LncRNA FGD5.AS1靶向miR.16.5p/CREB1軸減輕缺氧/復氧誘導大鼠H9c2心肌細胞凋亡的機制研究

謝小芳 趙展慶 符妹垂

摘要 目的： 探究長鏈非編碼RNA（LncRNA）FGD5反義RNA1（FGD5.AS1）對缺氧/復氧（H/R）誘導的大鼠H9c2心肌細胞凋亡的影響以及對微小RNA.16.5p/cAMP響應元件結合蛋白1（miR.16.5p/CREB1）軸的調節機制。 方法： 將H9c2細胞分為對照組和H/R組（缺氧6 h，復氧6 h），然后將H/R組細胞分別進行轉染，分為oe.NC組、oe.FGD5.AS1組、oe.FGD5.AS1＋miR.16.5p mimic.NC組、oe.FGD5.AS1＋miR.16.5p mimic組。實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應法（RT.qPCR）檢測細胞中FGD5.AS1、miR.16.5p、CREB1的mRNA水平；蛋白免疫印跡（Western Blot）法測定裂解凋亡蛋白酶.3（cleaved Caspase.3）、B細胞淋巴瘤/白血病.2（Bcl.2） 和Bcl.2相關X蛋白（Bax）蛋白表達；CCK.8法測定細胞存活率；流式細胞術檢測細胞凋亡率；雙熒光素酶活性實驗分別驗證miR.16.5p 和FGD5.AS1、CREB1的靶向關系。 結果： 與對照組比較，H/R組細胞中FGD5.AS1和CREB1的mRNA水平、細胞存活率、Bcl.2蛋白表達降低（ P ＜0.05），miR.16.5p mRNA水平、細胞凋亡率及cleaved Caspase.3、Bax蛋白表達升高（ P ＜0.05）；與H/R組和oe.NC組比較，轉染過表達FGD5.AS1基因的H9c2細胞中FGD5.AS1和CREB1的mRNA水平、細胞存活率、Bcl.2蛋白表達增高，凋亡率及miR.16.5p、cleaved Caspase.3、Bax水平下降（ P ＜0.05）。雙熒光素酶活性實驗驗證了FGD5.AS1、CREB1均與miR.16.5p有結合位點。 結論： 過表達FGD5.AS1可能通過靶向下調miR.16.5p表達，上調CREB1表達，抑制H/R誘導的H9c2心肌細胞凋亡。

關鍵詞 ?缺氧/復氧；FGD5反義RNA 1；微小RNA.16.5p/cAMP響應元件結合蛋白1軸；心肌細胞凋亡

doi： ?10.12102/j.issn.1672.1349.2024.09.008

LncRNA FGD5.AS1 Targeting miR.16.5p/CREB1 Axis Alleviates Hypoxia/Reoxygenation Induced Apoptosis of Rat H9c2 Cardiomyocytes

XIE Xiaofang， ZHAO Zhanqing， FU Meichui

Hainan West Central Hospital， Danzhou 571700， Hainan， China

Corresponding Author ?FU Meichui， E.mail： fumeichui2022@163.com

Abstract Objective： To explore the effect of long non.coding RNA（LncRNA） FGD5 antisense RNA1（FGD5.AS1） on the apoptosis of rat H9c2 cardiomyocytes induced by hypoxia/reoxygenation（H/R） and the regulatory mechanism of microRNA.16.5p/cAMP response element.binding protein 1（miR.16.5p/CREB1） axis. ?Methods： H9c2 cardiomyocytes were divided into control group and H/R group（hypoxia for 6 h，reoxygenation for 6 h）.H/R group cells were transfected separately，then divided into oe.NC group，oe.FGD5.AS1 group，oe.FGD5.AS1＋miR.16.5p mimic.NC group，and oe.FGD5.AS1＋miR.16.5p mimic group.Real.time fluorescence quantitative reverse transcription polymerase chain reaction（RT.qPCR） was used to detect the mRNA levels of FGD5.AS1，miR.16.5p and CREB1 in cells.The expression of cleaved Caspase.3，B.cell lymphoma/leukemia.2（Bcl.2） and Bcl.2 associated X protein（Bax） were measured by Western Blot.Cell survival rate was measured by CCK.8 method.The apoptosis rate was detected by flow cytometry.The targeting relationship between miR.16.5p mRNA，FGD5.AS1 and CREB1 was verified by double luciferase activity assay. ?Results： Compared with the control group，mRNA levels of FGD5.AS1 and CREB1，cell survival rate，and Bcl.2 protein expression in H/R group decreased（ P ＜0.05），miR.16.5p mRNA levels，apoptosis rate，and cleaved Caspase.3 and Bax protein expressions increased（ P ＜0.05）.Compared with H/R group and oe.NC group，mRNA levels of FGD5.AS1 and CREB1，cell survival rate，Bcl.2 protein expression increased in H9c2 cells transfected with FGD5.AS1 gene overexpression，the apoptosis rate，levels of miR.16.5p，cleaved Caspase.3，and Bax decreased（ P ＜0.05）.Dual luciferase activity test verified that FGD5.AS1 and CREB1 had binding sites with miR.16.5p. ?Conclusion： Overexpression of FGD5.AS1 may inhibit H/R.induced apoptosis of H9c2 cardiomyocytes through targeted down.regulation of miR.16.5p expression and up.regulation of CREB1 expression.

