TET2重塑CXCR4 DNA甲基化對急性心肌梗死小鼠心肌組織自噬、炎癥反應及凋亡的影響

毛山 周明 段班燕 曹政 李軍

摘要 目的： 探究急性心肌梗死（AMI）過程中內皮細胞 tet甲基胞嘧啶雙加氧酶2（TET2）對趨化因子受體4（CXCR4）DNA甲基化的影響以及對AMI小鼠心肌組織自噬、炎癥反應及組織細胞凋亡的影響機制，為臨床探究AMI發展的分子機制提供理論依據。 方法： 8周齡雄性C57/BL6小鼠50只，制備AMI模型，尾部注射TET2、CXCR4過表達質粒；蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測心肌組織TET2、CXCR4、微管相關蛋白3（LC3）、P62、B細胞淋巴瘤/白血病.2基因 （Bcl.2）關聯X蛋白（Bax）、半胱氨酸蛋白酶3（Caspase.3）、 Bcl.2表達；甲基化檢測CXCR4 DNA甲基化水平；酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測心肌組織內炎性因子白細胞介素.6（IL.6）、腫瘤壞死因子.α（TNF.α）、白細胞介素.1β（IL.1β）水平；原位末端轉移酶標記技術（TUNEL）檢測各組心肌組織細胞凋亡指數。 結果： 與假手術組比較，模型組心肌組織內TET2、CXCR4均表達上調，TET2、CXCR4均在心肌組織內過表達，TET2過表達促進CXCR4表達，差異有統計學意義（ P ＜0.05）；與模型組比較，TET2 mimic組CXCR4啟動子區域DNA甲基化程度降低，CXCR4蛋白表達升高，差異有統計學意義（ P ＜0.05）；與假手術組比較，模型組小鼠心肌組織自噬蛋白LC3、抑制細胞凋亡蛋白Bcl.2表達下調，炎性因子IL.6、TNF.α、IL.1β水平、自噬蛋白P62、促細胞凋亡蛋白Bax、cleaved Caspase.3表達上調，差異有統計學意義（ P ＜0.05）；TET2、CXCR4過表達進一步下調LC3、Bcl.2蛋白表達，上調炎性因子IL.6、TNF.α、IL.1β水平，P62、Bax、cleaved Caspase.3蛋白表達；TET2、CXCR4二者聯合體現出最低LC3、Bcl.2蛋白表達，最高炎性因子IL.6、TNF.α、IL.1β水平以及P62、Bax、cleaved Caspase.3蛋白表達，差異有統計學意義（ P ＜0.05）。 結論： AMI發展中，TET2通過降低CXCR4 DNA甲基化，促進CXCR4基因表達，進而抑制AMI小鼠心肌組織自噬，上調炎癥反應及細胞凋亡程度，促進疾病發展。

關鍵詞 ?急性心肌梗死；tet甲基胞嘧啶雙加氧酶2；趨化因子受體4；DNA甲基化；自噬；炎癥反應；凋亡

doi： ?10.12102/j.issn.1672.1349.2024.09.007

Effects of CXCR4 DNA Methylation Remodeled by TET2 on Autophagy， Inflammation and Apoptosis of Myocardial Tissue in Mice with Acute Myocardial Infarction

