基于圖像識別的酵母活細胞率快速測定系統

基金項目：宜昌市自然科學研究項目（A23-2-037）。

作者簡介：張小驥（1990—），男，湖北宜昌人，碩士，工程師。研究方向：食品安全。

摘 要：酵母活細胞率作為評判活性干酵母質量優劣的重要指標之一，準確快速地檢測出結果顯得尤為重要。本文針對傳統方法進行活細胞率檢測存在效率低、過程復雜等問題開發了一款計數軟件，并將血球計數板替換為96孔細胞培養板進行計數。對比人工計數和軟件計數在檢測酵母活細胞率的誤差以及采用不同容器進行檢驗的效率，結果表明，相對于人工計數，軟件計數耗時更短，且誤差較??；采用96孔細胞培養板批量檢測比采用血球計數板耗時更短。

關鍵詞：酵母計數；活細胞率；霍夫圓變換；圖像處理

A Rapid Measurement System for the Survival Rate of Yeast Living Cells Based on Image Recognition

ZHANG Xiaoji， QIN Leilei， JIANG Yifei， HE Xiaoyan， ZHANG Xueqi

（Three Gorges Public Inspection and Testing Center， Yichang 443000， China）

Abstract： As one of the important indicators for evaluating the quality of active dry yeast， accurate and rapid detection of the results is particularly important. A counting software was designed for solving the issues of low efficiency and complex process in traditional method， blood cell counting plate is replaced by 96-well cell plate in this measurement system. Comparing the errors of manual counting and software counting in measuring survival rate of yeast living cells and the efficiency of different containers， the results reveal that software counting has less time consuming and errors compared with manual counting; compared with blood cell counting plate a significant advantage has shown in measuring a large number of samples by using 96-well cell plate.

Keywords： yeast counting; survival rate of living cells; Hough circle transform; image recognition

活性干酵母是鮮酵母經干燥脫水后仍保持生物活性的干制品[1]，它是利用現代生物技術與生產工藝，將規模化生產的酵母細胞制成干物質含量超過95%的實用性酵母產品?；钚愿山湍赋缓鞍踪|和維生素外，還含有必需微量元素和生長因子，具有穩定性好、成本低廉、效果優良等特點[2]。酵母活細胞率是評判活性干酵母質量優劣的重要指標，目前常規的活細胞率檢測方法為《酵母產品質量要求 第1部分：食品加工用酵母》（GB/T 20886.1—2021）中附錄D，該方法原理為活細胞能將進入細胞的次甲基藍染色劑還原為無色，死細胞由于無還原能力，次甲基藍進入細胞后將其染成藍色[3]。國家標準方法中采用血球計數板作為容器計數，通過人工計數方式統計血球計數板中4個視野內中方格里酵母細胞數，計算出活細胞率。該方法的缺點是每次使用完血球計數板需要反復清洗、晾干后才能進行下一次實驗，不便于批量處理；人工細胞計數耗時長、易視覺疲勞，若期間受到干擾或打擾，常面臨返工風險，效率低，出錯率高。

筆者利用Python編寫了計數軟件替代人工計數，以解決以上難題。顯微鏡電子目鏡采集圖像后，通過霍夫圓變換識別所有酵母細胞，再將圖片進行閾值分割及二值化變換，利用形態學方法處理圖片，識別圖中輪廓數，即可識別出死細胞個數。1塊血球計數板單次只能測單個樣品，而1塊96孔細胞培養板可同時檢測多個樣品，且不需要清洗，批量處理速度快。以下對該軟件計數方法進行介紹。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

儀器：全功能手動正置光學顯微鏡、恒溫水浴

鍋、電子天平、倒置熒光顯微鏡。試劑和耗材：次甲基藍、氯化鉀、碳酸氫鈉、葡萄糖、氯化鈉、六水氯化鈣、96孔細胞培養板、血球計數板。

1.2 前處理方法

1.2.1 血球計數板前處理方法

稱取高活性干酵母0.1 g于50 mL離心管，向其中加入20 mL生理鹽水，溫度為38～40 ℃，將離心管放入32 ℃水浴鍋中活化1 h，活化完畢后，將離心管內樣品混合均勻，再吸取混合液0.1 mL于