Keywords ??hypoxia/reoxygenation; FGD5 antisense RNA 1; microRNA.16.5p/cAMP response element.binding protein 1 axis; myocardial ?cells apoptosis

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是由于動脈壁上斑塊形成導致心臟血流量減少引起的心臟病。心肌梗死有效的干預策略是缺血后再灌注，但再灌注會引起心肌缺血再灌注（I/R）損傷并可誘發氧化應激和炎性反應，進一步導致心肌細胞的凋亡和壞死 ?［1.2］ 。因此，減少心肌細胞凋亡是心肌I/R損傷預防和治療的關鍵。FGD5反義RNA 1（FGD5 antisense RNA 1，FGD5.AS1）是一種癌相關基因，也是急性心肌梗死發展中重要的長鏈非編碼RNA（long non.coding RNA，lncRNA），可通過靶向微小RNA（miRNAs）來調節心肌I/R損傷后的心肌細胞凋亡 ?［3］ 。miR.16.5p在心肌缺氧/復氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）中表現為上調，且可以被lncRNA海綿化來調節H/R誘導的心肌細胞損傷 ?［4］ 。環磷酸腺苷（cAMP）響應元件結合蛋白1（cAMP response element.binding protein 1，CREB1）是基因編碼的關鍵轉錄因子，可以作為miRNA的功能靶標調節心肌梗死誘導的心肌細胞凋亡 ?［5］ ，但其與miR.16.5p以及FGD5.AS1靶向關系的研究較少。因此，本研究基于miR.16.5p/CREB1軸探討FGD5.AS1影響H/R誘導的心肌細胞凋亡的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑

大鼠H9c2心肌細胞購于中國科學院典型培養會 保藏委員會細胞庫；過表達FGD5.AS1（oe.FGD5.AS1）、 ?miR.16.5p mimic、陰性對照oe.NC/miR.16.5p mimic.NC、 ?p.mirGLO.FGD5.AS1.WT/MUT、p.mirGLO.CREB1.WT/.MUT 質粒購于上海吉凱基因公司；Lipofectamine ?TM 3000轉染試劑購于北京百奧創新科技有限公司；HiScriptⅡ一 步法實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈式反應法 （RT.qPCR）SYBR綠色染料試劑盒購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；膜聯蛋白Ｖ.異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V.FITC/PI）細胞凋亡檢測試劑盒購于北京富百科生物技術有限公司；裂解凋亡蛋白酶.3（cleaved Caspase.3）、B細胞淋巴瘤/白血病.2（Bcl.2）和Bcl.2相關X蛋白（Bax）一抗購于英國Abcam公司；細胞活性檢測（CCK.8）試劑盒購于上海鈺博生物科技有限公司；羊抗兔IgG（H&L）購于武漢艾美捷科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞分組及處理

將大鼠H9c2細胞分為對照組和H/R組，對照組采用常規培養基培養，H/R組細胞先在缺氧培養箱中用不含血清的DMEM培養基培養6 h，再換成含10% 胎牛血清的DMEM培養基并在常氧培養箱中復氧 6 h ?［6］ 。然后，將H/R組細胞按照Lipofectamine ?TM 3000轉染試劑說明書進行轉染，分為H/R組（缺氧6 h，復氧6 h）、oe.NC組（轉染過表達FGD5.AS1陰性對 照）、oe.FGD5.AS1組（轉染過表達FGD5.AS1）、 oe.FGD5.AS1＋miR.16.5p mimic.NC組（共轉染過表 達FGD5.AS1和miR.16.5p mimic陰性對照）、 oe.FGD5.AS1＋miR.16.5p mimic組（共轉染過表達FGD5.AS1和miR.16.5p mimic），48 h后分別提取各 組細胞的RNA，檢測FGD5.AS1、miR.16.5p、CREB1 mRNA 表達情況，驗證轉染是否成功。

