堿性蛋白酶水解萌動苦蕎蛋白質的條件優化

摘 要：以萌動苦蕎蛋白質和堿性蛋白酶為試驗材料，通過單因素和正交試驗研究堿性蛋白酶水解萌動苦蕎蛋白質過程中溫度、pH值、加酶量對水解效果的影響。結果表明，堿性蛋白酶水解萌動苦蕎蛋白質的最佳條件為控制水解溫度45 ℃、pH值10、加酶量2 000 U·g-1、水解120 min，該條件下水解度為20.13%。

關鍵詞：苦蕎麥；萌動苦蕎蛋白質；堿性蛋白酶；水解

Optimization of Alkaline Protease Hydrolysis of Germinating Tartary Buckwheat Protein

GAN Guochao1， CAI Li1， ZHONG Haixia1， CHEN Zhiguang2， XU Yuhang1

（1.College of Agricultural Sciences， Xichang University， Xichang 615013， China;

2.Panxi Crops Research and Utilization Key Laboratory of Sichuan Province， Xichang University， Xichang 615013， China）

Abstract： The effects of temperature， pH and enzyme addition on the hydrolysis of germinating tartary buckwheat protein by alkaline protease were studied by single factor and orthogonal experiments. The results showed that the optimal conditions for alkaline protease to hydrolyze the germinating tartary buckwheat protein were

controlled by controlling the hydrolysis temperature of 45 ℃， pH 10， enzyme dosage of 2 000 U·g-1， and hydrolysis for 120 min，

and the degree of hydrolysis was 20.13%.

Keywords： tartary buckwheat; germinating tartary buckwheat protein; alkali protease; hydrolysis

在我國西南部，苦蕎資源相當豐富，無論是品種數量還是產量，在世界上都穩居前列，具有極高的開發價值。苦蕎含有豐富的營養物質，且具有保健功能[1]，越來越多的研究者以苦蕎為原料制作食品產品、功能性保健品等。目前對苦蕎食品的加工研究中，不僅僅局限于苦蕎麥，而是包括整個苦蕎植株，如莖、葉等部位，以及不同生長時期的苦蕎麥。在苦蕎各個部位中，有著各不相同的營養物質；在不同的苦蕎食品中，添加的苦蕎部位也各不相同，如苦蕎茶中使用的是莖和葉；苦蕎粉中使用的是苦蕎籽[2]。苦蕎籽粒經萌動后，體內大量高活性的胰蛋白酶抑制劑會逐漸被降解，為生長提供氮源。在萌動過程中會降低胰蛋白酶抑制劑對蛋白消化酶的抑制作用，從而提高蛋白質吸收率。苦蕎麥萌動后總氨基酸含量比苦蕎麥籽粒中蛋白質含量高，且檢測到的多種氨基酸含量隨萌發時間的延長明顯提高[3-4]。

將萌動苦蕎蛋白質水解后，蛋白分子結構疏松，相對分子質量減小，便于人體消化吸收，能使吸收率大大提高。本試驗以涼山萌動苦蕎粉為研究材料，通過單因素和正交試驗研究堿性蛋白酶水解萌動苦蕎蛋白質的最優條件，以供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

苦蕎籽粒：購于四川省涼山州航飛苦蕎有限公司。

堿性蛋白酶，NaCl、NaOH、HCl、CuSO4、K2SO4、H2SO4、HBO3、NaOH均為AR級。

1.2 儀器與設備

TDL24型低速臺式離心機，上海姚氏儀器設備廠；HH-6單列六孔恒溫水浴鍋，金壇市華城海納儀器廠；PHS雷磁精密pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；FA2004電子天平，杭州匯爾儀器廠；KNC-08C全自動凱氏定氮儀，上海洪紀儀器廠；萬能可調電爐，沈陽固而特商貿有限公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 萌動苦蕎蛋白質的提取

萌動苦蕎蛋白質的提取工藝流程見圖1。

1.3.2 堿性蛋白酶水解條件的初步確定

試驗以水解度為考察指標，研究堿性蛋白酶水解萌動苦蕎蛋白質的最佳條件。設置試驗溫度為35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃和55 ℃，試驗pH值為9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5和12.0，加酶量為2 000 U·g-1、3 000 U·g-1、4 000 U·g-1、5 000 U·g-1和6 000 U·g-1。除所研究的因素外，其他剩余各因素均取基本值（pH值10.0、溫度45 ℃、加酶量3 000 U·g-1、底物濃度30 g·L-1、反應時間120 min）。

