擬南芥細胞膜質子泵對硝酸鹽吸收利用的影響

摘要： 【目的】硝態氮（NO3?-N） 是多數植物吸收利用的主要氮素形態之一，NO3?-N 的跨膜運輸需要耦合質子共轉運，質子運轉需要細胞膜上的質子泵提供質子驅動力。本研究通過分析擬南芥細胞膜質子泵AHA1 和AHA2對硝態氮吸收的信號網絡，以明確硝態氮吸收過程中的分子調控機制。【方法】以野生型Col-0、質子泵基因突變體aha1-9、aha2-5 以及恢復系AHA1/aha1-9、AHA2/aha2-5 為試驗材料，在不同NO3?-N 濃度（1、10 和20mmol/L） 培養基上培養10 天，觀察其表型，記錄根系生長以及生物量變化，測定根系細胞膜質子泵蛋白及其磷酸化水平變化，檢測根系中參與NO3?-N 響應與轉運相關基因（NRT1.1、NRT2.1、NRT2.2、NRT2.4 和NLP7） 和生長素響應與轉運相關基因（ARF11、IAA6、PIN7 和SAUR57） 的相對表達量。【結果】20 mmol/L NO3?-N 處理下各材料之間的生長無顯著差異。在1 和10 mmol/L NO3?-N 條件下，與野生型相比，aha1-9 和aha2-5 的主根長度、側根數量、根部和地上部生物量均顯著降低。1 mmol/L NO3?-N 時，aha1-9 的上述指標與野生型的差異顯著大于aha2-5。恢復系AHA1/aha1-9、AHA2/aha2-5 在各個NO3?-N 供應水平下均與野生型差異不顯著。通過分離根系細胞膜發現，在1、10 mmol/L NO3?-N 條件下，相比野生型，aha1-9 和aha2-5 的細胞膜質子泵蛋白水平分別降低了68%、19% 和36%、53%，質子泵蛋白磷酸化水平分別降低了83%、43% 和16%、42%；在20 mmol/L NO3?-N 條件下，aha1-9 和aha2-5 的質子泵蛋白水平與野生型差異不顯著，但磷酸化水平顯著降低。通過RT-qPCR 測定發現，在1 mmol/L NO3?-N 條件下，aha1-9、aha2-5 根系中的NRT1.1、NRT2.1、NRT2.2、NLP7 表達量相比野生型顯著下調，10 和20 mmol/L NO3?-N 條件下均沒有顯著差異。此外，在1 和10 mmol/LNO3?-N 條件下aha1-9、aha2-5 中的ARF11、IAA6、PIN7 和SAUR57 表達量顯著上調，然而在20 mmol/L NO3?-N條件下其表達量沒有顯著差異。【結論】低氮條件下，敲除細胞膜質子泵基因不僅降低其自身蛋白的合成和磷酸化水平，同時也影響硝酸鹽轉運蛋白基因和生長素相關基因的表達，進而抑制植物的生長。

關鍵詞： 擬南芥； 硝酸鹽； 細胞膜質子泵； AHA1； AHA2

氮（N） 是植物生長必需的營養元素，它參與氨基酸、核酸和許多代謝物的合成，對植物生長發育和新陳代謝至關重要[1]。自然條件下，植物以吸收土壤中的無機氮為主，其中無機氮主要有兩種形態：硝態氮（NO3?-N） 和銨態氮（NH4+-N）。多數植物主要以吸收NO3?-N 為主[2]，根系細胞中的NO3?經過硝酸還原酶和亞硝酸還原酶迅速還原為NH4+，然后通過谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS） 和谷氨酸合成酶（glutamate synthase，GOGAT） 途徑同化成氨基酸[3]。為適應土壤中氮素濃度的變化，植物根系進化出了高親和硝酸鹽轉運系統（high-affinity nitratetransport system，HATS） 與低親和硝酸鹽轉運系統（low-affinity nitrate transport system，LATS），前者主要在lt;1 mmol/L NO3?低濃度溶液中發揮作用，后者在gt;1 mmol/L NO3?時起作用[4]。在擬南芥中，參與硝酸鹽吸收的轉運蛋白主要包括兩大類：NRT1 （nitratetransporter 1） 和NRT2 （nitrate transporter 2）[5]。其基因組中有60 個基因編碼NRT 蛋白，包括53 個NRT1家族基因和7 個NRT2 家族基因，其中NRT1.1、NRT2.1、NRT2.2 和NRT2.4 在NO3?-N 吸收中發揮主要作用[6]。NRT1.1 主要定位于根表皮、皮層和內皮層細胞質膜上，對NO3?-N 吸收表現出雙親和性，外界環境中硝酸鹽濃度和蛋白第101 位點的蘇氨酸磷酸化狀態決定了NRT1.1 具有低親和或高親和的功能[7?8]。NRT1.1 的表達受到生長素等植物激素的調控，研究表明生長素IAA 增強了NRT1.1 表達，促進硝酸鹽的吸收[9]。NRT2.1、NRT2.2、NRT2.4 均為高親和硝酸鹽轉運蛋白，分布于根表皮或皮層細胞質膜，其表達受到硝酸鹽的誘導[4， 10?12]。NO3?-N 除了作為礦質元素外，它還是一種重要的信號分子，可以誘導許多參與NO3?-N 吸收、代謝等途徑基因的表達[13]。研究發現，轉錄因子NLP7 可作為硝態氮的受體，感受外界環境中硝酸鹽濃度，進而激活下游NRT2.1、NRT2.2 和硝酸鹽還原相關基因NIR 和NIA1 等的表達[14]。

