液相色譜法測定醬油中梔子黃的含量

作者簡介：黃錦波（1988—），男，廣東信宜人，本科，助理工程師。研究方向：食品、化妝品與藥品領(lǐng)域的理化分析與功效。

摘 要：目的：建立液相色譜法測定醬油中梔子黃含量的方法。方法：以梔子黃的表征成分（藏花素與藏花酸）為目標(biāo)物，以Hypersil BDS C18柱為分離柱，以甲醇與1%乙酸水為流動相，梯度洗脫，檢測波長為435 nm，外標(biāo)法定量。結(jié)果：藏花素與藏花酸的色譜峰峰形良好，在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.999；回收率在90.52%～103.03%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.5%～4.5%，方法檢出限分別為

2.13 mg·kg-1、5.57 mg·kg-1。結(jié)論：該方法前處理過程較為簡單，結(jié)果重現(xiàn)性好、靈敏度高，回收率符合要求，適用于醬油中梔子黃含量的測定。

關(guān)鍵詞：液相色譜法；醬油；梔子黃；藏花素；藏花酸

Determination of Gardenia Yellow in Soy Sauce by

Liquid Chromatography

HUANG Jinbo

（Guangzhou Golden Assessment Testing Institute Co.， Ltd.， Guangzhou 510000， China）

Abstract： Objective： To establish a liquid chromatography method for the determination of gardenia yellow content in soy sauce. Method： The characterization components of gardenia yellow （crocin and crocetin） were used as the target substances， Hypersil BDS C18 column was used as the separation column， methanol and 1% acetic acid water were used as mobile phases， the detection wavelength was 435 nm， and the quantification method was externally standardized. Result： The chromatographic peaks of crocin and crocetin were well shaped， and the linear relationship （R2） was more than 0.999， the recovery rate was 90.52% to 103.03%， the relative standard deviation was 0.5% to 4.5%， and the detection limits of the method were 2.13 mg·kg-1 and 5.57 mg·kg-1， respectively. Conclusion： The pretreatment process of this method is relatively simple， the results are reproducible， the sensitivity is high， and the recovery rate meets the requirements， which is suitable for the determination of gardenia yellow content in soy sauce.

Keywords： liquid chromatography; soy sauce; gardenia yellow; crocin; crocetin

醬油是以黃豆為原料，經(jīng)發(fā)酵等工藝制作而成，是我國歷史悠久的傳統(tǒng)美食[1]。醬油制作過程中，往往會添加一定量的梔子黃，起到增色的作用。根據(jù)《食品安全標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑》（GB 2760—2014）的規(guī)定，梔子黃在醬油中的最大使用限量為1.5 g·kg-1，但長期食用梔子黃超標(biāo)的醬油會對人體的肝臟和腎臟等造成危害[2]，因此需要對醬油中梔子黃含量進(jìn)行檢測。

梔子黃的主要表征成分為藏花素與藏花酸。根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中梔子黃的測定》

（GB 5009.149—2016），當(dāng)醬油稱樣量為1.0 g時，藏花素的方法檢出限為50 mg·kg-1，藏花酸的方法檢出限為10.0 mg·kg-1，檢出限較高。本研究優(yōu)化檢測方法，旨在降低方法的檢出限，為醬油中梔子黃的監(jiān)測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藏花素（編號：SHAM-98138；標(biāo)準(zhǔn)值：98.5%）、

藏花酸（編號：SHAM-131602；標(biāo)準(zhǔn)值：99.5%），均購自北方偉業(yè)計量集團(tuán)有限公司；甲醇：色譜純，上海麥克林試劑官網(wǎng)有限公司；亞鐵氰化鉀

（106 g·L-1）、乙酸鉛（220 g·L-1），分析純，廣州化學(xué)試劑廠有限公司；醬油（海天味道極鮮特級醬油，批次：20240531），廣東海天集團(tuán)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

安捷倫1260液相色譜儀；萬分之一電子天平（感量為0.1 mg）。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件

二極管陣列檢測器；賽默飛Hypersil BDS C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱箱溫度：35 ℃；流速：1 mL·min-1；檢測波長：435 nm；流動相：甲醇-乙酸水溶液，梯度洗脫，洗脫程序見表1。

1.3.2 溶液配制

（1）藏花素與藏花酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。分別稱取標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g于同100 mL棕色容量瓶中，加甲醇稀釋成濃度為100 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

（2）混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液配制。分別準(zhǔn)確量取一定量的上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，配制成0.11 μg·mL-1、0.21 μg·mL-1、0.43 μg·mL-1、0.85 μg·mL-1和1.06 μg·mL-1的藏花素標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，以及0.11 μg·mL-1、0.22 μg·mL-1、0.45 μg·mL-1、0.89 μg·mL-1和1.11 μg·mL-1的藏花酸標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

1.3.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取醬油樣品2 g于10 mL比色管中，分別加入2 mL亞鐵氰化鉀（106 g·L-1）與乙酸鉛

