蜜環菌菌株DJ1的分子鑒定、生物學特性及人工培養

史雪葉，朱國勝，黃萬兵，李裕榮，陳之林，付少彬

摘? ? 要：為優化蜜環菌的人工培養條件，以蜜環菌菌株DJ1為研究對象，對其進行分子鑒定并通過生物學特性觀察，篩選其最佳培養基和培養條件。結果表明，通過ITS序列構建的系統發育樹可知，菌株DJ1屬于高盧蜜環菌Armillaria gallica。DJ1生長的最優培養條件為PDA培養基+木屑100 g，麩皮5 g，水1 L，pH=6，培養溫度23 ℃。出菇結果表明，在PDA+2%/4%/6%/8%玉米面培養基與木屑培養基中均可得到子實體，其中以添加4%玉米面的培養基出菇效果最好，出菇時間最快；隨著玉米面添加量的增加，蜜環菌子實體的出菇率呈先上升后下降的變化趨勢。研究結果可為蜜環菌的快速培育和人工馴化提供參考。

關鍵詞：蜜環菌屬；食藥用菌；生物學特性；人工馴化

中圖分類號：S646 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2024）06-079-09

Molecular identification， biological characteristics and artificial cultivation of Armillaria strain DJ1

SHI Xueye1， 2， ZHU Guosheng3， HUANG Wanbing3， LI Yurong2， CHEN Zhilin2， FU Shaobin1

（1. Department of Pharmacy， Zunyi Medical University， Zunyi 563000， Guizhou， China; 2. Horticultural Research Institute， Guizhou Academy of Agricultural Sciences， Guiyang 550006， Guizhou， China; 3. Guizhou Institute of Crop Germplasm Resources， Guiyang 550006， Guizhou， China）

Abstract： To optimize the artificial culture conditions of Armillaria， using the Armillaria strain DJ1 as the research object， the author conducted molecular identification and biological characteristics observation to select the optimal medium and culture conditions. The results revealed that the phylogenetic tree constructed based on the ITS sequence indicated that the strain DJ1 belongs to Armillaria gallica. The optimal culture conditions for DJ1 growth were PDA medium with sawdust 100 g， bran 5 g， water 1 L， pH=6， and cultivation temperature of 23 °C. The results of mushroom emergence showed that fruiting bodies could be obtained in PDA + 2%/4%/6%/8% cornmeal medium and sawdust medium. Among them， the medium with 4% cornmeal had the best mushroom production effect and the fastest mushroom emergence time. With the increase of cornmeal addition， the mushroom yield of the fruiting bodies of Armillaria increased first and then decreased. The results of this study can provide a reference for the rapid cultivation and artificial domestication of Armillaria.

Key words： Armillaria; Edible and medicinal mushrooms; Biological characteristics; Artificial domestication

蜜環菌屬真菌Armillaria （Fr.） Staude隸屬擔子菌亞門Basidiomycotina、傘菌目Agaricales、泡頭菌科Physalacriaceae [1]，是中藥材天麻與豬苓的必需共生菌[2-3]。此外，蜜環菌還可導致樹木的局部腐朽，是多種林木的致病菌，嚴重者甚至使樹木死亡[4-5]。蜜環菌子實體俗稱榛蘑，廣泛分布在溫帶到熱帶地區，味道鮮美，具有高蛋白、高粗纖維和低脂肪等特性[6-7]，是人們追求健康飲食的理想食品，經常食用可增強機體免疫力，被人們譽為“東北第四寶”。蜜環菌具有較高的藥用價值，子實體、菌絲、菌索都可以入藥，具有降血糖[8]、保護腦[9]、增強免疫[10]、抗菌消炎[11]、抗真菌[12]和抗病毒[13]等藥理作用。