盡管硝酸鹽的吸收和運輸由硝酸鹽轉運蛋白負責，但是作為陰離子，其跨膜運輸過程是一種需要質子協同的主動運輸[15?18]，由于氮素是作物吸收最多的一種礦質營養，因此維持其吸收需要大量的質子驅動力。但是硝酸鹽吸收與質子泵相互之間的作用關系在分子生物學水平上還未得到充分的驗證。

植物細胞膜質子泵（plasma membrane H+-ATPase，PMA） 是一類利用水解ATP 產生能量，將細胞質中的H+逆濃度泵出細胞的運輸蛋白。PMA 不僅參與維持細胞內pH 穩態、細胞伸長生長、礦質營養元素的吸收與轉運、氣孔運動等生理過程[19?24]，而且在植物逆境響應中也發揮重要作用，如鹽、低溫、干旱、鋁毒等[25?29]。PMA 是一個由多基因家族編碼的蛋白質，在擬南芥中有11 個基因：AHA1～AHA11[30]。不同AHA 基因的表達具有一定的組織特異性和功能特殊性。在擬南芥中，AHA1 和AHA2 的表達量較高，且在各組織器官中廣泛表達，參與氣孔運動、根系生長、下胚軸伸長、逆境響應等過程[31?32]；AHA4 主要在根系皮層中表達，參與調節植物的耐鹽性[ 3 3 ]；AHA10 定位于液泡膜，在正在發育的種子中有較高表達，參與種皮內皮中原花青素的形成[34]；AHA3 調節花粉發育[33?35]；AHA6、AHA8 和AHA9 與花粉管生長密切相關[20]。據報道，PMA 也參與調控養分缺乏導致的根系構型的改變。AHA2 在根系中受硝態氮誘導表達，aha2 突變體在不同硝態氮水平條件下主根和側根的長度均顯著降低[36]。也有報道表明，AHA2和AHA7 在根表皮細胞中表達占優勢，AHA2 驅動細胞擴張而調節根系生長，但AHA2 和AHA7 負向調節根毛的伸長[37]。低磷條件下，擬南芥AHA2 和AHA7 在根系的表達上調，分別調節主根和根毛的生長[38]。但是有關PMA 調控養分脅迫造成的根系構型改變的具體機制并不明確。

有研究認為，植物激素可通過影響PMA 進而調節根系構型。例如，外源茉莉酸甲酯誘導萵苣幼苗根毛形成的過程與PMA 活性增強引起的根際酸化有關[39]。研究發現，生長素通過胞內TIR1/AFB 信號途徑引起H+內流而使質外體堿化，而外源添加生長素可以引起AHA2 倒數第二個氨基酸殘基（蘇氨酸） 的磷酸化修飾[40]。PMA 的C-末端自抑制域發生磷酸化或去磷酸化可以改變其活性[41?42]。當C-末端倒數第二個殘基（蘇氨酸） 發生磷酸化后與14-3-3 蛋白結合，PMA 活性隨即被激活[43?46]。生長素響應蛋白SAUR9和SAUR19 能夠與磷酸酶PP2C.D 相互作用，通過抑制PP2C.D 活性，使質子泵C-末端倒數第二個蘇氨酸殘基去磷酸化，抑制PMA 活性[47?50]。但是有關硝酸鹽供應是否也會影響PMA 在蛋白水平上發生磷酸化修飾，進而影響質子泵活性和根系生長，則還不清楚。

在本研究中，以擬南芥野生型Col-0 和突變體aha1-9、aha2-5 以及恢復系AHA1/aha1-9、AHA2/aha2-5 作為研究對象，通過不同濃度硝態氮處理，觀察其生長表型，分析PMA 蛋白水平和磷酸化水平變化，以及對硝酸鹽吸收和生長素相關的基因在轉錄水平的影響，探究AHA1 和AHA2 與根系吸收NO3?-N 之間可能的相互調控關系和機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

擬南芥野生型C o l - 0 （ W T ），突變體a h a 1 - 9（At2g18960： SAIL_1285_D12）、aha2-5 （AT4G30190：SALK_022010），AHA1/aha1-9、AHA2/aha2-5。

1.2 試驗設計

取適量擬南芥種子裝入1.5 mL EP 管中，加入1 mL 次氯酸鈉消毒液進行表面消毒，10 min 后用無菌水清洗干凈。將滅菌后的種子點在1/2 MS 培養基上，4℃ 春化2 天后放入光照培養箱培養，3 天后挑選長勢一致的幼苗分別移至1、10、20 mmol/L NO3?-N培養基上繼續生長10 天。光照培養箱的培養條件為：光照強度為100 μmol/（m2·s），溫度為22℃，相對濕度為70%，光照時長為16 h 光照/8 h 黑暗。

