RPA技術在金葡菌檢測中的研究進展

摘 要：金黃色葡萄球菌可以在人體內外寄生或污染食物，導致皮膚潰爛、免疫力下降和食物中毒等一系列癥狀，對人體健康構成危害。重組酶聚合酶擴增技術具有反應溫度低、反應速率快和特異性高的特點，在不需要精密儀器的情況下能夠更準確、高效、快速地檢測出金黃色葡萄球菌。本文主要通過綜述重組酶聚合酶擴增技術在金葡菌檢測中的國內外現狀以及其反應機理、引物設計方法等內容，探討了其中的意義和存在的問題，并展望了該領域未來的發展前景，旨在為公共衛生和食品安全領域提供可行的解決方案。

關鍵詞：金黃色葡萄球菌；重組酶聚合酶擴增技術；等溫擴增技術；引物

Research Progress of RPA Amplification Technique in Detection of Staphylococcus aureus

ZHOU Yuxuan， WU Xuemei， SONG Shaozheng*

（School of Health and Nursing， Wuxi Taihu University， Wuxi 214000， China）

Abstract： Staphylococcus aureus can parasite or contaminate food inside and outside the human body， resulting in a series of symptoms such as skin ulceration， decreased immunity and food poisoning， posing a hazard to human health. Recombinase polymerase amplification technology has the characteristics of low reaction temperature， fast reaction rate and high specificity， and can detect Staphylococcus aureus more accurately， efficiently and quickly without the need of precision instruments. Therefore， this paper mainly reviewed the current situation of RPA amplification technology in Staphylococcus aureus detection at home and abroad， the reaction mechanism of recombinase polymerase amplification， primer design methods and other contents， discussed the significance and existing problems， and looked forward to the future development prospects of this field， aiming to provide feasible solutions for public health and food safety.

Keywords： Staphylococcus aureus; recombinase polymerase amplification; isothermal amplification technique; primer

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）也稱“金葡菌”，是一種常見的食源性致病微生物，在自然界中廣泛存在。它主要寄生于人體的皮膚、鼻腔、咽喉、胃腸、癰和化膿瘡口中，可引起一系列血液感染和化膿性疾病，對食品和醫療領域造成嚴重影響[1]。但抗生素的濫用，導致多重耐藥性SA大量出現[2]，因此快速有效地檢測和監測SA的存在變得至關重要。PIEPENBURG等[3]于2006年首次提出重組酶聚合酶擴增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）技術。RPA是一種新型的恒溫擴增技術，在25～43 ℃下反應，且反應速度較快，僅需5～15 min[4]。該技術不需要精密儀器，適用于現場快速檢測[5]，因此在相關領域學者中備受關注。本文通過總結RPA技術在金葡菌檢測中的國內外研究現狀、引物設計、探針設計等內容，并展望了RPA技術在未來的發展前景，旨在為公共衛生和食品安全領域提供參考。

1 國內外研究現狀

1.1 發文量統計

2006年，Piepenburg首次提出RPA技術，至今一直是學者們研究的熱點。但目前利用RPA技術進行SA檢測的研究仍相對較少。通過PubMed和知網兩個數據庫進行關鍵詞檢索，時間范圍限定為2006—2023年，分別輸入“Recombinase Polymerase Amplification; Staphylococcus aureus”“重組酶聚合酶擴增技術；金黃色葡萄球菌”，發現RPA技術應用于SA快速檢測的發文量目前較少，兩個數據庫合計發文量僅11篇，且主要集中在RPA技術應用于醫學檢驗、微生物檢驗等領域的籠統概括，缺少具體的綜述。

1.2 國內研究現狀

近年來，國內研究人員開始探索利用RPA技術進行SA的快速檢測。以往的研究表明，RPA技術在SA檢測中具有很高的特異性和靈敏度。例如，徐健皓等[6]基于exo-RPA技術原理，針對SA設計了多套RPA引物和含有修飾熒光基團和淬滅基團的RPA熒光探針，并構建了SA-exo-RPA檢測體系，增強了SA的檢測率，證明了RPA技術在SA檢測中的潛力。此外，研究人員還聯合使用RPA技術與其他檢測方法，如王雨[7]通過將RPA與橫向流動試紙條相結合來檢測SA，在研究中發現可以使敏感度達