1 mL離心管，向其中加入次甲基藍染色液0.9 mL，搖勻，室溫下染色10 min，將蓋玻片蓋在血球計數板計數室上，使之緊緊蓋在血球計數板上，吸取

20 μL染色后的溶液至血球計數板的計數室內，靜置1～2 min，用正置顯微鏡觀察[4]。正置顯微鏡下血球計數板細胞形態如圖1所示。

圖1 顯微鏡視野下血球計數板上酵母形態

1.2.2 96孔細胞培養板前處理方法

稱取高活性干酵母0.1 g于50 mL離心管，向其中加入20 mL生理鹽水，溫度為38～40 ℃，將離心管放入32 ℃水浴鍋中活化1 h，活化完畢后，將離心管內樣品混合均勻，再吸取混合液0.1 mL于

1 mL離心管，向其中加入次甲基藍染色液0.9 mL，搖勻，室溫下染色10 min，取100 μL染色后溶液至96孔細胞培養板小孔內，靜置1～2 min，用倒置顯微鏡觀察。倒置顯微鏡下96孔細胞培養板中細胞形態如圖2所示。

圖2 顯微鏡視野下96孔細胞培養板上酵母形態

1.3 計數原則

1.3.1 人工計數

將載玻片放入顯微鏡中，在10倍目鏡和16倍物鏡下找到血球計數板中目標方格，再切換40倍物鏡，調整焦距至視野最清晰處，開始對細胞計數，如果細胞在方格線上，則記上不記下，記左不記右。隨機計數4個中方格（100個小方格）內酵母細胞數，結果取3次計數的算術平均值。無色透明的細胞為酵母活細胞，被染為藍色的為酵母死細胞。

1.3.2 軟件計數

在10倍目鏡和16倍物鏡下找到96孔細胞培養板中目標方格，再切換40倍物鏡，調整焦距至視野最清晰處，開始計數，計數范圍為視野內全部細胞，隨機計數4個視野內細胞。

1.4 自動識別計數方法的實現

1.4.1 細胞總數識別計數原理

由于大多數種類酵母細胞在顯微鏡下呈類圓形[5]，可利用霍夫圓變換檢測顯微鏡視野下的酵母細胞數[6-7]?；舴驁A變換在圖像處理中使用頻率很高，可以用來檢測圖像中的圓形。該算法的原理是基于圓的數學特性，對圖像中所有的像素點進行統計和梯度計算，找出圓心和半徑，從而實現圓的檢測。在霍夫圓變換中，首先需要對圖像進行邊緣檢測，以便找出圖像中的邊緣。對可能組成圓的邊緣像素點采取梯度計算，得到每個像素點的梯度值和方向。再將梯度值和方向轉換為霍夫空間中的曲線，通過對曲線進行投票，找出圓心和半徑[8]。在軟件中調用霍夫圓變換法進行圓檢測，需要將圖像轉換為灰度圖像，流程見圖3。

圖3 總細胞計數流程

活的酵母細胞在顯微鏡視野下呈透明類圓形，死亡酵母細胞被次甲基藍染色，呈藍綠色透明類圓形（圖4）。

圖4 顯微鏡下酵母細胞

通過電子目鏡將顯微鏡下視野截圖并上傳至計數軟件識別計數，被計數軟件統計的細胞外側會標記圓圈（圖5）。

圖5 識別并標記的酵母細胞

1.4.2 死細胞識別計數原理

酵母死細胞染成藍色，顏色明顯區別于活細胞和背景。電子目鏡拍攝圖片為RGB色彩模式，是一種面向硬件的色彩模式，屬于加法混色原理，RGB色彩模式中3個色彩分量之間聯系緊密，只要亮度變化，分量值均會發生變化，且光線亮度對RGB值影響較大。因此，可以采用HSV色彩空間替代RGB色彩空間。相對于RGB色彩空間，HSV色彩空間能更直觀顯示出顏色的鮮艷程度、敏感程度等，方便人眼進行顏色對比[9-10]。HSV色彩空間相比于RGB色彩空間更容易實現對某種顏色的物體的追蹤，也常用于分割指定顏色的物體。將圖像轉換為HSV色彩空間后，能使目標顏色更突出，更易通過設定閾值將圖像二值化，排除背景干擾，留下感興趣區域（Reigion of Interest，ROI）。將ROI區域圖像進行優化處理后，即可識別并計數死細胞，識別流程見圖6。

