基于酶底物法檢測飲用水中大腸埃希氏菌的研究

作者簡介：張瑩（1990—），女，北京人，本科，主管檢驗師。研究方向：微生物檢驗。

摘 要：為探究酶底物法檢測飲用水中大腸埃希氏菌的準確性和便捷性，從不同地點采集水樣，采用標準檢測法和酶底物法同時檢測飲用水中的大腸埃希氏菌。結果表明，標準檢測法檢測出16份陽性樣品和

3份陰性樣品，酶底物法檢測出17份陽性樣品和2份陰性樣品，兩種方法檢測的陽性率無顯著性差異（P＞0.05）；14份樣品最大可能數一致，5份樣品最大可能數有差異，酶底物法檢測的靈敏度高于標準檢測法。本研究為飲用水中微生物的快速、高效檢測提供了數據基礎。

關鍵詞：大腸埃希氏菌；飲用水；酶底物法

Study on Detection of Escherichia coli in Drinking Water Based on Enzyme Substrate Method

ZHANG Ying， ZHAO Hui， SU Dongxia， CUI Yujuan， ZHAO Lu

（Beijing Yanqing District Center for Disease Control and Prevention， Beijing 102100， China）

Abstract： In order to understand whether the enzyme substrate method can quickly and accurately detect Escherichia coli in drinking water， water samples were collected from different locations， and standard detection method and enzyme substrate method were used" to detect Escherichia coli in drinking water at the same time. The results showed that 16 positive samples and 3 negative samples were detected by standard detection method， and 17 positive samples and 2 negative samples were detected by enzyme substrate method， there was no significant difference in the positive rate between the two methods （Pgt;0.05）. The maximum probable number of 14 samples were consistent， and the maximum probable number of 5 samples were different. The sensitivity of enzyme substrate method was higher than that of standard method. The research provides data basis for rapid and efficient detection of microorganisms in drinking water.

Keywords： Escherichia coli; drinking water; enzyme substrate method

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）是一種廣泛存在于自然界的腸道細菌，可分為致病性與非致病性兩大類，通常多數大腸埃希氏菌對人體無害。然而，當水源受到污染時，大腸埃希氏菌的數量會顯著增加，從而對人體健康構成威脅。由此可以看出，檢測大腸埃希氏菌可對飲用水的衛生情況做出評價[1-3]，準確檢測飲用水中大腸埃希氏菌的含量是確保水質安全的關鍵。在大腸埃希氏菌檢測方面，常見的標準檢測方法以特定培養聯合聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）檢測為主，但該方法檢測時間較長，通常需要3～5 d才能完成檢測，而且操作過程復雜，不能滿足快速檢測的要求[4-5]。酶底物法是使用最小酶底物MMO-MUG（Minimal Media ONPG-MUG）作為底物，在一定溫度下培養一定的時間，大腸埃希氏菌產生的β-半乳糖苷酶，將培養基中的無色鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷分解為黃色的鄰硝基苯酚，同時大腸埃希氏菌又能產生β-葡萄糖醛酸酶，將培養基中的4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷分解為4-甲基傘形酮，在紫外燈照射下產生熒光。酶底物法操作簡單，結果呈現快速，特異性高[6-7]。

本研究從不同地點采集水樣，利用酶底物法和標準檢測方法同時檢測大腸埃希氏菌，確定酶底物法的準確性和便捷性，為今后食品中微生物的快速、高效檢測提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在北京市某地某餐飲店、某飲品店、某小區居民水龍頭、二次供水水箱4個地點共采集40個樣品，每個采樣點采集10件樣品。選擇一次性無菌采樣瓶進行采樣，為消除活性氯和重金屬離子的影響，在采樣時加入硫代硫酸鈉溶液消除活性氯影響，加入乙二胺四乙酸二鈉溶液去除金屬離子影響。

1.2 儀器與試劑

DH3600A恒溫培養箱，河南沃林儀器設備有限公司；HulaMixer渦旋振蕩儀，美國賽默飛公司；S2833-6K紫外線燈，鹽城市諾信電子設備有限公司；HR30生物安全柜，深圳科力易翔儀器設備有限公司。

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）ATCC25922、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC6538、