20 CFU·mL-1，顯著提高了準確性。高建欣等[8]則是通過將RPA與乳膠微球試紙條相結合，檢測限為

1.2 CFU·mL-1。這些研究結果顯示出該方法對SA極為敏感，通過與其他檢測技術的結合，RPA技術可以對SA進行更加高效、準確的檢測。

綜上，國內利用RPA技術進行SA的檢測已取得一定的進展，先前的研究也為該技術的優化改進提供了技術支持。但目前仍然面臨著一些挑戰和限制，如細菌樣品中的抑制物和假陽性的干擾、靈敏度和穩定度可進一步提高等。因此，未來還需不斷優化RPA技術的條件和方法。

1.3 國外研究現狀

外科醫生亞歷山大·奧格斯頓于1880年給一名位于蘇格蘭阿伯丁的潰瘍患者進行治療時首次發現金葡菌[9]。自此，國外對SA的研究正式開始。近年來，RPA技術作為一種新興的核酸擴增方法，不少外國學者進行研究，MUNAWAR[10]的研究表明，RPA技術具有靈敏性高、恒溫擴增、適用性廣泛等優點，能夠在短時間內檢測到寡菌量級的菌液，也證明了RPA技術在SA檢測中的巨大潛力。但由于RPA技術引物和探針目前還存在一定的技術壁壘，因此外國學者主要對RPA技術與其他檢測方法聯合應用進行了探索。如將RPA技術與PCR、聚合物絮凝沉降等技術相結合以進一步提高SA檢測準確性和可靠性。TRAN等[11]將RPA技術與PCR技術聯合使用，創新出了一種基于重組酶聚合酶擴增方法的等溫PCR檢測方法，提高了SA檢測靈敏度，縮短了檢測所需的時間。

綜上所述，RPA技術在與其他技術聯用后可以進一步提高檢測結果的準確性和可靠性，對于檢測SA有獨特優勢。未來的研究可以進一步優化RPA反應條件，并探索其在實驗室以及野外環境中的應用潛力，推動SA檢測技術發展不斷向前邁進。

2 方法與技術

2.1 RPA的引物、探針設計

為了獲得高效、特異性和穩定的RPA反應，研究者們進行了多方面的優化。①引物的設計對于擴增效果至關重要。RPA技術的引物設計要求通常比較嚴格，引物的長短對擴增結果起著決定性作用。過短會影響重組率，減慢擴增速度，降低靈敏度；過長會增加產生其他二級結構的可能性，都在一定程度上影響了核酸擴增產量。因此RPA反應引物的推薦長度為30～35個核苷酸[12]。此外，對引物GC堿基的含量應控制在40%～60%，且連續的GC堿基不能超過4個[13]，在引物設計中需注意二聚體和發夾結構的形成。②探針的優化也是關鍵因素。與一般Taq Man探針相比，RPA探針具有更高的設計要求。RPA反應目標片段長度應少于

500 bp，最佳擴增長度以100～200 bp為宜。如四氫呋喃（Tetrahydrofuran，THF）位點的5’端正常控制在

30 bp，3’端正?？刂圃?5 bp。間隔越大導致基底值越高，信噪比越低，因此熒光團與猝滅團通常標記在胸腺嘧啶上，且兩者的間距控制在1～5 bp，一般用THF取代1個核苷酸。C3-間隔通常被探針的3’端用來阻斷基團進行修飾封閉。

2.2 RPA檢測SA的原理

①RPA技術主要基于重組酶和DNA聚合酶的協同作用，使其在無須進行溫度變化的環境下高效擴增DNA。因此，在檢測SA時，首先識別并結合到雙鏈DNA的特定序列上，其中的DNA聚合酶在單鏈結合蛋白的保護下，沿著單鏈模板進行快速且高效的DNA合成。整個過程無須復雜的溫度變化，可在23～45 ℃中穩定擴增，且只需15～20 min即可完成目標擴增[14]，節省了時間和成本。②進行RPA檢測之前需要進行SA的DNA提取。目前常用的DNA提取方法包括酚/氯仿法、鹽法和DNA提取試劑盒，其中最主要的是DNA提取試劑盒，其具有簡便高效的特點，并且利用其特殊的試劑盒體系和離心柱技術可以快速地提取高質量的DNA。