圖6 死細胞識別計數流程圖

（1）閾值分割。將RGB色彩空間轉換為HSV色彩空間，觀察者通過色調、飽和度和亮度能更好地感知顏色。從細胞的HSV圖像可以發現，染色的死細胞與活細胞及背景的對比度較大[圖7（a）]，可以采用閾值分割法將死細胞和活細胞以及背景區分開。通過設定相應閾值，對圖像進行二值化處理，在閾值范圍內的點像素設為255，閾值范圍外的點像素設為0，得到一副只有黑白點的圖像，白點為死細胞輪廓[圖7（b）]。

（2）形態學處理。圖像二值化后雖然能將死細胞像素點分離出來，但設定閾值可能會導致部分組成單個死細胞的像素團中出現像素點不連續的情況，造成計數誤差。因此，需要將組成同一細胞的像素點連接起來，同時將噪聲點去除掉。本文采用圖像形態學運算去除背景和連接組成同一細胞的像素點。腐蝕操作可以將圖像中對象的邊緣縮小和消除，達到去除特定像素的目的[11]。它可以用來將二值化圖像中的前景部分進行收縮以及細化，可借此實現去除噪聲的功能，見圖8（a）。利用膨脹可將圖像中像素對象的邊界向外擴展，從而使得相鄰的像素點或像素團連接在一起成為一個對象，該操作可以很好地彌補在腐蝕過程中造成的圖像中間部分缺失的錯誤，從而達到將單個細胞像素點或像素團填充連接的效果，見圖8（b）。

（3）計數。在二值化圖像中，經過腐蝕、膨脹操作后，會留下多個獨立的組成死細胞的像素團，對像素團計數即為死細胞數。但像素團多為不規則形，無法采用霍夫圓變換進行計數，此時可通過輪廓識別對像素團計數。圖像輪廓是指圖像中具有相同顏色或灰度值的連續點的曲線，可以有各種形狀，通過對圖像輪廓進行標記，可獲得目標圖像相關信息[12]。本文采用圖像輪廓識別并標記死細胞，死細胞輪廓用黑色標記出來（圖9）。

2 結果與分析

2.1 人工計數和軟件計數結果差異

實驗室選取了5個酵母產品測定活細胞率，采用96孔細胞培養板為容器，分別用人工計數和軟件計數比對，結果如表1所示。相對于人工計數，軟件計數中細胞總數和死細胞數略偏低（不采用軟件中人工修正功能時），活細胞率的相對誤差在3%以內。軟件計數的數據偏低有以下幾個原因：少量細胞不夠圓，形態偏扁，軟件無法識別為細胞；存在大量細胞團，少量細胞粘連程度高，無法分開計數；部分死細胞顏色偏淺，無法通過設置閾值將其分割出來。

2.2 采用不同容器檢測流程的區別

采用96孔細胞培養板和血球計數板分別檢測

5個酵母產品的活細胞率指標，對比結果見表2。采用96孔細胞培養板檢測活細胞率在單個樣品檢測或者批量檢測中均能體現出更高的檢測效率。

3 結論

本文基于圖像識別技術實現了酵母活細胞率的快速檢測，操作簡單、識別準確率高，識別產生的計數誤差也可通過軟件人工修正功能進行手動干預調整。該方法能滿足日常檢測活細胞率的需要，可有效輔助或替代人工計數進行樣品檢測。采用96孔細胞培養板替代血球計數板在批量檢測方面具有更高的效率。

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