高原牧區不同害鼠胃腸內容物對D 型肉毒神經毒素的破壞強度分析

摘 要 為探明高原牧區不同害鼠胃腸內容物對D型肉毒毒素的破壞強度與害鼠對毒素的敏感性之間的關系，采用霍恩氏法測定了D型肉毒毒素對高原鼠兔（Ochotona cur?zoniae）、高原鼢鼠（Eospalax baileyi）及青海松田鼠（Neodon fuscus）的灌胃半數致死劑量（LD50），并測定3種害鼠胃腸內容物及其上清液與D型肉毒毒素作用后的毒素殘留量。結果表明：D 型肉毒毒素對高原鼠兔、高原鼢鼠及青海松田鼠的LD50 分別為5 110、5 840、50 100 MLD/kg。害鼠胃腸內容物對毒素的破壞強度由高到低依次是青海松田鼠、高原鼢鼠、高原鼠兔。3種害鼠胃腸內容物對D型肉毒毒素的破壞作用存在差異，且LD50與毒素殘留量之間呈正相關性。胃腸道環境差異是導致不同害鼠對D型肉毒毒素產生敏感性差異的原因之一，研究結果對今后選育高效、特異性D型肉毒毒素生物滅鼠劑具有指導意義。

關鍵詞：草地鼠害；D型肉毒毒素；腸內容物；破壞強度；青藏高原牧區

中圖分類號：S812. 6 文獻標識碼：A 文章編號：2310 - 1490（2024）- 02 - 0321 - 07

DOI：10.12375/ysdwxb.20240211

由D型肉毒梭菌（Clostridium botulinum）所產毒素研制成的D型肉毒滅鼠劑，在草地鼠害防治過程中通過害鼠自然采食后進入其胃腸道，進而通過肉毒毒素“四步”作用機制達到毒素中毒的效果。第一步，肉毒毒素與細胞表面受體特異結合；第二步，通過受體介導胞吞毒素內化，進入胞漿；第三步，毒素鏈選擇性切割胞內底物SNARE蛋白；最后，通過封閉乙酰膽堿的釋放［1］導致呼吸麻痹引起害鼠死亡。因此，分析毒素進入害鼠胃腸道，在腸上皮細胞吸收內化之前，胃腸內容物對D型肉毒毒素的破壞強度的差異，是分析D型肉毒毒素對不同害鼠敏感性差異產生的必不可少的環節之一。

生物因為所處的生態領域豐富多樣，自然環境的特殊性使得各種生物的食物結構組成各不相同，藥物作為一種外源性攝入的物質，在機體內將受到不同因素的影響，特別是口服藥物進入機體后，先后通過口腔、食道、胃腸道等消化器官，接觸到機體分泌的各種酶類物質，繼而發生物理、化學反應，這一生理過程勢必會影響藥物在不同生物體內的生物利用度，從而影響藥物在機體內的實際效果［2］。趙德華等［3］研究也證實食物可影響一部分小分子靶向藥物的生物利用度，應重視食物與小分子靶向藥物之間的相互作用，選擇合理的服藥時間，以避免增加藥物不良反應或降低藥物療效。

關于高寒草甸主要害鼠高原鼠兔（Ochotona cur?zoniae）、高原鼢鼠（Eospalax baileyi）的食性研究［4］結果顯示，高原鼠兔的食譜主要為禾草、莎草等單子葉植物及其種子，而高原鼢鼠由于常年生活在地底，俗稱“瞎老鼠”，該鼠種的食物主要由一些植物的發達軸根、根莖、球莖和塊根類物質組成。從幾種害鼠的采食特性可以看出其食物組成存在一定的差異。測定并分析不同害鼠胃腸內容物對D型肉毒毒素的破壞強度，對于補充分析害鼠對D型肉毒毒素敏感性差異，研制驅避胃腸道對D型肉毒毒素的破壞，提高害鼠胃腸道對毒素吸收的D型肉毒毒素滅鼠劑新劑型非常有必要。因此，本研究主要分析了不同害鼠胃腸內容物對D型肉毒毒素蛋白的破壞強度，在補充完善D型肉毒毒素對不同害鼠敏感性差異的基礎上，為下一步研制免受胃腸道破壞的新型D型肉毒毒素新制劑提供理論依據。