對擬南芥野生型Col-0，突變體aha1-9、aha2-5、AHA/1aha1-9、AHA2/aha2-5 進行1、10、20 mmol/LNO3?-N 處理，觀察生長表型，分析質子泵蛋白和磷酸化水平變化，檢測相關調控基因的表達。

1.3 試驗方法

1.3.1 植株生長指標的測定

WT、aha1-9 和aha2-5 以及AHA/1aha1-9 和AHA2/aha2-5 分別在1、10、20 mmol/L NO3?-N 培養基垂直培養10 天后，選取一定數量長勢相近的植株，分別測量其主根長度和側根數量，并對地上和地下部分稱取鮮重。

1.3.2 實時熒光定量PCR

用MagZolTM Reagent（Trizol reagent） 試劑盒（廣州美基生物科技有限公司） 提取根系總RNA，利用HiScript III 1st StrandcDNA Synthesis Kit （+gDNA wiper） （諾唯贊公司） 反轉錄成cDNA，使用ChamQ Universal SYBR qPCRMaster Mix （諾唯贊公司） 進行熒光定量PCR。引物信息見表1。

1.3.3 細胞膜質子泵蛋白的提取及蛋白和磷酸化水平檢測

WT 和aha1-9、aha2-5 分別在1、10、20mmol/L NO3? -N 培養基上生長10 天后，參照Zhu等[51]的方法提取根系細胞膜蛋白，并用BCA 試劑盒測定蛋白含量。取相同含量的膜蛋白進行Westernblot，分別用Anti-H+-ATPase 和Anti-pThr 抗體（由名古屋大學木下俊則教授惠贈） 檢測細胞膜質子泵蛋白量和磷酸化水平變化，同時以Actin 作為內參蛋白，內參蛋白抗體（Sigma-Aldrich， St. Louis， MO， USA，Cat#057M4548） 稀釋3000 倍，并用ImageJ 進行灰度統計。

1.4 數據處理

本試驗數據均采用Excel 2019 和SPSS 17.0 進行數據統計處理和單因素方差分析，結果采用沃勒–鄧肯法比較不同處理平均值之間差異的顯著性，運用GraphPad Prism 8 進行圖表制作。

2 結果與分析

2.1 AHA1/2 的缺失抑制低氮下植物的生長

WT 和a h a 1 - 9、a h a 2 - 5 分別在含有1、1 0、20 mmol/L NO3?-N 的培養基上生長10 天，觀察其表型，發現在20 mmol/L NO3?-N 培養條件下，突變體和WT 之間表型差異不顯著，其地上部和地下部生物量，包括主根長和側根數量均沒有明顯差異（圖1A～E）。但是在10 mmol/L NO3?-N 條件下，相比于WT，兩個突變體開始都表現出根系生長受抑制，地上部與根系生物量顯著降低，側根數顯著減少（圖1A～E，Plt;0.05）。隨著外源硝酸鹽濃度的降低，在1 mmol/L NO3?-N 條件下，aha1-9 與aha2-5的地上部和根系生長受抑制更為嚴重，且aha1-9 的受抑制程度尤為顯著。具體來看，在1 mmol/L NO3?-N下，與WT 相比，aha1-9 和aha2-5 的地上部鮮重分別降低了55% 和27% （圖1 B，Plt;0.01），根系鮮重分別降低了55% 和31% （圖1C，Plt;0.01），主根長度分別縮短了38% 和11% （圖1D，Plt;0.01），側根數分別減少了55% 和33% （圖1E，Plt;0.01）。上述結果說明，在NO3?低于20 mmol/L 情況下，質子泵基因突變導致地上部與地下部的生長受到顯著抑制。但在高濃度NO3?供應下，這種抑制情況又會得到解除。

本研究進一步對恢復系AHA1/aha1-9 和AHA2/aha2-5 進行不同濃度NO3?-N 處理，發現不論在何種NO3?-N 濃度下，恢復系植株的生長均與野生型無異（圖2）。以上結果說明，在1 和10 mmol/L NO3?-N 條件下，AHA1 或AHA2 的突變都會抑制植株生物量和根系生長，在1 mmol/L NO3?-N 條件下，AHA1 突變引起的生長抑制作用顯著大于AHA2。

2.2 不同硝態氮濃度下AHA1/2 基因突變對細胞膜質子泵蛋白和磷酸化水平的影響

分別提取上述不同濃度NO3?-N 下WT 和aha1-9、aha2-5 的根系膜蛋白，用Anti-H+ -ATPase 和Anti-pThr 抗體通過western blot 方法分別檢測其質子泵蛋白量和磷酸化的變化情況。如圖3 所示，在20 mmol/L NO3?-N 下，aha1-9 和aha2-5 的Anti-H+-ATPase 條帶與WT 差異不大，但Anti-pThr 條帶有所減弱，說明磷酸化水平降低；在1、10 mmol/LNO3?-N 條件下，aha1-9、aha2-5 的Anti-H+-ATPase和Anti-pThr 條帶均比WT 弱，表明低氮條件下AHA1 或AHA2 的缺失抑制質子泵蛋白的合成和磷酸化修飾。尤其在1 mmol/L NO3?-N 的條件下，aha1-9 的條帶灰度達到最低（圖3A），從灰度統計可看出，aha1-9 的相對磷酸化水平和相對蛋白水平比WT 分別降低了83% 和68% （圖3B 和C，Plt;0.01）。這些結果表明，在1 和10 mmol/L NO3?-N 條件下，AHA1 或AHA2 的突變都會降低植株質子泵蛋白量和磷酸化水平，在1 mmol/L NO3?-N 條件下，AHA1 突變的影響顯著大于AHA2。