MAO Shan， ZHOU Ming， DUAN Banyan， CAO Zheng， LI Jun

Taihe Hospital， Shiyan 442000， Hubei， China， E.mail： geshan2786397679@163.com

Abstract Objective： To explore the effect of tet methylcytosine dioxygenase 2（TET2） on DNA methylation of C.X.C motif receptor 4（CXCR4） during acute myocardial infarction（AMI），and the mechanism of its effect on myocardial autophagy，inflammation and apoptosis in AMI mice. ?Methods： Fifty 8.week.old male C57/BL6 mice ?AMI model were prepared，TET2 and CXCR4 overexpressing plasmids were injected into the tail.The expressions of TET2，CXCR4，microtubule associated protein 3（LC3），P62，B.cell lymphoma/leukemia.2 gene（Bcl.2） associated X protein（Bax），Caspase.3，and Bcl.2 in cardiac tissue were detected by Western Blot.The methylation level of CXCR4 DNA was detected.The levels of inflammatory factors interleukin.6（IL.6），tumor necrosis factor.α（TNF.α） and interleukin.1β（IL.1β） in myocardial tissue were detected by enzyme.linked immunosorbent assay（ELISA）.Terminal deoxyribonucleotidyl transferase（TdT）.mediated dUTP nick end labeling（TUNEL） was used to detect apoptosis index of myocardial tissue in each group. ?Results： Compared with sham operation group，the expressions of TET2 and CXCR4 ?up.regulated in myocardial tissue of model group，and both TET2 and CXCR4 ?overexpressed in myocardial tissue，and overexpression of TET2 promoted CXCR4 expression（ P ＜0.05）.Compared with model group，DNA methylation of CXCR4 promoter region decreased and CXCR4 protein expression increased in TET2 mimic group（ P ＜0.05）.Compared with sham operation group，expressions of autophagy protein LC3 and apoptosis inhibiting protein Bcl.2 ?down.regulated in myocardial tissue of mice in model group，and levels of inflammatory factors IL.6，TNF.α，IL.1β，autophagy protein P62，pro.apoptotic protein Bax，cleaved Caspase.3 ?up.regulated（ P ＜0.05）.Overexpression of TET2 and CXCR4 further down.regulated the expression of LC3 and Bcl.2 proteins，up.regulated the levels of inflammatory factors IL.6，TNF.α，IL.1β，and expression of P62，Bax，cleaved Caspase.3 proteins.TET2 and CXCR4 ?showed the lowest LC3 and Bcl.2 protein expression，the highest inflammatory factors IL.6，TNF.α，IL.1β levels，P62，Bax，cleaved Caspase.3 protein expression（ P ＜0.05）. ?Conclusion： In the development of AMI，TET2 can promote CXCR4 gene expression by reducing CXCR4 DNA methylation，thereby inhibiting myocardial autophagy in AMI mice，up.regulating inflammatory response and apoptosis，and promoting the development of the disease.

Keywords ?acute myocardial infarction; tet methylcytosine dioxygenase 2; C.X.C motif receptor 4; DNA methylation; autophagy; inflammatory response; apoptosis

急性心肌梗死（acute mycardial infarction，AMI）是臨床上常見的心血管疾病之一，AMI起病較急，病死率高，病人預后差，一直是科研工作者研究的重大課題 之一 ?［1.2］ 。心肌梗死后出現的組織損傷會迅速地激活免疫系統，產生炎癥反應，梗死的心肌組織產生的促炎性因子如白細胞介素、腫瘤壞死因子等進一步激活白細胞整合素，從而吸引大量的炎性細胞進入到梗死區域。炎癥反應是心臟修復的必經過程，可以促進梗死心肌組織的清除及心室重塑，然而過度的炎癥反應又會加重組織的損傷，促進心肌細胞凋亡，影響心臟修復 ?［3.4］ 。自噬在維持心臟正常結構和功能方面有重要作用，有效的自噬反應可促進心肌細胞對抗氧化應激性損傷，發揮保護作用，缺乏自噬或低效率的自噬可導致心臟擴大及心肌受損，進一步加重心肌細胞凋亡等。因此，心肌組織自噬、炎癥反應、心肌細胞凋亡及趨化因子水平均為研究AMI作用機制的有效切入點 ?［5］ 。