貴州省擁有豐富的食用真菌和藥用真菌資源，野生食用菌種類在全國的80%以上，近年來貴州食用菌產業發展速度較快[14-16]，但部分大型真菌依舊沒有實現人工培養的完全馴化。目前，榛蘑生產主要依靠林地自然發生和人工無序采摘的方式，野生榛蘑自然產量較低且無序采摘導致其野生資源減少，野生資源的供應又受到季節和地域的影響，使榛蘑價格居高不下[17]。近年來，國內外對蜜環菌的研究多集中在活性成分、藥理作用及其產品開發等方面[18]，對子實體的馴化栽培只有零星報道。目前的栽培研究大多是仿野生或者在野生生境下播種，利用自然的溫度、濕度等環境條件進行生長，但生產效益尚未達到理想水平，此項技術仍有待于深入研究[19-22]。蜜環菌的生長發育過程較復雜，子實體的形成需要低溫、光照和濕度等環境因素協同作用[23-24]，目前尚未實現工廠化生產。為更有效地利用蜜環菌資源，提高其產量和品質，有必要加強對蜜環菌人工培養技術的研究，筆者通過對貴州地區一種蜜環菌屬真菌進行生物學鑒定和培養條件的優化，旨在為蜜環菌的快速培育和開發利用提供關鍵的理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1? ? 供試菌株? ? 蜜環菌菌株DJ1由貴州省農作物品種資源研究所提供。

1.1.2? ? 供試培養基和栽培培養基? ? 供試培養基有6種，1號培養基：PDA培養基（土豆200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、水1 L，pH自然）；2號培養基：PDA培養基+木屑100 g，麩皮100 g，水1 L，pH自然；3號培養基：葡萄糖20 g，蛋白胨6 g，玉米面30 g，瓊脂15 g，水1 L[25]，pH自然；4號培養基：木屑100 g，麩皮100 g，葡萄糖20 g，牛肉膏5 g，瓊脂15 g，水1 L[26]，pH自然。碳源培養基：2號培養基（不含葡萄糖）+4種碳源（葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、玉米面）20 g，pH=6。氮源培養基：2號培養基（不含麩皮）+4種氮源（牛肉膏、酵母粉、麩皮、蛋白胨）5 g，pH=6。

栽培培養基有2種，玉米面培養基：PDA培養基+0%/2%/4%/6%/8%/0%玉米面，水1 L；木屑培養基：木屑與玉米面質量比1∶0或1∶1，麩皮質量=蔗糖質量=1/10木屑質量，含水量65%左右。

1.2 方法

1.2.1? ? 供試菌株系統發育樹的繪制? ? 供試菌株DNA基因的提取與擴增：供試菌株活化后，取出菌絲，清除培養基后，用液氮速凍，磨成粉狀，DNA提取按照真菌基因組DNA提取試劑盒說明書進行。采用真菌通用引物ITS1和ITS4（引物序列如表1）對菌株的內部轉錄間隔區進行PCR擴增，PCR反應體系共25 ?L，正反引物各1 μL，ddH2O為9.5 ?L。反應條件：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將其擴增產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

系統發育樹的繪制：將測序序列在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.gov）數據庫中進行在線BLAST分析。使用MEGA 11軟件構建鄰接樹，建樹時采用Maximum Composite Likelihood模型，經Bootstrap 1000次循環檢驗系統發育樹的可靠性。

1.2.2? ? 最優培養基的篩選? ? 在1～4號培養基中分別接入菌株DJ1，每處理重復3次。接種后置于25 ℃培養箱暗培養，觀察菌株在4種培養基上菌索的生長特性。

1.2.3? ? 不同pH對菌株DJ1菌索生長的影響? ? 使用1 mol·L-1 NaOH和1 mol·L-1 HCl分別調節2號培養基不同的pH梯度（5、6、7、8、9），采用平板培養法將1 cm3菌塊接種于平板，每個處理設置3次重復，25 ℃培養箱暗培養，采用十字交叉法，自接種之日起定時劃線測量（接種與測量方法下同）。

1.2.4? ? 不同溫度對菌株DJ1菌索生長的影響? ? 調節2號培養基pH=6，接種菌株DJ1后分別置于不同溫度（13、18、23、28、33 ℃）下進行培養，每個處理設置3次重復。

1.2.5? ? 不同碳氮源配方對菌株DJ1菌索生長的影響? ? 為繼續優化菌株DJ1的最優培養基配方，分別設置在不同碳源、氮源的培養基上接種菌株DJ1，每個處理設置3次重復，調節pH=6，置于23 ℃培養箱暗培養，以不加碳源、氮源為對照。

