包裝飲用水中常見致病菌及檢測方法

1.引言

包裝飲用水包括飲用天然礦泉水、飲用純凈水和其他類飲用水，是符合食品安全標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)規(guī)定的包裝容器中密封的，可供消費者直接飲用的水。伴隨我國居民生活水平不斷提高，包裝飲用水的需求量逐年增加。但同時水是致病菌傳播的重要媒介，不安全的飲用水會引發(fā)多種健康問題。《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 飲用天然礦泉水》（GB 8537-2022）是國家為保障居民飲用水安全的強制性技術(shù)文件，具有法律效力。由于水中致病菌具有豐度低、種屬多、耐藥性高和致病性不同等特點，對致病菌的監(jiān)測與管控要求較高，對新型檢測技術(shù)的開發(fā)與應(yīng)用需求迫切。

目前政府機關(guān)針對包裝飲用水（含礦泉水）的微生物檢測方法主要依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗大腸菌群計數(shù)》（GB 4789.3-2016）、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)飲用天然礦泉水檢驗方法》（GB 8538-2016），采用培養(yǎng)法進行計數(shù)與監(jiān)測，人工需求量大，耗時長。隨著近年相關(guān)研究的發(fā)展，分子生物學(xué)檢測技術(shù)因其靈敏、特異、簡便、省時省力等優(yōu)點，在水環(huán)境中致病菌的鑒定與檢測中扮演著重要角色。本文對目前包裝飲用水中主要致病菌及其導(dǎo)致的疾病進行總結(jié)，重點介紹了近年來針對飲用水中致病菌檢測的各項檢測技術(shù)，并橫向比較，以期為發(fā)現(xiàn)與推廣高效便捷的致病菌檢測方法提供理論基礎(chǔ)。

2.包裝飲用水中致病菌及相關(guān)疾病

包裝飲用水雖然通過了嚴格的凈化程序，但仍有污染風(fēng)險。查閱資料可知，國內(nèi)外現(xiàn)行食品安全標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的礦泉水未檢出菌包括：總大腸菌群（Coliform group）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）、和軍團菌（Legionella）。

2.1 總大腸菌群

總大腸菌群是指需氧或兼性厭氧，在37℃條件下能將乳酸分解并產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，包括腸桿菌屬、大腸埃希氏菌屬等，在自然環(huán)境中普遍存在。由于總大腸菌群廣泛寄生在溫血動物腸道內(nèi)，在體外存活時間以及對消毒劑的抵抗力與腸道致病菌相近，因此長期作為水質(zhì)污染的指示菌使用，也是水體中有無致病菌的間接指標(biāo)。

總大腸菌群中部分種屬為條件致病菌，能引起腸道感染性疾病，表現(xiàn)多為腹瀉、腹痛。

2.2 銅綠假單胞菌

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），為非發(fā)酵專性需氧革蘭陰性桿菌，是一種常見的條件致病菌，又名綠膿桿菌，廣泛存在于潮濕環(huán)境。銅綠假單胞菌通過形成生物膜的方式，黏附在生物體或非生物材料表面，以應(yīng)對不良環(huán)境，并進行菌體的散播和定殖。中國質(zhì)量新聞網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示，近年來，超過半成的包裝飲用水不合格產(chǎn)品為致病菌不合格，且多為銅綠假單胞菌檢出。

銅綠假單胞菌是能夠令免疫系統(tǒng)受損的條件致病菌，多影響人體呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等部位，在特定條件下可引起呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、創(chuàng)傷面等部位感染，甚至能引起急性或慢性感染，嚴重時可引起膿毒血癥、敗血病和細菌血癥。

2.3 糞腸球菌

糞腸球菌（Enterococcus faecalis），舊名糞鏈球菌，為兼性厭氧型革蘭氏陽性球菌。菌體形態(tài)多為球狀或鏈狀，無莢膜、無芽孢，對環(huán)境的適應(yīng)力和抵抗力強，可耐受多種抗生素，可以作為新近糞便污染的指示菌。

目前，對食源性糞腸球菌耐藥性和毒力基因等比對分析研究相對較少，糞腸球菌由于其對抗生素的耐受性和對環(huán)境的抵抗力，多見于院內(nèi)感染，引起食源性疾病暴發(fā)的較罕見且多表現(xiàn)為腹瀉、腹痛。

2.4 產(chǎn)氣莢膜梭菌

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens）為革蘭氏陽性專性厭氧桿菌，無鞭毛。產(chǎn)氣莢膜梭菌多以芽胞形式存在于自然界中，也存在于人、動物及其腸道中，是腸道的正常菌群之一，是典型的糞便污染指示菌。