DNA甲基化、乙酰化、糖基化以及磷酸化等表觀遺傳學在諸多疾病的發生發展中發揮重要作用，調控基因表達，DNA的甲基化在AMI的病理機制中具有重要作用 ?［6.7］ 。研究顯示，趨化因子受體4（CXCR4）在炎癥或損傷的組織中表達上調，同時可吸引免疫細胞到炎癥組織參與炎癥反應，目前關于CXCR4甲基化在AMI中的調控機制尚不清楚 ?［8.10］ 。 tet甲基胞嘧啶雙加氧酶2（tet methylcytosine dioxygenase 2，TET2）作為一種重要的表觀遺傳修飾酶，在抗感染炎癥免疫應答及炎癥消退過程中發揮重要作用 ?［11］ 。病原體微生物入侵后，TET2在炎癥免疫活化中被誘導升高，促進免疫細胞的分化擴增和免疫應答；炎癥后期，可反饋性地抑制炎性因子的轉錄和分泌，促進炎癥消退，所以，TET2是炎癥類疾病重要的候選基因之一 ?［12.13］ 。TET2在表觀遺傳學中的調控作用可觀，可以通過基因的甲基化來調控下游靶向基因的表達，致廣泛的DNA甲基化，進而對疾病發生發展過程起到調控作用。本研究探討TET2對CXCR4 DNA甲基化及基因表達的影響，分析TET2/CXCR4軸對AMI小鼠心肌組織自噬、炎癥反應及凋亡的影響機制。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

8周齡雄性C57/BL6小鼠50只，購自湖北省實驗動物中心，實驗動物許可證號：SCXK（鄂）2023.0089。術前小鼠均自由飲水、進食，分籠飼養，溫度25～27 ℃及濕度40%～50%。

1.2 主要實驗試劑

胎牛血清、胰蛋白酶購自上海鈺博生物科技有限公司；甘油明膠封片劑、二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定盒、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS.PAGE）凝膠設備、電泳緩沖液、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜、增強化學發光法（ECL）檢測試劑盒等均購 自美國Gibco公司；白細胞介素（IL）.6、腫瘤壞死因子.α （TNF.α）、IL.1β酶聯免疫吸附法（euzymelinked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自阿拉丁化學試劑有限公司；兔抗鼠TET2抗體、CXCR4抗體、兔抗鼠B細胞淋巴瘤/白血病.2（Bcl.2）相關X蛋白（Bax）、兔抗鼠Bcl.2、兔抗鼠cleaved 半胱氨酸蛋白酶.3（Caspase.3）、兔抗鼠微管相關蛋白3（LC3）抗體、兔抗鼠P62抗體、甘油醛.3.磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體均購自美國ABC公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記二抗購自上海碧云天有限公司；Lipofectamine2000、TET2、CXCR4模擬物及陰性對照均購自上海吉瑪公司。

1.3 主要實驗儀器

流式細胞儀、全自動生化檢測儀、實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT.PCR）測試儀、RT.100酶標儀、Mini PRO 型電泳儀及轉膜儀、電泳槽、凝膠成像系統、超凈工作臺、倒置顯微鏡均購自美國Beckman公司，臺式高速離心機、微量可調節儀器等均購自美國Beckman公司；小動物呼吸機購自蘇州化學設備有限公司。

1.4 實驗分組

50只8周齡雄性C57/BL6小鼠按照隨機數字表法將其分為假手術組、模型組、TET2 過表達質粒（mimic）組、CXCR4 mimic組、TET2＋CXCR4 mimic組，每組10只。

1.5 AMI的建立 ?［14］

除假手術組外，各實驗組小鼠連接心電圖，氣管插管，連接小動物呼吸機，通氣，頻率控制在150次/min，其呼氣、吸氣的時間比為5∶4；于左胸第3肋間或第4肋間開胸，暴露心臟，在左心耳與肺動脈圓錐間，以左冠狀動脈主干為標志，采用8.0號縫線針穿刺結扎左前降支（LAD）；觀察小鼠心電圖，以心電圖Ⅱ導聯出現ST段抬高及肉眼觀察結扎區域以下組織變白等心肌缺血表現確定為結扎成功的標志；之后逐層關胸。假手術組小鼠只開胸，不結扎LAD。