1.2.2 qRT.PCR測定FGD5.AS1、miR.16.5p和CREB1 mRNA表達

用Trizol從細胞中提取總RNA。采用HiScriptⅡ 一步法qRT.PCR SYBR綠色染料試劑盒進行RT.qPCR。 反應體系：Green Mix，10 μL；One Step SYBR Green Enzyme，1 μL；Forward Primer，0.4 μL；Reverse ?Primer，0.4 μL；RNA，1 μL；H 2O，7.2 μL。反應條件：95 ℃ 預變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40個循環。以甘油醛.3.磷酸脫氫酶（GAPDH）、U6為內參，采用2 ?－ΔΔCt 法計算目的基因的相對表達水平。引物序列見表1。

1.2.3 ?CCK.8測定細胞增殖活力

于96孔板（每孔5×10 3）每孔中所有培養細胞與10 mL CCK.8試劑在37 ℃下孵育2 h。用酶標儀在450 nm波長檢測吸光值，并計算細胞存活率。

1.2.4 流式細胞術測定細胞凋亡

用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌處理過的細胞2次，并調整濃度至2×10 5個細胞/mL。取100 μL樣品 （5×10 4個細胞）加入5 mL培養管，在管中分別加入 5 μL Annexin V.FITC和10 μL PI。將細胞輕輕旋轉，在25 ℃黑暗中孵育20 min。每管加1×結合緩沖液500 μL。采用流式細胞儀立即對細胞進行分析。

1.2.5 蛋白免疫印跡（Western Blot）法測定Bax、cleaved Caspase.3、Bcl.2蛋白表達

用RIPA裂解液從H9c2細胞中提取總蛋白。蛋白樣品用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS.PAGE）分離，并轉移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上。用5%脫脂牛奶阻斷非特異性結合位點2 h。印跡用cleaved Caspase.3、Bax、Bcl.2一抗（1∶2 000）進行 探針檢測。然后用辣根過氧化物酶（HRP）偶聯的二抗 （1∶500）室溫孵育1 h。用顯色試劑孵育3～5 s。用Image J軟件分析蛋白帶，并歸一化為甘油醛.3.磷酸脫氫酶（GAPDH）。

1.2.6 ?熒光素酶活性實驗檢測miR.16.5p與FGD5.AS1或CREB1 的靶向關系

StarBase數據庫預測結果顯示，miR.16.5p與 FGD5.AS1或CREB1存在結合位點。擴增FGD5.AS1和CREB1 片段，并將其插入到pmirGLO載體，建立FGD5.AS1野生型質粒（p.mirGLO.FGD5.AS1.WT）和CREB1野生型質粒（p.mirGLO.CREB1.WT）。然后通過基因突變技術將FGD5.AS1和CREB1突變，構建成FGD5.AS1突變型質粒（p.mirGLO.FGD5.AS1.MUT）和CREB1突變型質粒（p.mirGLO.CREB1.MUT）。將miR.16.5p mimic或miR.16.5p mimic.NC分別與相應的報告質粒共轉染H9c2細胞。轉染48 h后測定熒光酶活性。

1.3 統計學處理

采用GraphPad Prism 8.0軟件進行數據分析。符合正態分布的定量資料以均數±標準差（ x ?± s ）表示，采用單因素方差分析和SNK. q 檢驗。以 P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 FGD5.AS1、miR.16.5p、CREB1在各組H9c2細胞中的mRNA表達

相較于對照組，H/R組FGD5.AS1 mRNA、CREB1 ?mRNA 表達下降，miR.16.5p mRNA表達增加（ P ＜ 0.05）；與H/R組和oe.NC組比較，oe.FGD5.AS1組 FGD5.AS1 mRNA、CREB1 mRNA表達均升高， ?miR.16.5p mRNA表達降低（ P ＜0.05）；與oe.FGD5.AS1 和oe.FGD5.AS1＋miR.16.5p mimic.NC 組比較， oe.FGD5.AS1＋miR.16.5p mimic組FGD5.AS1 mRNA、CREB1 mRNA表達均降低，miR.16.5p mRNA表達升高（ P ＜0.05）。詳見表2。