假單胞菌（Pseudomonas）ATCC51821、產氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes）ATCC13048作為質控樣品，中國微生物菌種保存中心；MMO-MUG培養基、大腸桿菌肉湯、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯，美國賽默飛公司；伊紅美藍瓊脂，南通恒凱生物科技發展公司；硫代硫酸鈉溶液、乙二胺四乙酸二鈉，天津科密歐試劑有限公司。在試驗中所使用的各類試劑均按照參考《生活飲用水標準檢驗方法 微生物指標》（GB 5750.12—2006）進行配制[8]。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準檢測法

將待測樣品接種于月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯，每管接種1 mL，在36 ℃培養箱中培養24 h后，從產氣的管中挑取一環接種于大腸桿菌肉湯，在44 ℃培養箱中培養24 h。再從產氣的管中劃線接種于伊紅美藍瓊脂培養基上，在36 ℃培養箱中培養24 h，觀察平板上的菌落，挑取黑色的典型菌落進行純化。之后對單菌落進行革蘭氏染色，并進行生化鑒定，對照最大可能數（Maximum Probable Number，MPN）表查詢MPN值[9-10]。

1.3.2 酶底物法

取1 mL待測樣品接種于月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯，在36 ℃培養箱中培養24 h。取3 g MMO-MUG培養基溶于100 mL無菌水中，每個無菌試管中分裝5 mL溶解完全的MMO-MUG培養基。用接種環從產氣樣品中挑取一環接種于分裝好的MMO-MUG培養液中，在36 ℃培養箱中培養24 h后，將產生黃色反應的試管置于紫外線燈下進行觀察，如果出現藍色熒光，則表明該管大腸埃希氏菌呈陽性，并對照MPN表查出MPN值[9，11]。

1.4 試驗設計

空白對照：每次試驗用無菌水按照標準檢測法和酶底物法步驟進行空白測定，培養后無顏色反應為正常。

產氣對照：將產氣腸桿菌制成300～3 000個/mL懸液，按照標準檢測法和酶底物法步驟進行操作，培養基呈黃色，但在紫外燈照射下沒有熒光為正常。

陰性和陽性對照：將陰性菌（金黃色葡萄球菌、假單胞菌）和陽性菌（大腸埃希氏菌）制成300～

3 000個/mL懸液，按照標準檢測法和酶底物法步驟進行操作，陽性菌株呈現黃色熒光反應、陰性菌株呈現無色狀態為正常。

1.5 數據處理

所有試驗均重復3次，采用SPSS 20.0軟件進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 質控樣品檢測分析

金黃色葡萄球菌和假單胞菌作為陰性菌培養后無顏色產生；產氣腸桿菌培養后顯黃色，沒有藍色熒光；大腸埃希氏菌作為陽性菌培養后顯黃色，有藍色熒光。質控樣品檢測正確，可用于酶底物法檢測。

2.2 不同水樣檢測結果

檢測的40份樣品中有21份不產氣，參考《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗大腸埃希氏菌計數》（GB 4789.38—2012）[12]，鑒定為大腸埃希氏菌陰性。其他19份產氣樣品的檢測結果如圖1所示，其中有5份檢測結果存在差異，酶底物法檢測結果均高于標準檢測法，其余14份檢測結果一致。

標準檢測法檢測出16份陽性樣品、3份陰性樣品，酶底物法檢測出17份陽性樣品、2份陰性樣品，如表1所示。利用t檢驗進行差異顯著性分析，結果顯示兩種方法之間不存在顯著性差異（P＞0.05）。

由表2可知，在5份有差異的組別數據中，酶底物法檢測的MPN值均大于標準檢測法，表明酶底物法檢測靈敏度和特異性更高。

上述實驗結果表明，在飲用水大腸埃希氏菌檢測中，標準檢測法與酶底物法的陽性檢測率不存在顯著性差異，兩種方法對飲用水的檢測結果在準確度上達成一致。

3 結論

對比分析標準檢測法和酶底物法對飲用水中大腸埃希氏菌檢測結果發現，兩種方法在結果一致性、準確性方面無顯著性差異，酶底物法能夠作為評價飲用水中微生物污染情況的檢測方法，而且該方法檢測速度快、底物特異性強、評價效果準確。

總之，酶底物法在檢測速度和底物特異性方面的優勢使其成為評價飲用水中微生物污染情況的理想檢測方法。同時，該方法不僅能夠在飲用水檢測中應用，在其他食品檢測領域也具有廣闊的應用前景。

參考文獻

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