2.3 AHA1 和AHA2 在低氮下調節NO3?-N 和生長素轉運相關基因的表達

2.3.1 硝酸鹽轉運蛋白基因

圖3 顯示，aha1-9、aha2-5 的質子泵活性和磷酸化水平在低NO3?-N 條件下被抑制。因此，我們首先分析了硝酸鹽轉運相關基因的轉錄情況。如圖4A～D 所示，1 mmol/LNO3?-N 條件下，與WT 相比，突變體aha1-9、aha2-5的NRT1.1、NRT2.1、NRT2.2 表達量顯著下調，且NRT2.2 下調倍數最大，分別下調了2.67、1.98 倍（Plt;0.01）。10 和20 mmol/L NO3?-N 條件下，與WT比較，突變體aha1-9、aha2-5 的NRT1.1、NRT2.1、NRT2.2、NRT2.4 表達量與WT 差異不顯著。另外，NLP7 作為植物硝酸鹽信號的“開關”，能夠感受外界硝酸鹽濃度的變化并將信號轉至細胞內，調節對NO3?-N 的吸收利用。圖4E 顯示，在1 mmol/L NO3?-N的條件下，與WT 比較，突變體aha1-9、aha2-5 的NLP7 的表達量顯著下調，分別下調了2.52、1.74 倍（Plt;0.01）。綜上所述，AHA1 或AHA2 的缺失顯著降低了擬南芥NRT1.1、NRT2.1、NRT2.2、NLP7 對低氮的響應，從而抑制了NO3?-N 的吸收，導致植物生長受阻。

2.3.2 生長素相關基因

由于AHA1 和AHA2 的突變在低NO3?-N 下明顯抑制了根的生長，所以我們進一步分析了生長素運輸的相關基因ARF11、IAA6、PIN7 和生長素響應基因SAUR57 的轉錄情況（圖5）。結果表明，與WT 相比，1 和10 mmol/L NO3?-N 的條件下，aha1-9 和aha2-5 中ARF11、IAA6、PIN7、SAUR57 相對表達量均顯著上調，1 mmol/L NO3?-N條件下aha1-9 和aha2-5 分別上調了9.7、3.0、4.2、25.3 倍和17.9、6.0、7.0、31.1 倍（Plt;0.01）；10mmol/L NO3?-N 的條件下aha1-9 和aha2-5 分別上調了4.2、2.3、3.3、15.4 倍和7.1、3.6、4.8、24.1 倍（Plt;0.01）；在20 mmol/L NO3? -N 的條件下，aha1-9 和aha2-5 突變體與WT 差異不顯著（圖5A～D）。

3 討論

旱地土壤中由于存在硝化作用，植物吸收的氮形態主要以NO3?-N 為主，然而土壤膠體帶負電，NO3?-N 容易被淋溶損失，造成氮素利用率降低，因此研究植物對NO3?-N 的吸收利用具有重要意義。植物根系細胞吸收土壤中的NO3?主要依賴于NO3?/H+同向轉運蛋白NRT，這一過程需要細胞膜質子泵提供質子驅動力將NO3?運輸進入細胞內。也有報道表明，外源添加細胞膜質子泵活性促進劑香豆素能夠顯著促進玉米對NO3?-N 的吸收。此外，在水稻缺氮條件下，NO3?-N 誘導根系細胞膜質子泵基因OSA2、OSA7 等表達，然而其中具體的分子調控機制并不清楚，因此研究細胞膜質子泵活性對NO3?-N 吸收利用的調控機制具有重要意義。