以上試驗均于2022年春夏兩季在貴州省農業科學院園藝研究所實驗室完成。

1.2.6? ? 菌株DJ1子實體的馴化栽培? ? 試驗于2022年8月在貴州省農業科學院園藝研究所實驗室進行，將玉米面培養基分別裝入三角瓶（250 mL）中，裝量150 mL，高壓滅菌30 min，冷卻后接種菌株DJ1，每處理3次重復，培養箱暗培養25～30 d，然后轉入白天溫度22 ℃、晚上溫度16 ℃、12 h散射光環境中培養出菇。

將木屑栽培料裝入培養瓶（850 mL聚乙烯瓶），裝量1/2，高壓滅菌35 min，冷卻后接種菌株DJ1，每處理3次重復，培養箱暗培養30 d至菌絲長滿培養瓶，繼續培養15 d，待菌絲充分后熟后，轉入白天溫度22 ℃，晚上溫度16 ℃，12 h散射光環境中培養出菇。

1.3 數據處理

采用Microsoft Office Excel 2007軟件統計分析數據，采用SPSS 25.0 軟件對數據進行差異顯著性分析，采用Adobe Photoshop 2021軟件對圖片進行處理。

2 結果與分析

2.1 供試菌株的系統發育分析

基于rDNA-ITS序列構建的系統發育樹如圖1所示，菌株DJ1與參考序列OL411636 Armillaria gallica聚為1支，相似度為99%，覆蓋率100%。

2.2 最優培養基的篩選

通過觀察記錄菌株DJ1在4種培養基上的生物學特性，發現其生長的最優培養基為2號培養基，在此培養基上菌株DJ1菌索長勢良好、粗壯，菌索萌動早，且長滿培養基時間短（表2、圖2）。

2.3 不同pH對菌株DJ1菌索生長的影響

由表3、圖3可知，菌株DJ1在pH=5～9處理下均生長良好，各處理組的菌索生長量與粗細程度均無顯著差異，其中以pH=6菌索生長最快且最粗壯。

2.4 不同溫度對菌株DJ1菌索生長的影響

由表4、圖4可知，菌株DJ1在不同溫度培養條件下的生長狀況有較大差異，在33 ℃高溫培養下僅見少量白色菌絲萌發，后停止生長；在13～28 ℃培養條件下均可生長，其中在23 ℃培養下長勢最好，生長量最大，當溫度低于18 ℃或高于28 ℃時菌索生長速度緩慢。

2.5 不同碳氮源配方對菌株DJ1菌索生長的影響

由表5、圖5、圖6可知，菌株DJ1在對碳源的利用中，加入葡萄糖、蔗糖和麥芽糖與不加碳源（CK）相比，均提高了菌索生長量，但差異不顯著，菌索粗壯程度均優于CK，其中以對葡萄糖的利用最佳，而菌株DJ1對玉米面的利用最差，菌索生長量和菌索粗壯程度均低于CK。在對氮源的利用中，菌株DJ1對4種氮源的利用與不加氮源（CK）相比，菌索生長量和粗壯程度均無顯著差異，其中以對麩皮的利用最佳。

綜上所述，菌株DJ1經優化后的培養條件為：PDA培養基+木屑100 g，麩皮5 g，水1 L，pH=6，溫度23 ℃。

2.6 菌株DJ1的馴化培養及生長各時期的形態觀察

由表6、圖7可知，在不添加玉米面的2種栽培培養基中未見原基及子實體形成，而添加一定量玉米面的培養基經過溫差和光照等刺激后，一些菌落開始向子實體原基分化，在2種栽培培養基表面均可以觀察到其表層有很多氣生菌絲，但只有小部分氣生菌絲可以扭結形成原基，大部分菌落只停留在菌落堆狀態，沒有再進一步分化為原基。其中在玉米面培養基中，菌株DJ1在PDA+0%、2%、4%、6%、8%、10%玉米面含量下的菌索生長量無顯著差異，以在PDA+4%玉米面培養基中生長最快。除未添加玉米面的培養基與添加10%玉米面的培養基未出菇外，添加2%、4%、6%、8%玉米面的培養基均有子實體出現，以添加4%玉米面的培養基出菇效果最好，出菇最快，其次是添加2%玉米面培養基。該結果表明，隨著玉米面添加量的增加，出菇率呈現先上升后下降的變化趨勢。

