成人丘腦膠質(zhì)瘤與成人腦干膠質(zhì)瘤分子遺傳特征的差異與預(yù)后相關(guān)

郭瑤 賴名耀 李少群 周江芬 李海南 蔡林波

【摘要】 目的 分析成人丘腦膠質(zhì)瘤與成人腦干膠質(zhì)瘤分子遺傳特征的差異，為成人丘腦膠質(zhì)瘤精準診療提供依據(jù)。方法 收集19例成人丘腦膠質(zhì)瘤及9例成人腦干膠質(zhì)瘤的腫瘤組織樣本，采用二代測序技術(shù)（NGS）檢測425個腫瘤相關(guān)基因，分析成人丘腦膠質(zhì)瘤與成人腦干膠質(zhì)瘤的基因點突變、基因拷貝數(shù)變異等分子遺傳特征及差異。結(jié)果 在收集的標本中，成人丘腦及腦干的彌漫中線膠質(zhì)瘤發(fā)生率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），但丘腦更易發(fā)生膠質(zhì)母細胞瘤（P=0.026）。成人丘腦膠質(zhì)瘤TP53突變、TERT啟動子突變、CDK4/6擴增、PTEN突變、EGFR擴增比例高于成人腦干膠質(zhì)瘤，H3K27M突變、IDH1突變、MCL1擴增、NF1突變、ATRX突變、FAT1突變比例低于腦干膠質(zhì)瘤，其中TERT啟動子突變比例在兩者中有顯著差異（P=0.026）；成人丘腦膠質(zhì)瘤中發(fā)生PI3K 信號通路激活比例顯著高于成人腦干膠質(zhì)瘤（P=0.016）。單因素分析結(jié)果顯示成人丘腦膠質(zhì)瘤中TP53突變（P=0.01）、CDK4/6擴增（P=0.02）、EGFR擴增（P=0.04）和ARID1A（P=0.048）突變均與患者低生存顯著相關(guān)，而成人腦干膠質(zhì)瘤中FAT1突變（P=0.024）和MCL1擴增（P=0.017）與患者低生存顯著相關(guān)。結(jié)論 成人丘腦較腦干更易發(fā)生膠質(zhì)母細胞瘤，而且二者分子遺傳特征也存在明顯差異，提示成人丘腦膠質(zhì)瘤是不同于成人腦干膠質(zhì)瘤的一類具特殊遺傳腫瘤譜的腫瘤。

【關(guān)鍵詞】 膠質(zhì)瘤；丘腦；腦干；分子遺傳

【中圖分類號】 R739.41? 【文獻標志碼】 A? 【文章編號】 1672-7770（2024）03-0273-07

丘腦膠質(zhì)瘤屬于臨床罕見腫瘤，發(fā)病率低，占顱內(nèi)腫瘤1%～5%，而成人丘腦膠質(zhì)瘤發(fā)病率更低，僅僅占顱內(nèi)腫瘤1%，主要治療手段包括手術(shù)、放療及化療等，少數(shù)患者接受激光間質(zhì)熱療（laser interstitial thermal therapy，LITT），但預(yù)后差，中位生存時間僅13.6個月，腫瘤切除程度、術(shù)后放化療是影響預(yù)后主要因素［12］。但由于丘腦位于大腦半球中央深部、解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜、功能重要、毗鄰重要功能區(qū)及血管，手術(shù)切除腫瘤極具挑戰(zhàn)，臨床亟須尋找新治療方法提高丘腦膠質(zhì)瘤的療效。2021年Wang等［3］的研究結(jié)果顯示成人丘腦膠質(zhì)瘤與大腦半球膠質(zhì)瘤在H3K27M突變、異檸檬酸脫氫酶1（isocitric dehydrogenase 1，IDH1）突變、O6-甲基鳥嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）啟動子甲基化、Ki-67增殖指數(shù)等方面存在明顯差異，提示丘腦膠質(zhì)瘤可能是一種特殊類型的膠質(zhì)瘤。因此，為進一步了解成人丘腦膠質(zhì)瘤分子遺傳特征，探索更有效的精準治療方案，本研究擬開展對成人丘腦膠質(zhì)瘤及成人腦干膠質(zhì)瘤的分子遺傳特征差異與預(yù)后相關(guān)研究。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 共納入28例膠質(zhì)瘤患者，其中男20例，女8例；年齡18～66歲；丘腦膠質(zhì)瘤19例，腦干膠質(zhì)瘤9例，見表1。納入標準：（1）年齡≥18歲；（2）影像學確診病變主體位于丘腦或腦干，經(jīng)過2名中級職稱以上有經(jīng)驗的放射診斷醫(yī)師確認；（3）按照2021年世界衛(wèi)生組織中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標準病理確診的膠質(zhì)瘤患者。排除標準：（1）影像學確診病變位置位于中線以外而病灶邊緣累及丘腦及腦干；（2）復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤。

