茯苓枸杞組合多糖的抗氧化活性研究

分別提取茯苓和枸杞多糖，將兩者按照1：1組合得到組合多糖（PM），通過三種自由基清除試驗(yàn)以及過氧化氫氧化損傷的人正常肝細(xì)胞模型，檢測(cè)多糖對(duì)細(xì)胞抗氧化活性。兩種多糖和組合多糖均顯示了較好的抗氧化活性，在過氧化氫造成的損傷肝L02細(xì)胞，組合多糖顯示了顯著的抗氧化作用，在濃度為100μg/mL時(shí)，L02細(xì)胞存活率最高。組合多糖可以明顯下降過氧化氫損傷L02細(xì)胞的MDA濃度，并可以顯著提高損傷細(xì)胞的兩種抗氧化酶SOD和GSH-Px的活力。

食品來源多糖（Polysacharide） 結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具有多種生物學(xué)功能，包括抗氧化、減輕炎癥、降糖、降脂等功能。很多研究表明不同食品來源多糖具有較好的抗氧化的功能，其主要是通過促進(jìn)抗氧化酶活性、減少自由基生成及抑制脂質(zhì)過氧化來完成。有研究表明，不同組合多糖共同應(yīng)用的抗氧化效果更強(qiáng)。人體肝臟的正常功能對(duì)于維持人體代謝非常重要，肝臟代謝非常活躍，其在不同生理狀態(tài)下產(chǎn)生活性氧自由基，在一定的條件下引發(fā)的氧化應(yīng)激認(rèn)為會(huì)造成不同程度的肝臟細(xì)胞損傷，積累的自由基損傷會(huì)加速慢性肝病的形成和發(fā)展。目前在體外使用肝L02細(xì)胞的過氧化氫損傷模型，能較為有效的評(píng)價(jià)食品中活性成分的抗氧化能力。

茯苓，為多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，《名醫(yī)別錄》中記載其能“調(diào)臟氣，伐腎邪，長陰，益氣力，保神守中”。枸杞味甘性平、補(bǔ)腎益精、補(bǔ)血安神。枸杞和茯苓配伍，具有健脾益腎的效果。

前期實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)不同種類食品來源提取的多糖進(jìn)行了抗氧化能力的初步評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)其中茯苓和枸杞制備多糖及兩者組合的多糖，在自由基清除等抗氧化活性評(píng)價(jià)中顯示了較好的抗氧化能力，在此基礎(chǔ)上，我們使用人正常肝細(xì)胞L02的過氧化氫損傷模型進(jìn)行檢測(cè)評(píng)估，試圖為今后進(jìn)一步的組合多糖應(yīng)用提供可能的依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

枸杞，產(chǎn)自寧夏，為茄科植物枸杞Lycium barbarum L的干燥成熟果實(shí)。茯苓，產(chǎn)自云南，為多孔菌科茯苓屬真菌茯苓Poria cocos P的菌核。它們購自廣州至信中藥飲片有限公司。1，1-二苯-2-苦基肼、抗壞血酸VC和MTT（噻唑藍(lán)）均購自上海麥克林生化科技有限公司，MDA檢測(cè)試劑盒、SOD檢測(cè)試劑盒和GSH-Px檢測(cè)試劑盒均購自上海碧云天公司。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（型號(hào)EYELA，日本）、冷凍干燥機(jī)（寧波新芝）、全波長分光光度計(jì)（上海元析）、酶標(biāo)儀（美國Thermo）、二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo）。

1.2 方法

參照兩種不同方法提取枸杞多糖（LBP）和茯苓多糖（PP）。分別將購買的枸杞、茯苓清洗后烘干、研磨為粗粉，熱水浸泡提取，經(jīng)離心，醇沉，Sevage法除蛋白，然后透析，產(chǎn)物經(jīng)冷凍干燥后制得樣品。將制備的枸杞、茯苓多糖質(zhì)量進(jìn)行制備茯苓：枸杞（1：1）組合多糖（TP）。

自由基清除的檢測(cè)，多糖濃度分別設(shè)置為1mg/mL、 0.8mg/mL、0.6mg/mL、0.4mg/mL、0.2mg/mL，VC作陽性對(duì)照，進(jìn)行DPPH自由基清除率、 ·OH清除率測(cè)定和超氧陰離子自由基的清除率測(cè)定。

H2O2氧化損傷L02細(xì)胞的評(píng)價(jià)

細(xì)胞以1×104個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100μL加入完全培養(yǎng)液，設(shè)置正常細(xì)胞組、H2O2組、多糖組。細(xì)胞多糖組分別加入終濃度為0、25、50、100、200、400、800μg/mL的枸杞多糖、茯苓多糖和組合多糖的含血清培養(yǎng)液處理24小時(shí)，H2O2組和多糖各組都加入100μL含50μmol/L H2O2培養(yǎng)液，損傷4h，正常細(xì)胞組加入100μL培養(yǎng)液處理4h。用噻唑藍(lán)染色法檢測(cè)后獲得細(xì)胞存活率。

設(shè)置正常組，H2O2組和篩選出的100μg/mL多糖濃度組，參照使用說明書檢測(cè)丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活力。

統(tǒng)計(jì)分析運(yùn)用Graphpad軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以 x±s（標(biāo)準(zhǔn)差）表示，P<0.05 表示顯著差異，P<0.01 表示差異極顯著。