1.6 藥物干預

在AMI模型建立后，每天給予各組小鼠尾部靜脈注射相應的TET2 mimic（5 μmol/L）、CXCR4 mimic（5 μmol/L）；干預 周期為2周，術后處死小鼠，留取心肌組織用于后續實驗。

1.7 ELISA檢測炎性因子IL.6、TNF.α、IL.1β水平

收集小鼠心肌組織懸浮液20 μL，采用ELISA法在酶標儀于450 nm波長處檢測IL.6、TNF.α、IL.1β因子水平。

1.8 ?DNA斷裂的原位末端標記（TUNEL）檢測細胞凋亡

在酶介導的作用下，采用熒光素化的dUTP標記與DNA斷裂的3.OH末端，采用過氧化物酶連接到DNA的斷點，加入熒光顯色劑和4′，6.二脒基.2.苯基吲哚（DAPI）顯色；于波長465～495 nm處在熒光顯微鏡下對心肌細胞的凋亡進行數據分析；根據相關數據分析，活細胞核呈彌散均勻熒光，出現細胞凋亡時，細胞核或細胞質內可見濃染致密的顆粒塊狀綠色熒光；最后計算心肌細胞平均凋亡指數（AI）。

1.9 CXCR4 DNA甲基化檢測

重亞硫酸鹽處理DNA后，未甲基化的細胞嘧啶變為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶始終不變。由此設計兩對甲基化特異性聚合酶鏈式反應（MSP）引物，通過在線甲基化軟件分析確定CXCR4基因啟動子與外顯子區域存在多個CpG島。CXCR4.MSP.M正向引物為5′.CTCCTGGACCTGGACCTGGGA.3′，反向引物為 5′.ACTGGGACCTGGACCTGGGAT.3′；CXCR4.MSP.U 正向引物為5′.ACTGGACCTGGACCTGGGAAT.3′，反向引物為5′.TCCTGGACCTGGGACCTGAATG.3′；引物序列由上海吉馬公司合成。

取腎臟組織，制備組織懸浮液，采用Trizol法提取總RNA，采用紫外分光光度計測定RNA濃度，參照反轉錄試劑盒將RNA合成cDNA，嚴格按照RT.PCR檢測試劑盒說明書的配置反應體系，將其置于實時熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）檢測儀檢測；RT.PCR反應條件為95 ℃預變性5 min，循環1次，95 ℃預變性15 s，60 ℃下退火60 s，72 ℃延伸30 s，循環40次，待PCR反應結束后亞硫酸鹽轉換DNA后再進行純化。采用2 ?－ΔΔCt 法計算CXCR4 DNA甲基化的相對表達量。

1.10 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測相關蛋白表達

取材后加入放射免疫沉淀法裂解緩沖液（radio immunoprecipitation assay lysis buffer，RIPA）進行組織勻漿裂解，提取蛋白質，上樣蛋白緩沖溶液，進行SDS.PAGE電泳分離蛋白，將檢測蛋白轉移到PVDF膜上，采用5%的脫脂牛奶封閉2.5 h，非離子型去污劑（TBST）清洗3次；將PVDF膜與一抗在5 ℃下孵育過夜，采用TBST清洗；PVDF膜與熒光二抗孵育1.5 h，經TBST清洗后采用紅外成像系統進行掃描，采用Image軟件進行灰度分析；其中一抗稀釋比例為： TET2為1∶1 000，CXCR4為1∶1 000，Bax為1∶1 500， Bcl.2為1∶1 000，cleaved Caspase.3為1∶1 000，LC3為1∶1 500，P62為1∶1 500。

1.11 統計學處理

采用GraphPad Prism 8.0軟件進行數據分析。符合正態分布的定量資料以均數±標準差（ x ?± s ）表示，兩組間比較采用 t 檢驗，多組間比較采用One.way ANOVA分析。以 P ＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 ?各組小鼠心肌組織內TET2、CXCR4蛋白表達比較