（220 g·L-1），用一級水定容，離心取上清液1 mL于10 mL比色管中，甲醇溶解并定容，有機(jī)濾膜過濾，上機(jī)待測。

1.3.4 目標(biāo)物含量計算

樣品中目標(biāo)物含量計算公式為

（1）

式中：W為樣品中目標(biāo)物含量，mg·kg-1；c為通過工作曲線計算得到的濃度，μg·mL-1；v為樣品首次定容體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

藏花素與藏花酸為脂溶性物質(zhì)，因此試驗考察甲醇、乙腈、異丙醇及正己烷作為提取溶劑時的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藏花酸在正己烷中的溶解情況不理想，而甲醇、乙腈、異丙醇均能溶解這兩種目標(biāo)物，考慮到這3種溶劑中甲醇價格最為便宜，因此試驗選擇甲醇作為提取劑。

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)可知，醬油中含有蛋白質(zhì)與氨基酸[3]，因此本試驗加入2 mL蛋白質(zhì)沉淀劑（106 g·L-1亞鐵氰化鉀與220 g·L-1乙酸鉛）進(jìn)行凈化，以期在提取前盡量除去干擾物質(zhì)。

2.2 檢測波長的選擇

分別取1 mL藏花素與藏花酸的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)藏花素吸收波長在430～460 nm，445 nm處響應(yīng)值最高；藏花酸的吸收波長在410～450 nm，435 nm處響應(yīng)值最高。為了方便計算與查看色譜圖，同時滿足藏花酸的靈敏度要求，本試驗選擇的檢測波長為435 nm。

2.3 色譜柱的選擇

考察了Hypersil BDS C18色譜柱、Hypersil APS-2

色譜柱、Hypersil GOLD C8色譜柱（規(guī)格均為3 0 m×

0.25 mm，0.25 μm）對分離效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用Hypersil APS-2色譜柱分離目標(biāo)物時，目標(biāo)物無響應(yīng)；使用Hypersil BDS C18和Hypersil GOLD C8色譜柱測試時，2種目標(biāo)物均有響應(yīng)，但Hypersil BDS C18的響應(yīng)更高，分離度更好。因此，本試驗選用Hypersil BDS C18色譜柱作為分離柱。

2.4 方法學(xué)驗證結(jié)果

2.4.1 目標(biāo)物檢測

取適量混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液與加標(biāo)樣品溶液，按1.3.1項色譜條件測定，結(jié)果見圖1。分析可知，該分析方法能有效分離目標(biāo)物與干擾物質(zhì)，且峰形良好。

2.4.2 線性關(guān)系

按1.3.1項色譜條件，對藏花素與藏花酸混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液進(jìn)行測定，以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，以系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[4]，所得線性方程即相關(guān)系數(shù)見表2。分析可知，兩種目標(biāo)物質(zhì)在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.999。

表2 線性方程及相關(guān)系數(shù)

項目名稱 線性方程 相關(guān)系數(shù)（R2）

藏花素 A=1.432 9C-0.239 1 0.999 7

藏花酸 A=1.302 1C-0.132 9 0.999 8

2.4.3 靈敏度試驗

稱取2 g（準(zhǔn)確至0.01 g）樣品，準(zhǔn)確加入0.1 mL

濃度約為100 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.3項樣品前處理方法進(jìn)行處理后，逐級稀釋上機(jī)測試。以信噪比≥3確定藏花素和藏花酸的檢出限[5]。結(jié)果表明，藏花素和藏花酸的方法檢出限分別為

2.13 mg·kg-1、5.57 mg·kg-1，比GB 2760—2014中規(guī)定的方法檢出限更為理想。

2.4.4 重現(xiàn)性試驗

取濃度約為1.0 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液

1 μL，平行測定6次，計算目標(biāo)物峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3。藏花素與藏花酸的峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.06%、0.12%，說明試驗重現(xiàn)性較好，無明顯偏差。

2.4.5 加標(biāo)回收率試驗

精確稱取不含有目標(biāo)物的樣品約2 g，共3份，分別加入0.01 mL、0.02 mL、0.10 mL濃度約為

100 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3.3項樣品前處理方法處理后，按1.3.1項色譜條件測試，計算藏花素與藏花酸的回收率，結(jié)果見表4。可以看出，目標(biāo)物回收率在90.52%～103.03%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.5%～4.5%，說明該方法檢測結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

3 結(jié)論

本試驗建立了液相色譜法測定醬油中梔子黃含量的方法，該方法能很好地分離梔子黃的表征成分（藏花素與藏花酸），藏花素與藏花酸的加標(biāo)回收率在90.52%～103.03%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.5%～4.5%，藏花素、藏花酸對應(yīng)的方法檢出限分別為2.13 mg·kg-1與5.57 mg·kg-1。這說明本方法穩(wěn)定性好、檢測靈敏度高，適合醬油中梔子黃含量的測定。

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