1.2 方法

1.2.1 腫瘤組織病理學檢查 所有標本經(jīng)中杉公司行蘇木精伊紅（hematoxylin eosin，HE）染色（染色濃度為工作液），光鏡觀察選擇含腫瘤組織蠟塊，采用全自動免疫組化進行檢測。對其中所有腫瘤石蠟標本進行H3K27M免疫組化標記，部分腫瘤進行相關(guān)免疫組化標記GFAP（單克隆抗體為鼠單抗UMAB129和EP13）、Olig-2（單克隆抗體為鼠單抗OT17C7和免單抗EP112）、IDH1（單克隆抗體為鼠單抗H09）、P53（GM70097）、ATRX（D5）和Ki-67（GM027）。

1.2.2 腫瘤組織二代測序技術(shù)（next generation sequencing，NGS）檢測 使用425基因探針（世和基因）在HiSeq 4000平臺（Illumina）上測序行NGS檢測，步驟如下：腫瘤組織DNA提取處理、高通量測序文庫構(gòu)建及質(zhì)控、探針富集腫瘤驅(qū)動基因、文庫混合與上樣測序。

1.2.3 生物信息學分析 數(shù)據(jù)質(zhì)量控制使用Trimmomatic［4］，質(zhì)控后數(shù)據(jù)使用BWA［5］（0.7.12）的MEM算法，使用GATK version 3.4-0將比對結(jié)果的局部比對優(yōu)化［67］。SNVs/Indels/CNVs異分析：點突變（SNVs）與插入缺失（Indels）的分析，使用VarScan2（2.3.9）［8］，設(shè)置最低檢出頻率為0.01，P值設(shè)置為0.05，生成VCF結(jié)果及注釋［9］。拷貝數(shù)變異（CNVs）分析使用ADTEx（1.0.4）［10］。

1.3 統(tǒng)計學分析 （1）分子特征分析基于患者突變信息進行OncoPrint作圖；（2）兩組間分子差異分析：當單組樣本量≤4時，進行Fisher精確檢驗；當單組樣本量＞4時，進行Pearson卡方檢驗；（3）預(yù)后相關(guān)基因分析：首先進行Cox單因素分析，選擇P<0.05的基因進行Cox多因素分析，并使用Kaplan-Meier法繪制生存曲線。

2 結(jié) 果

2.1 患者基本資料及臨床特征 成人丘腦膠質(zhì)瘤中高級別（WHO Ⅲ、Ⅳ級）膠質(zhì)瘤15例（15/19，78.9%）、彌漫中線膠質(zhì)瘤6例（6/19，31.6%）、膠質(zhì)瘤母細胞瘤9例（9/19，47.4%）；成人腦干膠質(zhì)瘤中高級別膠質(zhì)瘤4例（4/9，44.4%）、彌漫中線膠質(zhì)瘤3例（3/9，33.3%）、無膠質(zhì)母細胞瘤（0/9，0.0%）；丘腦、腦干的高級別膠質(zhì)瘤及彌漫中線膠質(zhì)瘤發(fā)生率差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），但丘腦較腦干更容易發(fā)生膠質(zhì)瘤母細胞瘤（分別為47.4% 和0.0%，P=0.026）。

2.2 NGS分析成人丘腦膠質(zhì)瘤與腦干膠質(zhì)瘤的分子差異

2.2.1 成人丘腦膠質(zhì)瘤與腦干膠質(zhì)瘤基因變異特征的差異 采用NGS對19例丘腦膠質(zhì)瘤和9例成人腦干膠質(zhì)瘤腫瘤組織樣本檢測425個腫瘤相關(guān)基因變異發(fā)生情況。