2.2 過表達FGD5.AS1對細胞存活率和凋亡率的影響

H/R組與對照組比較，細胞存活率下降，凋亡率增高（ P ＜0.05）；oe.FGD5.AS1組與H/R組和oe.NC組 比較，存活率均增加，凋亡率均下降（ P ＜0.05）；與 ?oe.FGD5.AS1組和oe.FGD5.AS1＋miR.16.5p mimic.NC組 比較，oe.FGD5.AS1＋miR.16.5p mimic組細胞存活率均降低，凋亡率均升高（ P ＜0.05）。詳見圖1、表3。

2.3 ?過表達FGD5.AS1對細胞中凋亡相關蛋白的影響

與對照組比較，H/R組Bax、cleaved Caspase.3 蛋白表達上調，Bcl.2蛋白表達下調（ P ＜0.05）；與H/R 組和oe.NC組比較，oe.FGD5.AS1組Bax、cleaved ?Caspase.3 蛋白表達下調，Bcl.2蛋白表達上調（ P ＜0.05）； 與 ?oe.FGD5.AS1組和oe.FGD5.AS1＋miR.16.5p mimic.NC 組比較，oe.FGD5.AS1＋miR.16.5p mimic組Bax、cleaved Caspase.3蛋白表達上調，Bcl.2蛋白表達下調（ P ＜0.05）。詳見圖2、表4。

2.4 miR.16.5p與FGD5.AS1和CREB1之間的相互作用

StarBase數據庫預測的miR.16.5p與FGD5.AS1、 CREB1的作用位點如圖3所示。轉染miR.16.5p mimic導致轉染FGD5.AS1.WT或CREB1.WT的H9c2細胞熒光素酶活性下降（ P ＜0.05），這種效應被FGD5.AS1或CREB1基因的突變所消除。詳見圖4、圖5。

3 討 論

冠狀動脈的急性和持續性缺氧缺血會誘發心肌壞死，進而發生心肌梗死，最終導致心功能受損，并引起炎癥反應、細胞凋亡等一系列生理活動 ?［7］ 。因此，更好地了解參與心肌細胞凋亡的調節因子對研究治療心肌梗死的新靶點至關重要。越來越多的證據表明，lncRNA已經在多種器官的I/R損傷中檢測到lncRNA的異常表達。例如，lncRNA FGD5.AS1在急性心肌梗死病人和缺氧細胞中表達下調，而過表達FGD5.AS1增加了H/R處理的心肌細胞活性，降低了細胞凋 ?亡 ?［8.9］ 。本研究結果發現，H/R組細胞中FGD5.AS1 mRNA ???水平明顯低于對照組，而與H/R組比較，oe.FGD5.AS1組細胞中FGD5.AS1 水平、細胞存活率升高，凋亡率下降，表明FGD5.AS1可加速H/R心肌細胞增殖，減輕凋亡，然而其分子機制仍需深入探討。

目前，已經發現lncRNA可通過海綿化miRNAs，進一步調控相應靶基因的表達。miRNA作為關鍵的調節基因，可以與下游靶基因的3′.UTR結合以抑制靶基因表達 ?［10］ 。已有研究發現，miR.16.5p可以通過靶向IRS1增加心肌細胞活力并抑制H/R心肌細胞凋亡 ?［11］ 。CREB1是癌發生的相關因子，能夠促進癌細胞的增殖并抑制凋亡，而另一項研究發現，CREB1通過激活miR.376a.3p可以促進心力衰竭大鼠的心臟功能恢復 ?［12.13］ 。本研究結果顯示，oe.FGD5.AS1組細胞中miR.16.5p mRNA水平降低，CREB1 ?mRNA水平升高。揭示了FGD5.AS1過表達可能下調miR.16.5p表達，上調CREB1表達。已知cleaved Caspase.3是細胞發生凋亡Caspase.3被切割活化形成的，促凋亡蛋白Bax和抑制凋亡蛋白Bcl.2作為Bcl.2家族成員，也 是細胞凋亡的關鍵標志物 ?［14.15］ 。本研究結果發現， ?oe.FGD5.AS1組心肌細胞的凋亡率及cleaved Caspase.3、 Bax蛋白表達低于H/R組，細胞存活率和Bcl.2蛋白表達高于H/R組。而miR.16.5p mimic的恢復實驗發現，FGD5.AS1過表達對心肌細胞凋亡的抑制作用被逆轉，且StarBase數據庫預測及熒光素酶報告基因實驗均顯示FGD5.AS1、CREB1與miR.16.5p之間均存在靶向關系，揭示了FGD5.AS1過表達抑制H/R誘導 的H9c2心肌細胞凋亡可能是通過靶向下調miR.16.5p 表達，上調CREB1表達實現的。

綜上所述，FGD5.AS1過表達可通過靶向調控miR.16.5p/CREB1軸來抑制H/R誘導的H9c2心肌細胞凋亡，可能是心肌梗死等心血管疾病治療的潛在靶點。然而，本研究未進行FGD5.AS1的敲低實驗，缺乏對比，且分子機制研究不夠深入，有待后續探討。

參考文獻：

［1］ ??LIU X J， LV Y F，CUI W Z， et al. Icariin inhibits hypoxia/reoxygenation.induced ferroptosis of cardiomyocytes via regulation of the Nrf2/HO.1 signaling pathway［J］.FEBS Open Bio，2021，11（11）：2966.2976.