與假手術組比較，模型組小鼠心肌組織內TET2、CXCR4蛋白表達上調（ P ＜0.05）；TET2、CXCR4在心 肌組織內過表達，TET2過表達促進CXCR4表達 （ P ＜0.05）。詳見圖1、圖2。

2.2 TET2重塑AMI小鼠心肌組織內CXCR4 DNA甲基化相對表達量

MSP實驗顯示，與模型組比較，TET2 mimic組CXCR4啟動子區域DNA甲基化程度降低，CXCR4蛋白表達升高，差異有統計學意義（ P ＜0.05）。詳見圖3、圖4。

2.3 TET2重塑CXCR4 DNA甲基化對心肌組織自噬的影響

與假手術組比較，模型組小鼠心肌組織自噬蛋白 LC3表達下調，P62表達上調，差異有統計學意義（ P ＜ 0.05）；TET2、CXCR4過表達下調LC3，上調P62，差異有統計學意義（ P ＜0.05）；TET2、CXCR4二者過表達進一步下調LC3表達，進一步上調P62表達，差異有統計學意義（ P ＜0.05）。詳見圖5、圖6。

2.4 TET2重塑CXCR4 DNA甲基化對心肌組織炎癥反應的影響

與假手術組比較，模型組小鼠心肌組織炎性因子IL.6、TNF.α、IL.1β水平升高，差異有統計學意義（ P ＜0.05）；TET2、CXCR4過表達上調IL.6、TNF.α、IL.1β水平，差異有統計學意義（ P ＜0.05）；TET2、CXCR4二者過表達進一步上調IL.6、TNF.α、IL.1β因子水平，差異有統計學意義（ P ＜0.05）。詳見表1。

2.5 TET2重塑CXCR4 DNA甲基化對心肌組織凋亡的影響

2.5.1 細胞凋亡

與假手術組比較，模型組小鼠心肌組織凋亡指數上調，差異有統計學意義（ P ＜0.05）；TET2、CXCR4過 表達進一步上調凋亡指數，差異有統計學意義（ P ＜ 0.05）；TET2、CXCR4二者過表達進一步提升心肌組織凋亡指數，差異有統計學意義（ P ＜0.05）。詳見圖7、圖8。

2.5.2 凋亡相關蛋白表達

與假手術組比較，模型組小鼠心肌組織內促凋亡 蛋白Bax、cleaved Caspase.3表達上調，抑凋亡蛋白Bcl.2表達下調，差異有統計學意義（ P ＜0.05）；與模型組比較，TET2、CXCR4過表達進一步上調Bax、cleaved Caspase.3表達，下調Bcl.2表達，差異有統計學意義（ P ＜0.05）；TET2、CXCR4二者過表達進一步提升心肌組織內Bax、cleaved Caspase.3表達，降低Bcl.2表達，差異有統計學意義（ P ＜0.05）。詳見圖9、圖10。

3 討 論

心室重塑是導致機體心功能失代償最為重要的機制，且多種因子參與心肌細胞的炎癥、凋亡及自噬等過程 ?［15］ 。心肌梗死后心室重塑的重要表現為心肌的纖維化和細胞凋亡，如何有效地減少心肌細胞凋亡，降低炎癥反應，有效地控制心室重塑，仍然是臨床治療的難題之一，探索心肌梗死發生發展的有效靶點藥物具有重要的意義 ?［16］ 。目前，TET2已經被證實是維持胚胎纖維細胞多項功能的關鍵轉錄因子靶點，在多種組織中廣泛表達 ?［17］ 。TET2基因的多個突變位點與造血系統的惡性腫瘤發生發展密切相關；TET2基因突變與炎癥反應的免疫調控密切相關，提示TET2可能參與心肌梗死發展及心室重塑的病理過程 ?［18.19］ 。本研究對AMI小鼠進行TET2過表達慢病毒尾部注射處理，結果顯示，TET2在AMI小鼠體內成功過表達，且TET2的過表達可明顯促進AMI的病理發展過程，是AMI發展的促進性因子。

