基于RNA-Seq技術對不同品種豬排卵前卵泡差異表達基因的篩選與注釋

劉林清 李慶崗 蘇世廣 周梅 張威 王重龍

摘要 ［目的］篩選淮豬和大約克豬排卵前卵泡組織差異表達基因。［方法］采集淮豬和大約克豬各3頭的排卵前卵泡，提取RNA，個體獨立建庫。采用RNA測序技術以及GO和pathway方法對所獲序列進行顯著性富集分析。［結果］測序后，獲得的淮豬clean reads數分別為 85 958 912、91 701 082、84 448 828，其中有效Reads數分別達到98.39%、98.59%、96.04%；獲得的大約克豬clean reads數分別為87 914 166、80 480 542、85 994 612，其中有效reads數分別達到98.61%、96.95%、98.80%，測序飽和度良好（證明測序數據真實可靠）。結果表明，篩選到上調基因67個，下調基因54個。GO和 Pathway分析發現，差異表達基因富集在繁殖過程、生長過程和代謝過程及WNT信號通路、卵巢類固醇生成通路和類固醇生物合成通路等。［結論］獲得了豬排卵前卵泡基因表達譜，并篩選到與繁殖性狀相關的關鍵候選基因。

關鍵詞 淮豬；大約克豬；RNA-Seq；差異表達基因

中圖分類號 S828? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2024）11-0076-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.11.016

Screening and Annotation of Differentially Expressed Genes in Preovulatory Follicles of Different Breeds of Pigs Based on RNA-Seq Technology

LIU Lin-qing， LI Qing-gang， SU Shi-guang et al

（Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Anhui Academy of Agricultural Sciences/Anhui Provincial Key Laboratory of Livestock and Poultry Product Safety Engineering， Hefei， Anhui 230031）

Abstract ［Objective］This study aimed to find differentially expressed genes in preovulatory follicles of Huai pig and Yorkshire pig. ［Method］This study collected preovulatory follicles from three Huai pig and three Yorkshire pig， respectively， extracted RNA and established individual independent libraries. RNA-Seq technology was used to conduct high-throughput Transcriptome sequencing of the sample library， and the obtained sequences were analyzed for GO and pathway significance enrichment. ［Result］The number of clean reads obtained from Huai pigs was 85 958 912，91 701 082，84 448 828， with effective reads reaching 98.39%， 98.59%， and 96.04%， respectively; the number of clean reads obtained from the large Yorkshire pig was 87 914 166，80 480 542，85 994 612， with effective reads reaching 98.61%， 96.95%， and 98.80%， respectively. The high saturation degree of sequencing demonstrated that the data were realistic and reliable.The results showed that 67 upregulated genes and 54 down regulated genes were screened. GO and Pathway analysis found that differentially expressed genes were enriched in the reproductive， growth， and metabolic processes， as well as the WNT signaling pathway， ovarian steroid production pathway， and steroid biosynthesis pathway.? ［Conclusion］This study obtained the gene expression profiling of porcine preovulatory follicles and identified novel candidate genes for reproductive traits.

Key words Huai pig;Yorkshire pig;RNA-Seq;Differentially expressed genes

基金項目 2022年度畜禽產品安全工程安徽省重點實驗室青年人才托舉工程創新引導資金（XMT2022-09）；安徽省財政農業種質資源保護與利用資金項目；安徽省學術和技術帶頭人后備人選項目（2022H300）；安徽省科技特派團項目；安徽省生豬產業技術體系項目（AHCYJSTX-05-12， AHCYJSTX-05-23）。

作者簡介 劉林清（1980—），女，山東萊蕪人，助理研究員，博士，從事豬的遺傳育種研究。

*通信作者，研究員，博士，從事豬遺傳育種和健康養殖研究。

收稿日期 2023-10-17；修回日期 2023-11-13

繁殖性狀尤其是產仔數性狀是養豬業重要的生產性狀，是豬的商業化品系選育中的重要選育指標，直接關系到養豬產業的經濟效益。作為復雜的數量性狀，產仔數遺傳力較低，且影響因素很多。中外豬種在繁殖性狀方面存在顯著差異［1］，隨著后基因組時代的來到，應用最廣泛的技術之一是轉錄組學［2］。該技術已經應用于水稻［3］、海鱸魚［4］、小鼠［5］ 等的RNA測序。并有研究者利用該項測序技術篩選出了不同豬種間的差異表達基因，并進行了相應的分析［6］。利用組學技術篩選該類性狀的功能候選基因具有重要意義。因此，筆者選取淮豬和大約克豬的卵巢進行了RNA-Seq分析，旨在挖掘在卵泡發育、排卵過程中瞬時表達的關鍵基因，從而為完善與豬卵泡生長發育、排卵的基因調控及其復雜的調控網絡提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采集經孕馬血清促性腺激素（PMSG）和絨毛膜促性腺激素（HCG）處理后的4月齡淮豬和6月齡大約克豬的成熟卵泡組織各3頭，-80 ℃貯存。