［2］ ?HUANG Z Q， XU W，WU J L， et al. MicroRNA.374a protects against myocardial ischemia.reperfusion injury in mice by targeting the MAPK6 pathway［J］.Life Sciences，2019，232：116619.

［3］ ??CAI X Y， ZHANG P，WANG S， et al. lncRNA FGD5 antisense RNA 1 ?upregulates RORA to suppress hypoxic injury of human cardiomyocyte cells by inhibiting oxidative stress and apoptosis via miR.195［J］.Molecular Medicine Reports，2020，22（6）：4579.4588.

［4］ ?GONG J， DOU L Q，ZHOU Y.Positive feedback loop of lncRNA SNHG1/miR.16.5p/GATA4 in the regulation of hypoxia/reoxygenation.induced cardiomyocyte injury［J］.Molecular Medicine Reports，2022，25（1）：28.

［5］ ?YANG J B， LIU S W，WANG H， et al. MiR.134.5p inhibition reduces infarct.induced cardiomyocyte apoptosis via Creb1 upregulation［J］.Journal of Stroke and Cerebrovascular Diseases，2020，29（8）：104850.

［6］ ?CONG L， SU Y S，WEI D Z， et al. Catechin relieves hypoxia/reoxygenation.induced myocardial cell apoptosis via down.regulating lncRNA MIAT［J］.Journal of Cellular and Molecular Medicine，2020，24（3）：2356.2368.

［7］ ?WANG J H ，CHEN X，HUANG W.MicroRNA.369 attenuates hypoxia.induced cardiomyocyte apoptosis and inflammation via targeting TRPV3［J］.Brazilian Journal of Medical and Biological Research，2021，54（3）：e10550.

［8］ ?CHEN Y Q， YANG X，XU W， et al. Knockdown of lncRNA TTTY15 alleviates myocardial ischemia.reperfusion injury through the miR.374a.5p/FOXO1 axis［J］.IUBMB Life，2021，73（1）：273.285.

［9］ ?HAO L， WANG J，BI S J， et al. Upregulation of long noncoding RNA FGD5.AS1 ameliorates myocardial ischemia/reperfusion injury via microRNA.106a.5p and microRNA.106b.5p［J］.Journal of Cardiovascular Pharmacology，2021，78（1）：e45.e54.

［10］ ?LIAO Z F ，CHEN Y L，DUAN C C， et al. Cardiac telocytes inhibit cardiac microvascular endothelial cell apoptosis through exosomal miRNA.21.5p.targeted cdip1 silencing to improve angiogenesis following myocardial infarction［J］.Theranostics，2021，11（1）：268.291.

［11］ ?TORO R， PREZ.SERRA A，MANGAS A， et al. MiR.16.5p suppression protects human cardiomyocytes against endoplasmic reticulum and oxidative stress.induced injury［J］.International Journal of Molecular Sciences，2022，23（3）：1036.

［12］ ?ZHANG C， WANG Q，ZHOU X W， et al. MicroRNA.138 modulates glioma cell growth，apoptosis and invasion through the suppression of the AKT/mTOR signalling pathway by targeting CREB1［J］.Oncology Reports，2020，44（6）：2559.2568.

［13］ ?ZHANG T， GE J J.Mechanism of CREB1 in cardiac function of rats with heart failure via regulating the microRNA.376a.3p/TRAF6 axis［J］.Mammalian Genome，2022，33（3）：490.501.

［14］ ?ESKANDARI E ，EAVES C J.Paradoxical roles of caspase.3 in regulating cell survival，proliferation，and tumorigenesis［J］.The Journal of Cell Biology，2022，221（6）：e202201159.

［15］ ?VARDIYAN R ，EZATI D，ANVARI M， et al. Effect of L.carnitine on the expression of the apoptotic genes Bcl.2 and Bax［J］.Clinical and Experimental Reproductive Medicine，2020，47（3）：155.160.

（收稿日期：2022.11.28）

（本文編輯 鄒麗）