產(chǎn)氣莢膜梭菌是一種條件致病菌，可產(chǎn)生多種外毒素，食源性攝入會導(dǎo)致食物中毒、腹瀉、腸炎和腸毒血癥，孢子或繁殖體侵染傷口或進入動物體內(nèi)可致氣性壞疽。產(chǎn)氣莢膜梭菌毒力強、繁殖速度快、生存力強且能夠高效定植，嚴重危害人類和公眾健康，威脅公共安全。

2.5 軍團菌

軍團菌 （Legionella）是一類需氧革蘭氏陰性胞內(nèi)寄生桿菌，是廣泛存在于各類水體與土壤環(huán)境中的條件致病菌。水體中的微生物能夠為軍團菌提供必要的營養(yǎng)并保護軍團菌抵抗消毒劑，且軍團菌本身對消毒劑有較強的抵抗力，因此軍團菌在以自來水為基礎(chǔ)的生活用水管網(wǎng)中易爆發(fā)。但包裝飲用水經(jīng)過紫外滅菌過程后密封，含氣體量少且沒有宿主細胞，軍團菌缺乏生長繁殖的空間，因此至今未有包裝飲用水導(dǎo)致軍團菌病的案例。

3.飲用水中致病菌的檢測技術(shù)

近年來，隨著我國經(jīng)濟發(fā)展向好，政府對食品安全、環(huán)境保護等方面重視程度增加，同時我國分子生物學(xué)領(lǐng)域的高速發(fā)展，飲用水及水環(huán)境中致病菌的檢測方面研究取得了一定的進展，從單一的傳統(tǒng)致病菌培養(yǎng)檢測方法發(fā)展至多種引入分子生物學(xué)技術(shù)的新興檢測方法。

3.1 培養(yǎng)法

目前，我國現(xiàn)行針對包裝飲用水的微生物檢測方法為基于培養(yǎng)法的濾膜法與酶底物法。濾膜法是將水樣通過特定孔徑的濾膜過濾，然后將濾膜移至選擇性瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)后產(chǎn)生特定代謝產(chǎn)物，從而得到檢測結(jié)果。酶底物法是指將水樣在特定條件下培養(yǎng)后，依據(jù)指定菌產(chǎn)生的酶可以分解選擇性培養(yǎng)基中的熒光底物而產(chǎn)生熒光的原理進行檢測。

培養(yǎng)法經(jīng)過長期實踐應(yīng)用認可，相對偏差較小，具有高度穩(wěn)定性，但檢測耗時費力、操作過程繁瑣復(fù)雜、對操作人員和操作環(huán)境有較高要求，在實際應(yīng)用過程中有一定的局限性。

3.2 PCR法

在飲用水中的致病菌檢測領(lǐng)域，PCR法是目前應(yīng)用最廣的分子生物學(xué)方法之一。相對傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，PCR通過變性、退火和延伸三個過程，擴增特定的靶基因序列，實現(xiàn)對致病菌的檢測，用時短、人工操作少，能夠?qū)z測時間從4-7d縮短為2d，且用可批量進行的DNA提取過程和熒光PCR檢測過程代替人工挑選，再培養(yǎng)及多種生化鑒定。《中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》（SN/T 1896-2007）中，PCR技術(shù)已經(jīng)明確被用于對食品中的數(shù)種致病菌進行快速定性檢測。

熒光定量PCR法（qPCR法）是將熒光標(biāo)記引入PCR反應(yīng)體系，通過實時監(jiān)測攜帶熒光標(biāo)記的特異性引物與目標(biāo)DNA結(jié)合產(chǎn)生的熒光信號來獲得產(chǎn)物的擴增曲線。由于qPCR法特異性高、靈敏度高、耗時短且能夠準(zhǔn)確定量，qPCR法在致病菌檢測領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。目前，有團隊通過對引物和探針進行優(yōu)化，使qPCR法克服了僅能測定單一致病菌的缺點，使qPCR法的應(yīng)用潛力進一步提升。但是，qPCR法無法識別活菌或死菌，可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果。當(dāng)反應(yīng)體系存在PCR抑制物時，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果，目前只能通過改變反應(yīng)環(huán)境解決以上問題。

3.3 等溫擴增技術(shù)

等溫擴增技術(shù)包括環(huán)介導(dǎo)等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification method， LAMP）和重組酶等溫擴增（Recombinase polymerase amplification， RPA）檢測技術(shù)，主要通過添加不同活性的酶和特異性引物快速擴增核酸，是新近適用于檢測食源性和環(huán)境病原體的分子生物學(xué)檢測方法。