1.2 卵泡RNA的提取與測序

將采集的組織直接送交廣州基迪奧生物科技有限公司提取RNA，并進行RNA測序。

1.2.1 Trizol 法提取卵泡總RNA。

Trizol 試劑是直接從細胞卵泡組織中提取總RNA 的試劑，其在破碎和溶解細胞時能保持RNA 的完整性。裂解細胞并釋放出RNA，加入氯仿后離心，樣品分成水樣層和有機層。酸性條件可使RNA 與DNA 分離，RNA 存在于水樣層中。收集上面的水樣層后，RNA 可以通過異丙醇沉淀來還原。

1.2.2 RNA質量檢測。

主要進行3種檢測，即瓊脂糖凝膠電泳、Nanodrop 微量分光光度計檢測和Agilent 2100 檢測。

1.2.3 RNA-seq文庫構建。

通過帶有Oligo（dT）的磁珠富集具有polyA尾巴的真核mRNA后，用超聲波把mRNA打斷。以片段化的mRNA為模版，隨機寡核苷酸為引物，在M-MuLV逆轉錄酶體系中合成cDNA第1條鏈，隨后用RNaseH降解RNA鏈，并在DNA polymerase I 體系下，以dNTPs為原料合成cDNA第2條鏈。純化后的雙鏈cDNA經過末端修復、加A尾并連接測序接頭，用AMPure XP beads篩選200 bp左右的cDNA，進行PCR擴增并再次使用AMPure XP beads純化PCR產物，最終獲得文庫。文庫構建質量檢測標準如下：

①瓊脂糖凝膠電泳：分析樣品RNA完整性及是否存在DNA污染；

②NanoPhotometer spectrophotometer：檢測RNA純度（OD260/280及OD260/230）；

③Qubit 2.0 Fluorometer：RNA濃度精確定量；

④Agilent 2100 bioanalyzer：精確檢測RNA完整性。

1.3 數據分析

1.3.1 原始數據處理。利用fastp［7］進行質控，并進行reads過濾，步驟如下：

①去除含adapter 的reads；②去除含N 比例大于10%的reads；③去除全部都是A堿基的reads；④去除低質量reads（質量值Q≤20 的堿基數占整條read 的50％以上）。

1.3.2 差異基因的篩選。使用edgeR［8］軟件分析獲得的read counts數據，篩選FDR<0.05 且|log2FC|>1的基因為顯著差異基因。

1.3.3 GO功能顯著性富集。利用GO數據庫，獲得差異表達基因中顯著富集的GO條目。

1.3.4 KEGG Pathway顯著性富集分析。經過多重檢驗校正后，可獲得差異表達基因中顯著富集的Pathway（Q≤0.05）。

2 結果與分析

2.1 差異基因篩選

以淮豬為對照，大約克豬與之相比，差異表達基因中有67個上調基因，54個下調基因（圖1）。

2.2 差異表達基因的GO功能顯著性富集

GO廣泛應用于轉錄組數據分析中［9］。通過GO功能顯著性富集分析發現，已注釋的豬卵泡差異表達基因有745個，其中有336個基因參與生物學過程、所占比例為45.10%，有110個基因參與分子功能，所占比例為14.77%及有299個基因參與細胞組分，所占比例為40.13%。由此可以推測，生物學過程在淮豬和大約克豬繁殖性狀差異中起著重要作用。

差異表達基因參與的顯著性（P<0.05）生物過程主要包括繁殖過程，生長過程及代謝過程等；細胞組分主要表現在細胞外基質、細胞外復合體等；分子功能主要表現在分子轉化活性、分子功能調節及信號轉導活性等（圖2）。

2.3 差異表達基因的KEGG Pathway功能顯著性富集

KEGG數據庫記錄基因產物的相互作用網絡［10］。通過KEGG pathway信號通路分析發現，有23 948個差異表達基因，參與了110條生物學代謝通路，其中主要參與繁殖方面的通路包括WNT信號通路、卵巢類固醇生成因子及類固醇生物合成通路等（圖3）。

3 討論

該研究選用在產仔性狀等方面存在較大差異的淮豬和大約克豬的卵泡組織進行轉錄組測序，篩選與繁殖性狀相關的基因。結合GO和KEGG pathway對獲得的淮豬與大約克豬卵泡組織間差異表達基因進行分析，結果發現：一些顯著通路和生物過程如WNT信號通路、卵巢類固醇生成及類固醇生物合成通路等中的差異基因在淮豬與大約克豬中表達差異較大，其可能與淮豬和大約克豬產仔數性狀的差異有關。

