt

圖7 紅曲米添加量與發酵時間對酸奶感官品質的響應面和等高線Fig.7 Response surface plots and contour line ofMonascusrice addition and fermentation time on the sensory quality of yogurt

2.5 最佳工藝條件的驗證

由響應面試驗的分析可知，回歸模型存在最大值，紅曲酸奶發酵條件理論值為紅曲米添加量4.83%，菌種接種量4.23%，發酵時間5.37h，在此最佳條件下，酸奶感官評分為96.3分。為了檢驗上述方法的可靠性，考慮到實際操作方便，選取紅曲米添加量為4.8%，菌種接種量為4.2%，發酵時間為5.5h，在此條件下進行3組平行試驗，最終得到的紅曲酸奶感官評分平均值為95.3分，與理論預測值差異不顯著，這說明回歸方程能夠真實地篩選因素對紅曲酸奶感官品質的影響，對于紅曲酸奶的制作工藝的研究具有指導意義。

3 結論

在單因素試驗的基礎上，通過Box-Behnken中心組合試驗設計，對紅曲米添加量、菌種接種量和發酵時間3個因素進行響應曲面分析，結果表明，紅曲米添加量、菌種接種量以及發酵時間都會影響紅曲酸奶的感官評分（P＜0.05）。綜合分析確定的最佳工藝條件為紅曲米添加量4.8%，菌種接種量4.2%，發酵時間5.5h，在此條件下，其感官評分平均值為95.3分，與理論預測值擬合程度較好，說明響應曲面法對紅曲酸奶工藝條件的優化是可行的。

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Optimization of fermentation process ofMonascusyogurt by response surface methodology

XIAO Changgui,LIU Zhibin,ZHANG Wen,NI Li*
(Institute of Food Science and Technology,Fuzhou University,Fuzhou 350108,China)

The effective components ofMonascusextracted with ultrasound-assisted method were used for the fermentation of a novelMonascusyogurt.The effect ofMonascusrice addition,inoculum and fermentation time on the sensory quality ofMonascusyogurt were studied by single factor experiment and they were further optimized by central composite design and response surface methodology.Results showed that the optimum fermentation conditions were as follows:Monascusrice addition 4.8%,inoculum 4.2%and fermentation time 5.5 h.Under the optimal condition,the Monascusrice yogurt had delicate structure,uniform color and moderate sweetness and sourness.The sensory evaluation score was 95.3,which was almost consistent with the predicted data.

ultrasonic-assisted extraction;response surface methodology;Monascusyogurt;sensory evaluation

TS252.54

B

0254-5071（2014）04-0145-05

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.04.035

2014-02-17

國家自然科學基金（313718207）

肖昌貴（1989-），男，碩士研究生，研究方向為食品生物技術。*

倪莉（1972-），女，教授，博士，研究方向為食品與生物化學。