我們通過對擬南芥野生型、突變體a h a 1 - 9、aha2-5 進行了不同濃度NO3?-N （1、10、20 mmol/L）的培養后發現，在1 和10 mmol/L NO3?-N 的條件下，與野生型比，aha1-9 和aha2-5 的生物量顯著降低，且其主根長度和側根數量也顯著下降，在1 mmol/LNO3? -N 條件下，aha1-9 的受抑制程度要顯著大于aha2-5 （圖1）。恢復系AHA1/aha1-9 和AHA2/aha2-5 在各個氮水平處理下，與野生型差異不顯著，能夠恢復正常生長（圖2）。說明在低氮條件下，AHA1 和AHA2 能夠影響根系細胞膜質子泵活性，對硝態氮吸收利用具有重要作用，尤其是AHA1 影響更顯著，然而在20 mmol/L NO3?-N 條件下可能由于植物處于氮素飽和狀態，NO3?-N 響應基因和生長素相關基因不受誘導，從而不能夠激活下游細胞膜質子泵，因此，在該濃度下，敲除細胞膜質子泵AHA1和AHA2 基因對NO3?吸收不影響，當然具體信號傳遞路徑需要進一步驗證。M?odzińska 等[36]報道表明，擬南芥根系中AHA2 在根系受硝態氮誘導表達，aha2敲除的突變體在不同硝態氮水平條件下主根和側根的長度均顯著降低。另外，擬南芥AHA2 和AHA7也能通過改變細胞膜質子泵活性，將細胞壁酸化調節根系生長，但AHA2 和AHA7 負向調節根毛的伸長[37]。擬南芥AHA2 和AHA7 也容易受低磷誘導表達，并分別調節主根和根毛的生長[ 4 0 ]。在局部NH4+供應下，AHA2 基因敲除能夠降低三級側根密度以及二級和三級側根長度[52]。此外，Sperandio 等[53]通過氮饑餓處理，再供應NO3?-N 可以顯著誘導根系細胞膜質子泵OsA2、OsA7 和OsA8 基因的表達；同時在低氮條件下，OsA2 基因表達下調會顯著降低植物體內的氮含量。也有報道表明NO3?-N 能夠誘導玉米（MHA3 和MHA4） 和葡萄（VvHA2 和VvHA4） 細胞膜質子泵轉錄水平的提高來促進NO3?-N 吸收[54]。然而，免疫印跡試驗結果表明，在1 和10 mmol/LNO3?-N 的條件下，與野生型比，aha1-9和aha2-5 的細胞膜質子泵蛋白水平和磷酸化水平都顯著降低（圖3），說明在低氮條件下，細胞膜質子泵能夠通過蛋白水平和磷酸化水平變化來調節其活性，從而保證NO3?-N 吸收利用，當AHA1 或AHA2的功能缺失導致NO3? -N 吸收受到影響，從而導致aha1-9 和aha2-5 的細胞膜質子泵蛋白水平和磷酸化水平都顯著降低。此外通過分析擬南芥根系中氮信號通路中相關基因的表達，AHA1 或AHA2 的功能缺失導致低NO3?-N 下根系NRT1.1、NRT2.1、NRT2.2和NLP7 的表達量顯著降低（圖4A～C 和E）。NLP7 在擬南芥硝酸鹽信號轉導中是一個主要的硝酸鹽信號感受器和上游核心轉錄調節因子，并參與初級硝酸鹽反應[55]。在1 mmol/L NO3? -N 條件下，aha1-9 和aha2-5 中NLP7 的表達水平顯著低于野生型，限制了下游高親和轉運蛋白基因NRT2.1、NRT2.2 的表達，導致擬南芥生長受到抑制。

最近的研究表明，生長素通過胞內TIR1/AFB 信號途徑引起H+內流而使質外體堿化，從而抑制根系生長[41]。外源添加生長素可以通過TMK1 將AHA2蛋白C 末端的蘇氨酸磷酸化，從而激活質子泵活性，使質外體堿化，這個過程與胞內生長素信號引起的質外體堿化相互拮抗[40]。也有報道表明細胞膜質子泵存在多個氨基酸位點受到磷酸化修飾的調控[40， 56]。磷酸酶PP2C.D 和生長素響應蛋白SAUR 是調控細胞膜質子泵磷酸化的一個關鍵成分，SAUR9和SAUR19 能夠與PP2C.D 相互作用，通過抑制PP2C.D 活性，使質子泵C-末端倒數第二個殘基蘇氨酸去磷酸化[47?49， 51]。我們的免疫印跡試驗結果及生長素相關基因表達分析結果表明，在1 和10 mmol/LNO3?-N 的條件下，與野生型比，aha1-9 和aha2-5 的細胞膜質子泵磷酸化水平顯著降低，可能是由于生長素調節的相關基因IAA6 和SAUR57 等上調（圖5），導致細胞膜質子泵去磷酸化，活性下降（圖3）。當然，這部分工作需要進一步通過蛋白互作來驗證。同時，Yang 等[57]的研究也表明，生長素可通過上調ARF11、IAA6、PIN7 和SAUR57 等生長素調節相關基因表達來抑制主根的伸長。此外，Miao 等[58]研究表明，干旱條件下，根系合成低濃度ABA 能夠通過與受體PYL8 結合，抑制PP2Cs 磷酸酶活性，細胞膜質子泵去磷酸化，提高細胞膜質子泵活性，促進主根的伸長來適應水分脅迫條件[59]；而高濃度ABA，可減少擬南芥胞外H+擠出，抑制根生長，Hayashi 等[21]報道，施用20 μmol/L ABA 可誘導AHA中Thr947 的去磷酸化，并以abi1 依賴的方式抑制下胚軸伸長。因此，在1 和10 mmol/L NO3? -N 條件下，植物可通過細胞膜質子泵磷酸化，提高細胞膜質子泵活性，促進根系氮素吸收和主根的伸長，而敲除細胞膜質子泵基因能夠誘導生長素相關基因表達促進生長素合成，進而抑制根系的生長。

4 結論

本研究結果表明，在低氮條件下，細胞膜質子泵基因敲除不僅影響其自身蛋白的合成和磷酸化水平，而且也影響硝酸鹽轉運相關基因NRT1.1、NRT2.1、NRT2.2 和NLP7 的表達，導致氮素的吸收受到影響。同時，敲除質子泵基因能夠誘導生長素相關基因ARF11、IAA6、PIN7 和SAUR57 的表達，促進生長素合成，從而導致植物生長受到抑制。但在高氮水平下，雖然突變體中質子泵磷酸化水平下降，但未影響硝酸鹽和生長素響應與轉運相關基因的表達，植物保持正常生長。