DNA甲基化是基因表達的調控方式之一，研究表明，TET家族可通過介導DNA甲基化表達來調控其基因的含量表達 ?［20］ 。TET基因家族在胚胎發育過程中就與造血系統疾病、實體瘤的進展密切相關，同時在預后判斷中發揮積極作用。然而，目前相關學者對TET家族基因調控的下游靶點以及關于TET基因家族自身表達的調控機制認識都相對局限，關于TET家族成員及其所介導的DNA甲基化在機體生長發育與疾病發生發展中的生物學機制尚需進一步研究 ?［21］ 。CXCR4是G蛋白偶聯受體家族的成員之一，與磷脂酰肌醇3激酶、核轉錄因子κB、活化的T細胞核轉錄因子、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路等密切相關 ?［22］ 。CXCR4甲基化已經被證實可以充分參與到血液系統疾病中，同時與炎癥免疫源性疾病的發展密切相關，盡管目前CXCR4 DNA的甲基化在諸多疾病中被相繼報道，但是其在AMI發展過程中作用的報道較少 ?［23］ 。基于此，本研究探討了TET2重塑CXCR4 DNA甲基化的相關研究，結果顯示，TET2基因的過表達可以促進CXCR4的表達，同時TET2過表達組CXCR4啟動子區域DNA甲基化程度降低，CXCR4蛋白表達升高，提示TET2通過抑制CXCR4 DNA甲基化來升高CXCR4基因在AMI小鼠心肌組織中的表達，進而對其心室重塑的病理學特征進行調控。

AMI發生后，心肌組織周圍會有IL.1β、TNF.α、IL.6 等炎性因子浸潤，誘導炎性細胞的趨化性行為，進一步擴散至損傷的心肌組織。強烈的炎癥反應可導致心肌組織細胞的凋亡加重，梗死區域面積擴大 ?［24］ 。本研究結果顯示，TET2、CXCR4過表達均可以進一步提高AMI小鼠心肌組織的炎癥反應，IL.1β、TNF.α、IL.6水平明顯升高，同時可以升高心肌組織細胞的凋亡能力，升高凋亡指數、促進凋亡蛋白Bax及cleaved Caspase.3蛋白的表達，提示TET2通過抑制CXCR4 DNA甲基化來促進AMI小鼠心肌組織炎癥反應的程度，加重心肌組織細胞凋亡，促進疾病的發展。研究表明，自噬在維持機體心臟正常結構和功能方面具有重要作用，可充分降解自身受損細胞器和部分蛋白質等，進而可實現再循環利用 ?［25］ 。有效的自噬作用可使心肌細胞應對外來損傷，在心肌梗死后心室重塑過程中起到保護作用。而缺乏自噬或降低效率的自噬均可進一步加重AMI后心室重塑現象，使其心功能進一步受損 ?［26］ 。本研究結果顯示，TET2、CXCR4過表達均可以降低心肌細胞的自噬能力，抑制LC3的表達，促進P62表達，提示TET2通過抑制CXCR4 DNA甲基化來抑制AMI小鼠心肌組織自噬程度，加重心肌組織細胞凋亡，促進疾病的發展。

綜上所述，在AMI的發展過程中，TET2通過降低CXCR4 DNA甲基化，促進CXCR4基因表達，進而抑制AMI小鼠心肌組織自噬，上調炎癥反應及細胞凋亡程度，促進疾病發展；TET2通過CXCR4 DNA甲基化在心肌梗死后心室重塑過程中發揮重要作用，有望從表觀遺傳的角度為治療心肌梗死后心室重塑提供理論依據和藥物作用靶點。

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（收稿日期：2022.10.29）

（本文編輯 鄒麗）