2.結(jié)果與分析

2.1 枸杞多糖、茯苓多糖、組合多糖清除DPPH自由基的檢測(cè)

如圖1，隨著培養(yǎng)液中多糖濃度的增加，清除DPPH自由基比例逐漸升高。相同濃度時(shí)，組合多糖清除效果略強(qiáng)于兩種多糖，枸杞多糖的清除率高于茯苓多糖組。組合多糖清除DPPH自由基能力在0.6 mg/mL時(shí)達(dá)到最高。

2.2 枸杞多糖、茯苓多糖和組合多糖清除·OH自由基的檢測(cè)

由圖2顯示，隨著濃度升高，枸杞多糖、茯苓多糖和組合多糖對(duì)·OH自由基的清除能力增強(qiáng)，清除比例增加。組合多糖濃度在0.2-0.4 mg/mL時(shí)，對(duì)·OH自由基清除作用強(qiáng)于其他多糖組，組合多糖清除·OH自由基能力在0.6 mg/mL時(shí)達(dá)到最高。

2.3 枸杞多糖、茯苓和組合多糖清除超氧陰離子自由基檢測(cè)

圖3顯示，各組多糖隨著濃度的升高，清除超氧陰離子自由基的能力先增強(qiáng)，但到0.6 mg/mL濃度時(shí)開始減弱，對(duì)O2-·自由基的清除能力均低于同濃度的VC溶液。在0.4mg/mL濃度時(shí)，組合多糖清除O2-·自由基最強(qiáng)。

2.4多糖對(duì)L02細(xì)胞保護(hù)濃度的測(cè)定

在之前的實(shí)驗(yàn)中，50μmol/L的H2O2與L02細(xì)胞共培養(yǎng)R0ahEuMJ//wZbcK8V92P9IWCr2lTw9i/vCjhiQQRBN4=4小時(shí)，細(xì)胞存活率約為50%，使用此條件對(duì)肝細(xì)胞進(jìn)行損傷造模。如圖4，在100μg/mL濃度，LBP組和PP組的存活率最高。組合多糖濃度在25、50、100μg/mL時(shí)，肝細(xì)胞活力高于同濃度的兩種多糖。當(dāng)組合多糖濃度是100μg/mL時(shí)，細(xì)胞存活率為84.3%，達(dá)到最高。

2.5 L02細(xì)胞抗氧化指標(biāo)檢測(cè)

如表1，過氧化氫損傷L02細(xì)胞后，與正常細(xì)胞組相比，損傷組的MDA濃度顯著增加，損傷組的SOD和GSH-Px活力顯著減低。多糖各組與過氧化氫損傷組相比，細(xì)胞MDA濃度降低，細(xì)胞的抗氧化酶SOD和GSH-Px活力均顯著增加。其中組合多糖的兩種抗氧化酶活性最高，明顯高于單種多糖。

3.討論

肝臟是機(jī)體代謝活動(dòng)非?；钴S的器官，肝臟細(xì)胞在代謝過程中線粒體產(chǎn)生大量的氧自由基（ROS），在一些特殊因素作用下，導(dǎo)致產(chǎn)生過量的自由基引起氧化應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致肝臟細(xì)胞的受損，這種損傷在一定范圍內(nèi)，細(xì)胞可以通過自身抗氧化酶的激活及其他清除自由基的方式來修復(fù)損傷，當(dāng)損傷超出修復(fù)能力時(shí)候，細(xì)胞自身功能不能得到改善，將導(dǎo)致細(xì)胞衰老或者死亡。食品來源的一些多糖能夠清除過量活性氧自由基，并維持細(xì)胞線粒體的正常生理機(jī)能，減少自由基對(duì)細(xì)胞的損傷。

在前期的實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)多種食品來源多糖進(jìn)行抗氧化活性檢測(cè)，根據(jù)之前實(shí)驗(yàn)的結(jié)果選擇了枸杞和茯苓多糖，發(fā)現(xiàn)其多糖在清除DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基的方面能力較強(qiáng)。在正常肝細(xì)胞L02細(xì)胞過氧化氫氧化損傷實(shí)驗(yàn)中，組合多糖濃度在100μg/mL時(shí)，細(xì)胞活力最高，與其他單種多糖相比，低濃度的組合多糖抗氧化能力更強(qiáng)。據(jù)此認(rèn)為，組合茯苓枸杞多糖通過提高兩種抗氧化酶的活性，降低丙二醛的濃度，減少了過氧化氫的氧化應(yīng)激對(duì)肝細(xì)胞的損傷。

上述結(jié)果表明，組合多糖自由基清除能力與單種多糖相近，在肝L02細(xì)胞過氧化氫損傷實(shí)驗(yàn)中，低濃度的組合多糖與單種多糖相比，抗氧化能力更強(qiáng)。期待組合多糖后續(xù)應(yīng)用于護(hù)肝功能添加。

基金項(xiàng)目

2022年廣東省大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目“運(yùn)動(dòng)肽健康營養(yǎng)素”（編號(hào)：S202210573038）。

作者簡介

王祈蘅（2002.11-），女，漢族，廣東珠海人，本科在讀；研究方向：生物技術(shù)。

*通訊作者

黃宏靚（1974.06-），男，漢族，湖南桂東人，博士，副教授；研究方向：生物技術(shù)。