細胞膜質子泵與硝態氮吸收轉運存在耦合關系，這種關系受外界硝態氮供應水平的影響，尤其是在低氮條件下，硝酸鹽吸收不僅依賴于硝酸鹽轉運蛋白，也依賴于質子泵提供的質子驅動力。在外界硝態氮濃度非常高的情況下，硝酸鹽也可以通過細胞膜內外的濃度梯度差進入細胞，但是這種情況實際土壤中幾乎不存在。因此，提高作物本身的質子泵活性仍然是促進硝態氮吸收的一個決定性因素。

參 考 文 獻：

[ 1 ]de Bang T C， Husted S， Laursen K H， et al. The molecularphysiologicalfunctions of mineral macronutrients and theirconsequences for deficiency symptoms in plants[J]. New Phytologist，2021， 229（5）： 2446?2469.

[ 2 ]Xu G， Fan X， Miller A J. Plant nitrogen assimilation and useefficiency[J]. Annual Review of Plant Biology， 2012， 63： 153?182.

[ 3 ]徐曉鵬， 傅向東， 廖紅. 植物銨態氮同化及其調控機制的研究進展[J]. 植物學報， 2016， 51（2）： 152?166.

Xu X P， Fu X D， Liao H. Advances in study of ammoniumassimilation and its regulatory mechanism in plants[J]. ChineseBulletin of Botany， 2016， 51（2）： 152?166.

[ 4 ]Wang Y Y， Hsu P K， Tsay Y F. Uptake， allocation and signaling ofnitrate[J]. Trends in Plant Science， 2012， 17（8）： 458?467.

[ 5 ] 宋田麗， 周建建， 徐晨曦， 等. 植物硝酸鹽轉運蛋白功能及表達調控研究進展[J]. 上海師范大學學報（自然科學版）， 2017， 46（5）： 740?750.

Song T L， Zhou J J， Xu C X， et al. Progress in function and regulationof nitrate transporters in plants[J]. Journal of Shanghai NormalUniversity （Natural Sciences）， 2017， 46（5）： 740?750.

[ 6 ]張曦， 林金星， 單曉昳. 擬南芥無機氮素轉運蛋白及其磷酸化調控機制研究進展[J]. 植物學報， 2016， 51（1）： 120?129.

Zhang X， Lin J X， Shan X Y. Progress in inorganic nitrogen transportproteins and their phosphorylation regulatory mechanism inArabidopsis[J]. Chinese Bulletin of Botany， 2016， 51（1）： 120?129.

[ 7 ]Liu K H， Tsay Y F. Switching between the two action modes of thedual-affinitynitrate transporter CHL1 by phosphorylation[J]. TheEMBO Journal， 2003， 22（5）： 1005?1013.

[ 8 ]Martín Y， Navarro F J， Siverio J M. Functional characterization of theArabidopsis thaliana nitrate transporter CHL1 in the yeast Hansenulapolymorpha[J]. Plant Molecular Biology， 2008， 68（3）： 215?224.

[ 9 ]尹偉倫， 鄭冬超， 夏新莉. 生長素促進擬南芥AtNRT1.1基因表達增強硝酸鹽吸收[J]. 北京林業大學學報， 2013， 35（2）： 80?85.

Yin W L， Zheng D C， Xia X L. Auxin promotes nitrate uptake by upregulatingAtNRT1.1 gene transcript level in Arobidopsis thaliana[J].Journal of Beijing Forestry University， 2013， 35（2）： 80?85.

[10] Li W， Wang Y， Okamoto M， et al. Dissection of the AtNRT2.1：AtNRT2.2 inducible high-affinity nitrate transporter gene cluster[J].Plant Physiology， 2007， 143（1）： 425?433.

[11]Kiba T， Feria-Bourrellier A， Lafouge F， et al. The Arabidopsis nitratetransporter NRT2.4 plays a double role in roots and shoots of nitrogenstarvedplants[J]. The Plant Cell， 2012， 24（1）： 245?258.

[12]Okamoto M， Vidmar J J， Glass A D. Regulation of NRT1 and NRT2gene families of Arabidopsis thaliana： Responses to nitrate provision[J]. Plant and Cell Physiology， 2003， 44（3）： 304?317.

[13]O’Brien J A， Vega A， Bouguyon E， et al. Nitrate transport， sensing，and responses in plants[J]. Molecular Plant， 2016， 9（6）： 837?856.

[14]Liu K H， Liu M， Lin Z， et al. NIN-like protein 7 transcription factoris a plant nitrate sensor[J]. Science， 2022， 377： 1419?1425.

[15]McClure P R， Kochian L V， Spanswick R M， Shaff J E. Evidence forcotransport of nitrate and protons in maize roots： I. Effects of nitrateon the membrane potential[J]. Plant Physiology， 1990， 93（1）： 281?289.

[16]Glass A D M， Shaff J E， Kochian L V. Studies of the uptake of nitratein barley： IV. Electrophysiology[J]. Plant Physiology， 1992， 99（2）：456?463.

[17]Sperandio M V L， Santos L A， Tavares O C H， et al. Silencing theOryza sativa plasma membrane H+-ATPase isoform OsA2 affectsgrain yield and shoot growth and decreases nitrogen concentration[J].Journal of Plant Physiology， 2020， 251： 153220.