36.8%（7/19）的成人丘腦膠質(zhì)瘤患者中檢測到H3K27M突變。同時檢測到既往報道過的中線膠質(zhì)瘤生物標志物，包括TP53突變（11/19，57.9%）、TERT啟動子突變（9/19，47.4%）、PTEN突變（6/19，31.6%）、EGFR擴增（7/19，36.8%）、IDH1突變（1/19，5.3%）等。而成人腦干膠質(zhì)瘤中存在H3K27M突變（5/9，55.6%）、MCL1擴增（5/9，55.6%）、NF1突變（4/9，44.4%）、TP53突變（2/9，22.2%）、ATRX突變（3/9，33.3%）、FAT1突變（3/9，33.3%）及IDH1突變（2/9，22.2%）等等，未見TERT啟動子突變、EGFR變異、PDGFRA擴增等中線膠質(zhì)瘤生物標志物。比較成人丘腦和腦干膠質(zhì)瘤患者基因變異情況（至少3例患者發(fā)生的基因變異才被認為有意義），結(jié)果顯示成人丘腦膠質(zhì)瘤患者發(fā)生TERT啟動子突變的頻率明顯更高（分別為47.4%和0.0%，P=0.026）。見圖1。

進一步比較分子間的相關(guān)性，結(jié)果顯示成人丘腦膠質(zhì)瘤中H3K27M基因突變與TERT啟動子突變相互排斥，與PDGFRA突變明顯重疊；TERT啟動子突變經(jīng)常與EGFR變異共同存在。見圖2。

2.2.2 成人丘腦膠質(zhì)瘤與腦干膠質(zhì)瘤信號通路激活差異 癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）研究分析顯示膠質(zhì)母細胞瘤關(guān)鍵基因變異導致相關(guān)信號通路激活［1113］，參考Osada等的研究成果［14］，分析包括RTK/RAS、TP53、PI3K、CELL CYCLE、WNT、NOTCH、HIPPO、MYC、TGF-β信號通路激化，28例膠質(zhì)瘤信號激活發(fā)生包括RTK/RAS（25/28，89.3%）、TP53（14/28，50%）、PI3K（13/28，46.4%）、CELL CYCLE（9/28，32.1%）、WNT（8/28，28.6%）、NOTCH（6/28，21.4%）、HIPPO（5/28，17.9%）、MYC（4/28，14.3%），其中PI3K通路激活在成人丘腦膠質(zhì)瘤中的占比顯著高于成人腦干膠質(zhì)瘤（分別為63.2%和11.1%，P=0.016）。見圖3。

2.2.3 成人丘腦膠質(zhì)瘤與腦干膠質(zhì)瘤預(yù)后基因差異

2.2.3.1 成人丘腦膠質(zhì)瘤與腦干膠質(zhì)瘤預(yù)后差異成人丘腦膠質(zhì)瘤患者中位總生存期為13.5個月（0.3-NA個月），成人腦干膠質(zhì)瘤患者中位總生存期為16.1個月（7.3-NA個月），兩者無顯著性差異（P=0.614）。見圖4。

2.2.3.2 成人丘腦膠質(zhì)瘤與腦干膠質(zhì)瘤預(yù)后基因差異 本研究為進一步確定基因變異是否與成人丘腦膠質(zhì)瘤患者的生存相關(guān)，對整個隊列中至少3個患者發(fā)生的基因變異進行單因素分析發(fā)現(xiàn)，TP53突變（11/19，57.9%）、CDK4/6擴增（7/19，36.8%）、EGFR擴增（4/19，21.1%）和ARID1A突變（3/19，15.8%）與患者生存顯著相關(guān)（P<0.05）。見圖5。值得注意的是，在成人腦干膠質(zhì)瘤中沒有觀察到這種關(guān)系（表2），其生存與FAT1突變和MCL1擴增顯著相關(guān)（P<0.05）。見圖6。

為進一步排除混淆因素，將放/化療、TP53突變、CDK4/6擴增、EGFR擴增和ARID1A突變這5個因素納入多因素分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)放/化療（HR=0.16，95%CI=0.05～0.55，P=0.003）、EGFR擴增（HR=3.69，95%CI=1～13.6，P=0.04）、ARID1A突變（HR=3.77，95%CI=0.922～15.4，P=0.048）可能是成人丘腦膠質(zhì)瘤獨立預(yù)測因子；而成人腦干膠質(zhì)瘤患者由于例數(shù)過少，無法進行多因素分析。