菌株DJ1在固體培養基中接種后2～3 d菌絲萌發，乳白色，然后分化形成菌索（圖8-A），菌索能夠從為其提供營養物質的基物中伸出，進入另一個并不支持其生長的基物中[27]，在這個過程中，菌索頂端二叉分支或不分支，幼嫩菌索淡黃色或乳白色（圖8-B～C），伴隨著生長，不斷分支（圖8-D）。菌索由致密的紅褐色至黑褐色的外殼層和白色菌絲構成的髓心組成（圖8-E），隨著菌索長滿培養基（以木屑培養基為例），菌索會在培養基表層形成一層黑色脆弱的盤（圖8-F），充分后熟后，經過溫度、光照等環境因素的刺激，開始形成原基（圖8-G），給予合適的環境條件，逐漸生長為菇蕾（圖8-H）、幼菇（圖8-I）及成熟子實體（圖8-J）。

3 討論與結論

珍貴中藥材天麻與豬苓生長的優劣與其必需共生菌蜜環菌的菌索特征，如粗細、分支和顏色等有關[28]，子實體的形成也與菌索的生長密切相關[29]，好的蜜環菌菌種除與菌株本身的遺傳特性有關外，還依賴于培養環境和培養基質所提供的養分，只有在比較充足的營養環境下，生理功能才能正常完成，性狀才能得以穩定的表達[30]。孫小衛等[31]對野生和人工培養的蜜環菌菌索主要營養成分進行測定，發現人工培養菌索的蛋白質、氨基酸、脂肪、多糖含量均高于野生菌索，認為人工培養的蜜環菌菌索可代替野生菌索應用在食品和醫藥保健品中。

國內外對蜜環菌子實體生長的研究表明，子實體形成對培養基有一定的要求，不同蜜環菌對培養基質的適應性不同，開發挖掘適合不同蜜環菌生長發育的基質非常必要。不少學者對蜜環菌的栽培基質進行摸索[32-37]，成功馴化出了蜜環菌子實體。目前蜜環菌子實體已經在合成培養基中培養成功，如麥芽汁培養基[23-24]和10%玉米面培養基[38]等。在本研究中，菌株DJ1在4種培養基上的生長狀態不同，在2號培養基上生長情況最優，菌索粗壯，分布稠密，在4號培養基上生長情況較差。菌株DJ1最優碳氮源分別為葡萄糖和麩皮，但當氮源含量固定時，不同氮源種類（指本試驗所用的4種氮源）與CK相比，對DJ1菌索生長量與粗壯程度的影響均無顯著差異，因此在蜜環菌菌絲體生產實踐中尤其要重視碳源種類的篩選。

筆者首次在PDA+玉米面培養基上成功培育出蜜環菌子實體，除PDA培養基與添加10%玉米面培養基上未見子實體外，添加2%、4%、6%、8%玉米面的培養基均可培育出子實體。其中，不同玉米面含量的6種培養基菌索生長量無顯著差異，但添加4%玉米面的PDA培養基菌索長勢最好，且出菇時間最短，出菇效果最好。筆者推測添加一定量的玉米面不僅可以為蜜環菌菌絲的生長提供較多且易于利用的營養和能量，還可以促進其從營養生長到生殖生長的轉換，形成子實體，該結論與于海龍等[39]和馬麗峰等[40]的研究結果一致。其次，筆者采用木屑與玉米面質量比1∶1，麩皮質量=蔗糖質量=1/10的木屑質量培養基在培養瓶中成功馴化出菌株DJ1子實體。

綜上所述，菌株DJ1屬于高盧蜜環菌Armillaria gallica。菌株DJ1最優培養條件為PDA培養基+木屑100 g，麩皮5 g，pH=6，溫度23 ℃，在此條件下，菌絲潔白，菌索生長良好。在PDA+玉米面培養基上成功培育出蜜環菌子實體，其中以添加4%玉米面的PDA培養基菌索長勢最好，出菇時間最短，出菇效果最好。筆者優化了菌株DJ1的培養條件，可為實現蜜環菌的快速培育提供參考。蜜環菌的藥用和食用部分多為子實體，筆者提供了蜜環菌出菇的兩種栽培培養基并探索了玉米面添加量與出菇率的關系，有望對蜜環菌的人工栽培及開發利用提供指導與幫助。

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