1 材料

1. 1 實驗動物

青海松田鼠（Neodon fuscus）捕捉自青海省海北州剛察縣青海湖農場，體質量25～35 g，在室內人工飼養1周后供實驗室用。

高原鼠兔捕捉自青海省海北州祁連縣野牛溝鄉達玉村野外牧區，體質量125～153 g，在室內人工飼養1周后供實驗室用。

高原鼢鼠捕捉自青海省海南藏族自治州貴南縣野外，體質量200～270 g，正常飼喂，在室內有土的鐵桶內避光人工飼養1周后供實驗室用。

1. 2 試驗藥品

取D 型肉毒毒素原藥（批號：2018036，毒價：2 000萬 MLD/mL），做2 mL毒素+18 mL凍水的10倍稀釋，再做1∶4倍稀釋，即為40萬 MLD/mL小鼠靜注毒價毒素。

2 方法

2. 1 D 型肉毒毒素對3 種害鼠灌胃半數致死量（LD50）的測定

2. 1. 1 對高原鼠兔灌胃LD50的測定

LD50的測定按霍恩氏法進行，以每毫升分別含2 150、4 640、10 000、21 500 MLD的不同毒素濃度灌服量分為4個試驗組。將野生高原鼠兔20只，隨機分為4組，每組5只，以每100 g體質量灌服1 mL的標準灌服，觀察10 d，記錄中毒癥狀和死亡情況。

2. 1. 2 對高原鼢鼠灌胃LD50的測定

將抓捕的高原鼢鼠置于鐵皮桶中，飼喂甘藍。試驗時將試驗鼢鼠編號，放置于相應編號桶內，夜間放回裝有泥土的原桶內。用霍恩氏法測定LD50，以每千克體質量設置2 150、4 640、10 000、21 500 MLD劑量組，每組5只，以每100 g體質量分別灌服215、464、1 000、2 150 MLD的毒素，飼喂甘藍，觀察10 d，記錄死亡情況。

2. 1. 3 對青海松田鼠灌胃LD50的測定

用霍恩氏法測定LD50，以每千克體質量設置21 500、464 00、100 000、215 000 MLD 劑量組，每組灌服5只，即每20 g體質量分別灌服430、930、2 000、4 300 MLD毒素，喂以燕麥和胡蘿卜，觀察5 d，記錄死亡結果。

2. 2 三種害鼠胃腸內容物對D 型肉毒毒素的破壞強度分析

將3種試驗鼠分別麻醉后，固定在小動物解剖臺上，按試驗需求先進行心臟穿刺采血，待試驗鼠死亡后，分別從每只鼠胃腸內容物中取樣品2 g置于離心管中，加入4 mL生理鹽水稀釋搖勻，再加入1 mL稀釋好的毒素，充分混勻，作用24 h后，離心，測毒。所有試驗程序均經青海省畜牧獸醫科學院實驗動物管理委員會審查批準。

2. 3 三種害鼠胃腸內容物上清液對D 型肉毒毒素的破壞強度分析

另取胃腸內容物分別置于離心管中，加入4 mL生理鹽水稀釋搖勻，4 ℃放置2 h，以4 000 r/min 離心20 min，上清轉移至另一離心管中，再加入1 mL40萬MLD/mL的毒素，充分混勻，室溫作用24 h后，離心，稀釋測毒。

3 結果

3. 1 D 型肉毒毒素對高原鼠兔、高原鼢鼠和青海松田鼠的灌胃LD50

試驗測得D型肉毒毒素對高原鼠兔灌胃LD50為5 110 MLD/kg（可信限2 550～10 200 MLD/kg），對高原鼢鼠灌胃LD50 為5 840 MLD/kg（可信限3 430～9 950 MLD/kg），對青海松田鼠灌胃LD50 為5. 01 萬MLD/kg（可信限3. 08萬～8. 14萬MLD/kg）（表1）。

3. 2 青海松田鼠胃腸內容物及離心上清液對毒素的影響

將肉毒毒素置于青海松田鼠胃腸內容物中作用24 h后，可發現溶液中D型肉毒毒素含量均有降低，尤其腸內容物的毒素含量只有原毒素的1/8，但胃腸內容物經離心后的上清液對肉毒毒素的破壞強度明顯低于腸內容物原液的破壞強度，上清液與毒素作用后，剩余毒力基本為原毒素的1/4（表2）。