[18]Santi S， Locci G， Monte R， et al. Induction of nitrate uptake in maizeroots： Expression of a putative high-affinity nitrate transporter andplasma membrane H+-ATPase isoforms[J]. Journal of ExperimentalBotany， 2003， 54： 1851?1864.

[19]戴森煥， 吳海誠， 張茂星， 等. 細胞膜H+-ATPase酶在植物礦質營養中的作用[J]. 植物營養與肥料學報， 2022， 28（11）： 2118?2129.

Dai S H， Wu H C， Zhang M X， et al. Roles of plasma membrane H+-ATPases in plant mineral nutrition[J]. Journal of Plant Nutrition andFertilizers， 2022， 28（11）： 2118?2129.

[20]Hoffmann R D， Portes M T， Olsen L I， et al. Plasma membrane H+-ATPases sustain pollen tube growth and fertilization[J]. NatureCommunications， 2020， 11（1）： 2395.

[21]Hayashi Y， Takahashi K， Inoue S， Kinoshita T. Abscisic acidsuppresses hypocotyl elongation by dephosphorylating plasmamembrane H+-ATPase in Arabidopsis thaliana[J]. Plant CellPhysiology， 2014， 55（4）： 845?853.

[22]Takahashi K， Hayashi K， Kinoshita T. Auxin activates the plasmamembrane H+ -ATPase by phosphorylation during hypocotylelongation in Arabidopsis[J]. Plant Physiology， 2012， 159（2）：632?641.

[23]Verweij W， Spelt C， Di Sansebastiano G， et al. An H+ P-ATPase onthe tonoplast determines vacuolar pH and flower colour[J]. NatureCell Biology， 2008， 10（12）： 1456?1462.

[24]Gévaudant F， Duby G， von Stedingk E， et al. Expression of aconstitutively activated plasma membrane H+-ATPase alters plantdevelopment and increases salt tolerance[J]. Plant Physiology， 2007，144（4）： 1763?1776.

[25]Cao Y B， Zhang M， Liang X Y， et al. Natural variation of an EF-handCa2+-binding-protein coding gene confers saline-alkaline tolerance inmaize[J]. Nature Communications， 2020， 11（1）： 186.

[26]Merlot S， Leonhardt N， Fenzi F， et al. Constitutive activation of aplasma membrane H+-ATPase prevents abscisic acid-mediatedstomatal closure[J]. The EMBO Journal， 2007， 26（13）： 3216?3226.

[27]Marra M， Camoni L， Visconti S， et al. The surprising story offusicoccin： A wilt-inducing phytotoxin， a tool in plant physiologyand a 14-3-3-targeted drug[J]. Biomolecules， 2021， 11（9）： 1393.

[28]Ponce-Pineda I G， Carmona-Salazar L， Saucedo-García M， et al.MPK6 kinase regulates plasma membrane H+-ATPase activity in coldacclimation[J]. International Journal of Molecular Sciences， 2021，22（12）： 6338.

[29]Zhang J， Wei J， Li D， et al. The role of the plasma membrane H+-ATPase in plant responses to aluminum toxicity[J]. Frontiers in PlantScience， 2017， 8： 1757.

[30]Palmgern， M G. Plant plasma membrane H+-ATPase： Powerhousesfor nutrient uptake[J]. Annual Review of Plant Biology， 2001， 52（1）：817?845.

[31]Axelsen K B， Palmgren M G. Inventory of the superfamily of P-typeion pumps in Arabidopsis[J]. Plant Physiology， 2001， 126（2）：696?706.

[32]Li Y， Zeng H， Xu F， et al. H+-ATPases in plant growth and stressresponses[J]. Annual Review of Plant Biology， 2022， 73： 495?521.

[33]Vitart V， Baxter I， Doerner P， Harper J F. Evidence for a role ingrowth and salt resistance of a plasma membrane H+-ATPase in theroot endodermis[J]. Plant Journal， 2001， 27（3）： 191?201.

[34]Baxter I R， Young J C， Armstrong G， et al. A plasma membrane H+-ATPase is required for the formation of proanthocyanidins in the seedcoat endothelium of Arabidopsis thaliana[J]. Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America， 2005，102（7）： 2649?2654.

[35]Robertson W R， Clark K， Young J C， Sussman M R. An Arabidopsisthaliana plasma membrane proton pump is essential for pollendevelopment[J]. Genetics， 2004， 168（3）： 1677?1687.

[36]M?odzińska E， K?obus G， Christensen M D， Fuglsang A T. Theplasma membrane H+ -ATPase AHA2 contributes to the rootarchitecture in response to different nitrogen supply[J]. PhysiologiaPlantarum， 2015， 154（2）： 270?282.

[37]Hoffmann R D， Olsen L I， Ezike C V， et al. Roles of plasmamembrane proton ATPases AHA2 and AHA7 in normal growth ofroots and root hairs in Arabidopsis thaliana[J]. Physiologia Plantarum，2019， 166（3）： 848?861.

[38]Yuan W， Zhang D P， Song T， et al. Arabidopsis plasma membraneH+-ATPase genes AHA2 and AHA7 have distinct and overlappingroles in the modulation of root tip H+ efflux in response to lowphosphorusstress[J]. Journal of Experimental Botany， 2017， 68（7）：1731-1741.