其中，LAMP是基于Bst.DNA聚合酶的鏈置換特性實現(xiàn)的在恒定溫度下進行的快速多引物擴增技術(shù)，成本低、操作簡便、無需借助大型儀器、特異性強、靈敏度高較PCR高，但存在引物設(shè)計復(fù)雜、產(chǎn)物容易引發(fā)氣溶膠污染和假陽性頻率高的缺點。

RPA是針對痕量核酸模板上的目的基因的恒溫條件擴增，具有檢測時間極短、靈敏度極高的特點。該方法已具有成熟的商業(yè)試劑盒，對操作人員技術(shù)要求低、檢測結(jié)果可視化，非常適用于實地檢測，具有較大的應(yīng)用前景。

3.4 生物傳感器

生物傳感器（biosensor）是能夠?qū)⒎治鑫餄舛绒D(zhuǎn)化為特定信號來檢測生物或化學(xué)反應(yīng)的裝置，由生物受體識別元件和信號轉(zhuǎn)換元件構(gòu)成，可根據(jù)受體識別元件和信號轉(zhuǎn)換元件的類型不同大致分為光化學(xué)生物傳感器和電化學(xué)生物傳感器。

生物傳感器技術(shù)能夠?qū)Ψ磻?yīng)進行定量、連續(xù)、實時的監(jiān)測，且信號讀取方便，易于商品化，對操作人員和環(huán)境要求較低，能夠低成本、大范圍、快速檢測。在食品和環(huán)境領(lǐng)域的微生物檢測中有廣闊的應(yīng)用前景。但現(xiàn)存生物傳感器缺乏對于食源性微生物選擇性高的受體識別元件，使用壽命較短，仍需發(fā)展。

3.5 DNA微陣列技術(shù)

DNA微陣列技術(shù)是將在玻片上固定的大量dsDNA分子作為探針，與大量的DNA分子和DNA結(jié)合蛋白之間的相互作用，通過模擬DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子在體內(nèi)與相應(yīng)結(jié)合位點的相互作用，并產(chǎn)生標(biāo)記物，實現(xiàn)對特定DNA片段的鑒定，也被稱為DNA芯片。

微陣列技術(shù)檢測通量極大，可實現(xiàn)對大量菌種的同時檢測。但該技術(shù)檢測限較高，靈敏度較低，對樣品中致病菌的豐度有較高的要求。同時，微陣列制備過程中，對程序設(shè)計和制備系統(tǒng)的要求很高，對轉(zhuǎn)錄因子蛋白的純度和數(shù)量有較高要求，對反應(yīng)的生化環(huán)境限制大。

4.結(jié)語與展望

本文通過對包裝飲用水中常見的致病菌及現(xiàn)行檢測方式進行綜述，可以發(fā)現(xiàn)，近年來，等溫擴增、PCR等分子生物學(xué)方法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于實驗室環(huán)境下飲用水致病菌檢測中，并發(fā)揮了重要作用。目前，各類高通量測序技術(shù)在致病菌的定性與定量領(lǐng)域的應(yīng)用處于高速發(fā)展階段，基于分子生物學(xué)的高效、靈敏、準(zhǔn)確的致病菌檢測技術(shù)將是未來致病菌檢測領(lǐng)域的新星。如何將各項技術(shù)穩(wěn)定、低成本、廣泛、自動化地投入一線使用，如何實現(xiàn)檢測對象由指示菌和少數(shù)腸道病原菌到不可培養(yǎng)和新出現(xiàn)的致病菌的轉(zhuǎn)變，是該領(lǐng)域未來研究的重點。

同時，針對包裝飲用水水源污染程度低、密閉性好、運輸儲存時間長等特點，在對包裝飲用水中致病菌進行檢測時，相較于傳統(tǒng)的對操作環(huán)境要求較高的培養(yǎng)法，檢測所需時間較短的分子生物學(xué)方法顯然準(zhǔn)確性更高。但在菌群檢測的準(zhǔn)確性上，基于分子生物學(xué)的檢測方法仍需要大量實驗驗證，并不斷更新技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)，與傳統(tǒng)衛(wèi)生學(xué)方法有機結(jié)合。

第一作者

張淑琪（2003-），女，漢族，河南開封人，本科在讀；專業(yè)：生物科學(xué)。

*通訊作者

朱振洪（1971.10-），男，漢族，湖北黃岡人，副教授，博士；研究方向：生化與分子生物學(xué)。