3. 3 高原鼠兔胃腸內容物及離心上清液對毒素的影響

將肉毒毒素置于高原鼠兔胃腸內容物中作用24 h后，發現溶液中D型肉毒毒素含量也有不同程度的降低，腸內容物的毒素含量為原毒素的1/4，但胃腸內容物經離心后的上清液對肉毒毒素的破壞強度同樣低于腸內容物原液的破壞強度，上清液與毒素作用后，剩余毒力基本為原毒素的1/2（表3）。

3. 4 高原鼢鼠胃腸內容物及離心上清液對毒素的影響

將肉毒毒素置于高原鼠兔胃腸內容物中作用24 h后，發現溶液中D型肉毒毒素含量均有不同程度的降低，尤其腸內容物的毒素含量只有原毒素的1/8，但胃腸內容物經離心后的上清液對肉毒毒素的破壞強度明顯低于腸內容物原液的破壞強度，上清液與毒素作用后，剩余毒力基本為原毒素的1/4（表4）。

4 討論與結論

國內外已有很多關于肉毒毒素作用機制的報道，肉毒梭菌菌株培養液中肉毒神經毒素主要是以前體毒素復合物的形式存在，前體復合物中的非毒素組分能夠保障神經毒素不被消化道內的各種酶分解破壞而失去活性。當毒素通過消化系統進入小腸后，內部的微堿性環境可以引起毒素復合物的解離，部分神經毒素可穿過小腸黏膜［5?6］，并通過血液和淋巴兩個體內的循環系統阻止神經遞質乙酰膽堿的胞吐釋放，最終導致肌肉麻痹，引起動物死亡。肉毒毒素作為一種細菌分泌毒素蛋白，同樣存在易失活、不穩定的特性，使得口服蛋白的應用增加了一定難度［7?8］，極大地限制了毒素蛋白在各領域中的應用。

本研究結果顯示，3種害鼠胃腸內容物對D型肉毒毒素的破壞作用由高到低依次為青海松田鼠、高原鼢鼠、高原鼠兔，且腸內容物對毒素的破壞強度明顯高于胃內容物。初步推斷不同害鼠對D型肉毒毒素敏感性差異的產生與害鼠體內腸內容物的破壞有一定相關性。該研究對今后選育腸道釋放型高效、特異性D型肉毒毒素生物滅鼠劑具有很好的指導意義。

D型肉毒滅鼠劑是利用D型肉毒梭菌所產毒素研制的生物滅鼠劑，自2005年開始大面積示范應用以來，取得了良好的生態和社會效益［9?10］，然而，從本研究中不同害鼠對D型肉毒毒素的LD50分析看，其LD50及害鼠對藥物的敏感性明顯不同。有研究報道表明，由于保守的VAMP1 序列中的單個殘基變化（Q78V），已顯示出大鼠VAMP1（突觸小泡締合性膜蛋白）在體外對BoNT/B（肉毒神經毒素）有抗性［11］，而人體內VAMP1對BoNT/D顯示出一定的抗性，這是由于另一個殘基變化（M48I）導致的［12］。這些長期體外觀察的數據似乎與體內毒性數據相關，因為長期以來一直觀察到大鼠對BoNT/B不敏感，LD50的中位數為小鼠的10 000倍［13］。

很多口服性小分子靶向藥物制劑在機體內的生物利用度非常容易受到不同食物組成的影響，導致藥物效果出現明顯差異［14?15］。本研究通過胃腸內容物對D型肉毒毒素的破壞強度分析得出，不同害鼠腸內容物對D 型肉毒毒素蛋白均有一定程度的破壞，毒素在胃內容物中作用24 h后，剩余毒素的有效毒力基本上在原毒素的50%以下；從研究結果對比分析可以看出：（1）離心后的胃腸內容物上清液對毒素的破壞強度明顯低于胃腸內容物的直接破壞強度；（2）青海松田鼠胃腸內容物不論原液還是上清液對D型肉毒毒素的破壞強度明顯高于高原鼠兔和高原鼢鼠；（3）腸內容物原液對D型肉毒毒素的破壞強度明顯比胃內容物高。

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基金項目：青海省自然科學基金面上項目（2021-ZJ-923）