3 討 論

丘腦與腦干解剖位置毗鄰，丘腦高級別膠質(zhì)瘤是一種不同于幕上大腦半球高級別膠質(zhì)瘤的一類腫瘤［11］，本研究發(fā)現(xiàn)成人丘腦比腦干更易發(fā)生膠質(zhì)母細胞瘤（P<0.05），丘腦膠質(zhì)瘤中IDH1突變發(fā)生率為6.2%，而成年人腦干膠質(zhì)瘤中IDH1發(fā)生率為9%～13.6%，明顯低于大腦半球膠質(zhì)瘤的56.5%［3，1213］。TERT啟動子突變頻率在成人丘腦膠質(zhì)瘤明顯高于腦干膠質(zhì)瘤（P=0.026），而且成人丘腦膠質(zhì)瘤中發(fā)生H3K27M突變患者的腫瘤組織中未能檢測到TERT啟動子突變，H3K27M野生型患者腫瘤組織中TERT啟動子突變發(fā)生率為61.5%，兩者存在互斥，并且H3K27M和TERT基因野生型患者預(yù)后明顯優(yōu)于H3K27M突變或TERT啟動子突變的患者［14］。另外在中線膠質(zhì)瘤中RTK/RAS信號通路激活最為常見［15］，同樣成人丘腦膠質(zhì)瘤與腦干膠質(zhì)瘤也最容易發(fā)生RTK/RAS信號通路激活，但PI3K通路激活在兩者之間存在差異（P=0.016）。因此，成人丘腦膠質(zhì)瘤在膠質(zhì)母細胞瘤發(fā)生率、IDH1突變、TERT啟動子突變及PI3K信號通路激活與成人腦干膠質(zhì)瘤存在差異，提示成人丘腦膠質(zhì)瘤是一類有別成人腦干膠質(zhì)瘤的腫瘤。

H3K27M作為中線膠質(zhì)瘤診斷和分類的重要分子標記，在成人丘腦膠質(zhì)瘤中H3K27M突變發(fā)生率為37.4%，而在成人腦干膠質(zhì)瘤中發(fā)生率為55.6%，兩者發(fā)生率沒有統(tǒng)計學差異（P=0.432），且研究顯示H3K27M突變并不影響成人中線膠質(zhì)瘤的預(yù)后［16］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，H3K27M突變不影響幕上膠質(zhì)瘤預(yù)后（P=0.603），而幕下膠質(zhì)瘤合并H3K27M突變患者預(yù)后較差（P<0.000 1）［17］，在成人腦干膠質(zhì)瘤中H3K27M突變患者中位生存時間僅為9個月，明顯低于H3K27M野生型患者（P<0.001）［18］。同樣，本研究發(fā)現(xiàn)丘腦膠質(zhì)瘤H3K27M突變不影響預(yù)后（P=0.65），而成人腦干膠質(zhì)瘤H3K27M突變的患者有預(yù)后較差趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P=0.17）；另外本研究中2例患者H3K27M突變同時存在IDH1突變。因此，雖然丘腦與腦干解剖位置毗鄰，即使相同H3K27M突變對于成人丘腦膠質(zhì)瘤與成人腦干膠質(zhì)瘤的預(yù)后影響并不一樣，但需要擴充樣本量證實上述觀點。

成人丘腦膠質(zhì)瘤與腦干膠質(zhì)瘤與預(yù)后相關(guān)的分子特征亦不同，其中與成人腦干膠質(zhì)瘤預(yù)后相關(guān)的基因改變包括FAT1突變、MCL1擴增，而與成人丘腦膠質(zhì)瘤相關(guān)包括TP53突變、EGFR擴增、ARID1A突變、CDK4/6擴增。而且成人丘腦膠質(zhì)瘤中ARID1A突變、CDK4/6擴增不僅與預(yù)后相關(guān)，而且有望成為成人丘腦膠質(zhì)靶向治療潛在位點，尤其成人丘腦膠質(zhì)瘤中CDK4/6擴增發(fā)生率高達31.8%，在臨床前研究發(fā)現(xiàn)CDK4/6的抑制劑對患者來源的二維和三維膠質(zhì)母細胞瘤細胞培養(yǎng)模型及患者來源的異種移植瘤模型均顯示抗腫瘤作用［1920］，因此，該研究為下步CDKs抑制劑在成人丘腦膠質(zhì)瘤靶向治療的臨床試驗提供理論基礎(chǔ)。

綜上所述，丘腦與腦干位置毗鄰，這兩個位置的膠質(zhì)母細胞瘤發(fā)生率存在差異，而且分子遺傳變異也存在差異，并與預(yù)后相關(guān)的分子特征也存在差異，提示成人丘腦膠質(zhì)瘤與成人腦干膠質(zhì)瘤具有不同遺傳腫瘤譜。本研究為成人丘腦膠質(zhì)瘤精準治療提供依據(jù)，但該研究存在不足包括研究分析數(shù)據(jù)僅僅基于425基因、病例數(shù)較少等，后續(xù)研究將進一步擴大病例數(shù)及整合基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組學等多組學數(shù)據(jù)分析兩者差異。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

［參 ?考 ??文 ??獻］

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