3 結語

RPA技術具有高靈敏性、特異性和廣泛的適用性等優點，操作簡單易行，為基層醫療組織和資源匱乏地區快速有效的檢測病原菌，提供了可能[15]。但在目前的研究中RPA技術仍存在樣本前置處理煩瑣、菌液的假陽性干擾大等問題。①在檢測SA的研究進展中需要繼續優化和改進RPA反應體系，以提高其擴增效率和特異性，并減少阻抗物質對反應的干擾。可通過優化擴增反應體系的組分濃度和反應條件；還可以通過引入新的輔助酶或輔助因子來提高反應效率和特異性。②加強RPA與其他新興技術的結合。如CRISPR，可以減少非特異性擴增和背景干擾，提高對SA檢測的準確性與可靠性。綜上所述，利用RPA技術進行SA檢測已經取得了顯著的研究進展，利用RPA技術進行SA檢測具有重要的臨床應用前景，在診斷和治療SA感染方面具有重要意義。

參考文獻

[1]劉婷婷，崔春霞，宋壯志，等.2010—2020年中國大陸金黃色葡萄球菌及其腸毒素引起的食源性疾病暴發事件歸因分析[J].中國食品衛生雜志，2022，34（5）：1029-1034.

[2]汪宗林，陳建榮，尤忠毓，等.金黃色葡萄球菌生物被膜形成與耐藥機制的研究進展[J/OL].生物工程學報1-15[2024-04-02].https：//doi.org/10.13345/j.cjb.230803.

[3]PIEPENBURG O，WILLIAMS C，ARMES N，et al.

DNA detection using recombination proteins[J].PLoS Biology，2006，4（7）：1115-1121.

[4]楊永強，龍炫輝，魏濤，等.重組酶聚合酶等溫擴增快速檢測肺炎支原體方法的建立和初步應用[J].現代生物醫學進展，2021，21（11）：2169-2173.

[5]葛航，吳朦晨，張明洲，等.食源性致病菌等溫擴增檢測技術的研究進展[J].分析測試學報，2019，38（7）：

874-881.

[6]徐健皓，李佳欣，白欣茹，等.基于實時熒光重組酶聚合酶擴增（RPA）技術的金黃色葡萄球菌快速檢測方法的建立[J].軍事醫學，2022，46（6）：441-446.

[7]王雨.基于RPA-LFD的沙門氏菌和金黃色葡萄球菌可視化快速檢測方法研究[D].長春：吉林大學，2022.

[8]高建欣，藏雨軒，杜欣軍，等.重組酶聚合酶恒溫擴增結合乳膠微球試紙條快速檢測金黃色葡萄球菌[J].食品研究與開發，2019，40（1）：168-172.

[9]GUO Y，SONG G，SUN M，et al.Prevalence and therapies of antibiotic-resistance in Staphylococcus aureus[J].Front Cell Infect Microbiol，2020，10：107.

[10]MUNAWAR M A.Critical insight into recombinase polymerase amplification technology[J].Expert Rev Mol Diagn，2022，22（7）：725-737.

[11]TRAN D H，TRAN H T，PHAM T N M，et al.Direct multiplex recombinase polymerase amplification for rapid detection of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa in food[J].Mol Biol Res Commun，2022，11（1）：1-10.

[12]張蕾，陳亮，江波濤，等.重組酶聚合酶擴增技術在動物病原菌檢測中的應用進展[J].動物醫學進展，2024，45（1）：89-94.

[13]王帥，楊艷歌，吳占文，等.重組酶聚合酶擴增、重組酶介導等溫擴增及酶促重組等溫擴增技術在食源性致病菌快速檢測中的研究進展[J].食品科學，2023，44（9）：

297-305.

[14]魏星，鄭蘭，游德紅，等.2019冠狀病毒病疫情期間定點醫院檢驗科技師職業暴露風險與防控措施[J].海南醫學，2020，31（16）：2162-2164.

[15]吳華華，王錦鑫，谷慶花，等.金黃色葡萄球菌重組酶聚合酶擴增方法的建立[J].中國預防獸醫學報，2020，42（8）：797-801.

基金項目：江蘇省高校自然科學基金（20KJB360007）；江蘇省高?！扒嗨{工程”優秀青年骨干教師項目（蘇教師函〔2021〕11號）。

作者簡介：周宇萱（2002—），女，安徽馬鞍山人，本科。研究方向：生物醫學。

通信作者：宋紹征（1984—），男，江蘇宿遷人，博士，副教授。研究方向：生物醫藥。E-mail：ssz0610@163.com。