1.3.3 正交試驗

以水解度為考察指標，根據單因素試驗結果，通過3因素3水平正交試驗確定堿性蛋白酶水解萌動苦蕎蛋白的最佳條件。正交試驗因素水平表見表1。

1.3.4 蛋白質的測定

參考《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》（GB 5009.5—2016）中凱氏定氮法測定樣品中蛋白質含量[5]。

1.3.5 水解度的測定

參照楊文博等[6]提出的蛋白質水解度測定方法，采用甲醛滴定法進行蛋白質水解度測定。蛋白水解度=氨基酸總量（水解后）（mg）/樣品蛋白質總量（mg）×100%。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 溫度對水解效果的影響

由圖2可知，隨著溫度的升高，蛋白質水解度呈先上升后下降的趨勢。當溫度在40～50 ℃時，對水解效果的影響較大；水解溫度為45 ℃時，水解度最大。由此可以得出堿性蛋白酶水解萌動苦蕎蛋白的最適溫度為45 ℃。

2.1.2 pH值對水解效果的影響

pH值對酶促反應的影響較大，如偏堿性或者偏酸性都有可能導致堿性蛋白酶的空間構象發生改變，從而使酶變性失活。在不同pH值條件下，底物的解離狀態會發生不同程度的改變，從而影響底物與酶的結合能力。此外，pH值對酶促反應的影響，還體現在可能影響酶分子鏈上的部分氨基酸側鏈的解離狀態，特別是影響酶催化活性所需的某些氨基酸側鏈基團的解離狀態，從而影響酶的活性。對于堿性蛋白酶的適宜pH值范圍為9.0～12.0。由圖3可知，在本試驗條件下，當pH值為10時，整個水解過程的水解度最高，由此可認為pH=10為堿性蛋白酶水解萌動苦蕎蛋白質的最適pH值。

2.1.3 加酶量對水解效果的影響

由圖4可知，在不同的加酶量條件下，蛋白質水解度不同，且隨著初始加酶量的提高而增大，但當加酶量達到一定數值后，其水解度的變化與最佳水解值相近并在一定范圍內波動。分析可知，本試驗條件下，加酶量的適宜范圍為2 000～4 000 U·g-1。

2.2 正交試驗結果分析

由表2可知，影響堿性蛋白酶水解萌動苦蕎蛋白試驗的因素由小到大分別為加酶量、溫度、pH值。分析K值得出的最佳的組合是A2B3C2，即溫度45 ℃，pH值為10.0，加酶量為3 000 U·g-1。與正交表中最優組合（A2B3C1、A2B1C2和A3B2C1）不一致，因此進行驗證性試驗。綜合考慮水解度、經濟效益和實用價值，最終確定A2B3C1為最佳組合，即堿性蛋白酶水解萌動苦蕎蛋白的最佳條件為溫度45 ℃、pH值為10.0、加酶量為2 000 U·g-1、水解120 min、底物濃度30 g·L-1。

3 結論

本文通過單因素和正交試驗優化堿性蛋白酶水解萌動苦蕎蛋白的水解條件，最終得出最佳的水解條件為溫度45 ℃，pH值10.0，加酶量2 000 U·g-1、水解120 min、底物濃度30 g·L-1，該條件下水解度為20.13%。

參考文獻

[1]余莎，甘國超，陳雪婷，等.涼山苦蕎麥的營養價值及苦蕎涼面的開發前景研究[J].現代食品，2023，29（3）：55-58.

[2]李楠，楊婷.不同干燥方式對萌芽苦蕎功能成分及抗氧化活性的影響[J].運城學院學報，2023，41（3）：41-45.

[3]李興美，何勇，唐再芬，等.苦蕎麥不同部位化學成分的測定[J].飼料研究，2023，46（4）：113-117.

[4]吳穎，王嘯，邱樹毅，等.響應面法優化苦蕎麥水溶性清蛋白提取工藝研究[J].食品研究與開發，2020，41（23）：105-111.

[5]國家食品藥品監督管理總局，國家衛生和計劃生育委員會.食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定：

GB 5009.5—2016[S].北京：中國標準出版社，2016.

[6]楊文博，張英華.蛋白質水解度的測定方法研究[J].中國調味品，2014（3）：88-90.

基金項目：四川省重點實驗室項目“苦蕎米抗性淀粉的影響因素及機理研究”（SZ22ZZ01）；西昌學院科研項目“苦蕎脂質分解相關酶的結構和酶活性特征研究”（YBZ202212）。