[39]Li L， Verstraeten I， Roosjen M， et al. Cell surface and intracellularauxin signalling for H+ fluxes in root growth[J]. Nature， 2021， 599：273?277.

[40]Falhof J， Pedersen J T， Fuglsang A T， et al. Plasma membrane H+-ATPase regulation in the center of plant physiology[J]. MolecularPlant， 2016， 9（3）： 323?337.

[41]Palmgren M G， Larsson C， Sommarin M. Proteolytic activation ofthe plant plasma membrane H+-ATPase by removal of a terminal segment[J]. Journal of Biological Chemistry， 1990， 265（23）： 13423?13426.

[42]Kinoshita T， Shimazaki K. Blue light activates the plasma membraneH+-ATPase by phosphorylation of the C-terminus in stomatal guardcells[J]. The EMBO Journal， 1999， 18（20）： 5548?5558.

[43]Zhang M X， Wang Y， Chen X， et al. Plasma membrane H+-ATPaseoverexpression increases rice yield via simultaneous enhancement ofnutrient uptake and photosynthesis[J]. Nature Communications， 2021，12（1）： 735.

[44]Inoue S， Kinoshita T， Matsumoto M， et al. Blue light-inducedautophosphorylation of phototropin is a primary step for signaling[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America， 2008， 105（14）： 5626?5631.

[45]Okumura M， Inoue S， Kuwata K， Kinoshita T. Photosynthesisactivates plasma membrane H+-ATPase via sugar accumulation[J].Plant Physiology， 2016， 171（1）： 580?589.

[46]Ando E， Kinoshita T. Red light-induced phosphorylation of plasmamembrane H+-ATPase in stomatal guard cells[J]. Plant Physiology，2018， 178（2）： 838?849.

[47]Spartz A K， Ren H， Park M Y， et al. SAUR inhibition of PP2C-Dphosphatases activates plasma membrane H+-ATPases to promotecell expansion in Arabidopsis[J]. The Plant Cell， 2014， 26（5）：2129?2142.

[48]Ren H， Gray W M. SAUR proteins as effectors of hormonal andenvironmental signals in plant growth[J]. Molecular Plant， 2015，8（8）： 1153?1164.

[49]Ren H， Park M Y， Spartz A K， et al. A subset of plasma membranelocalizedPP2C. D phosphatases negatively regulate SAUR-mediatedcell expansion in Arabidopsis[J]. PLoS Genetics， 2018， 14（6）：e1007455.

[50]Ding M， Zhang M X， Zeng H， et al. Molecular basis of plasmamembrane H+-ATPase function and potential application in theagricultural production[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2021，168： 10?16.

[51]Zhu Y Y， Di T J， Xu G H， et al. Adaptation of plasma membrane H+-ATPase of rice roots to low pH as related to ammonium nutrition[J].Plant， Cell amp; Environment， 2009， 32（10）： 1428-1440.

[52]Biel A， Moser M， Meier I. A role for plant KASH proteins inregulating stomatal dynamics[J]. Plant Physiology， 2020， 182（2）：1100?1113.

[53]Sperandio M V L， Santos L A， Bucher C A， et al. Isoforms of plasmamembrane H+-ATPase in rice root and shoot are differentiallyinduced by starvation and resupply of NO3? or NH4+[J]. PlantScience， 2011， 180（2）： 251?258.

[54]Pii Y， Alessandrini M， Guardini K， et al. Induction of high-affinityNO3? uptake in grapevine roots is an active process correlated to theexpression of specific members of the NRT2 and plasma membraneH+-ATPase gene families[J]. Functional Plant Biology， 2014， 41（4）：353?365.

[55]Mu X， Luo J. Evolutionary analyses of NIN-like proteins in plantsand their roles in nitrate signaling[J]. Cellular and Molecular LifeSciences， 2019， 76（19）： 3753?3764.

[56]Spartz A K， Lor V S， Ren H， et al. Constitutive expression ofArabidopsis SMALL AUXIN UP RNA19 （SAUR19） in tomatoconfers auxin-independent hypocotyl elongation[J]. Plant Physiology，2017， 173（2）： 1453?1462.

[57]Yang L， You J， Li J Z， et al. Melatonin promotes Arabidopsisprimary root growth in an IAA-dependent manner[J]. Journal ofExperimental Botany， 2021， 72（15）： 5599?5611.

[58]Miao R， Yuan W， Wang Y， et al. Low ABA concentration promotesroot growth and hydrotropism through relief of ABA INSENSITIVE1-mediated inhibition of plasma membrane H+-ATPase 2[J]. ScienceAdvances， 2021， 7： eabd4113.

[59]Planes M D， Ni?oles R， Rubio L， et al. A mechanism of growthinhibition by abscisic acid in germinating seeds of Arabidopsisthaliana based on inhibition of plasma membrane H+-ATPase anddecreased cytosolic pH， K+， and anions[J]. Journal of ExperimentalBotany， 2015， 66（3）： 813?825.

基金項目：國家自然科學基金項目 （32102482，42107047）；廣東省基礎與應用基礎研究基金項目 （2019A1515110070）。