卵巢類固醇生成通路在豬發情排卵過程中發揮著重要作用，進一步證實高產仔淮豬和低產仔大約克豬在排卵前卵泡間存在激素調節系統方面的差異。在卵巢類固醇生成通路上，高產仔淮豬成熟卵泡組織中的CYP19A3、LDLR、BMP15基因均呈上調表達趨勢，即雌二醇被促進生成，母豬產仔數又受到雌二醇表達量的影響［11］。還參與類固醇激素和固醇的生物合成的有細胞色素P450，有研究者表明，細胞色素P450在生殖激素調節中扮演著重要角色［12］。該研究發現，與豬繁殖性能相關的細胞色素P450家族基因有CYP19A3基因在卵巢類固醇生成通路上高表達，說明這個基因對高產仔的淮豬在卵泡生長發育過程中有顯著影響。

LDLR基因是一種細胞表面糖蛋白，廣泛存在于體內組織細胞中，其在卵巢、睪丸等甾源性組織脂蛋白代謝中發揮著重要作用，但其在各組織或細胞中活性差別較大。大量研究發現，LDLR基因的多態性與血脂水平有密切關系，血脂異常與很多疾病有密切關系［13-14］。有研究表明，LDLR基因對小鼠的卵巢發育方面具有調節作用，并參與卵巢內脂肪代謝的調控［15］，還可以在一程度上影響家禽的繁殖能力和蛋品品質［16-18］。卵巢中的載脂蛋白LDLR作為細胞膜表面轉運膽固醇的特異性受體，利用血液中的脂蛋白在卵巢中合成膽固醇，而膽固醇是卵泡和黃體分泌激素的重要反應底物，對卵泡的發育以及黃體正常功能的維持起到重要作用［19-20］。

BMP15基因主要參與卵泡生長發育過程。有不同研究者發現，BMP15基因在小鼠的垂體中［21］，在蒙古牛的卵巢、子宮、輸卵管和腎臟組織中均有表達［22］。BMP15與促卵泡生長激素FSH能夠通過 TGFβRII 抑制促卵泡生長激素受體FSHR表達，進而抑制促卵泡生長激素 FSH 的表達［22-24］。BMP15 蛋白是一種卵母細胞分泌因子，在雌性動物卵母細胞中特異性表達，且其表達量與卵泡生長發育相關［25］。BMP15基因作為顯著影響羊繁殖性狀的主效基因之一，其多態性與多羔性狀密切相關［26］。

參考文獻

［1］ 聞愛友，桑仁富，戴四發，等.定遠母豬繁殖性能及其雜種優勢研究［J］.安徽技術師范學院學報，2005，19（4）：5-7.

［2］ Lockhart D J，WINZELER E A.Genomics，gene expression and DNA arrays［J］.Nature，2000，405（6788）：827-836.

［3］? ZHANG G J，GUO G W，HU X D，et al.Deep RNA sequencing at single base-pair resolution reveals high complexity of the rice transcriptome［J］.Genome research，2010，20（5）：646-654.

［4］? XIANG L X，HE D，DONG W R，et al.Deep sequencing-based transcriptome profiling analysis of bacteria-challenged Lateolabrax japonicus reveals insight into the immune-relevant genes in marine fish［J］.BMC genomics，2010，11（1）：1-21.

［5］? MORTAZAVI A，WILLIAMS B A，MCCUE K，et al.Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq［J］.Nature methods，2008，5（7）：621-628.

［6］? 楊亞嵐.不同品種豬骨骼肌表型差異的全基因組甲基化調控研究［D］.北京：中國農業科學院，2013.

［7］? CHEN S F，ZHOU Y Q，CHEN Y R，et al.fastp：An ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor［J］.Bioinformatics，2018，34（17）：i884-i890.

［8］? ROBINSON M D，MCCARTHY D J，SMYTH G K，et al.edgeR：A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data［J］.Bioinformatics，2010，26（1）：139-140.

［9］? CONESA A，GTZ S.Blast2GO：A comprehensive suite for functional analysis in plant genomics［J］.International journal of plant genomics，2008，2008：1-13.

［10］? KANEHISA M，GOTO S.KEGG：Kyoto encyclopedia of genes and genomes［J］.Nucleic acids research，2000，28（1）：27-30.

［11］ ROBIC A，FARAUT T，PRUNIER A.Pathways and genes involved in steroid hormone metabolism in male pigs：A review and update［J］.The journal of steroid biochemistry and molecular biology，2014，140：44-55.

［12］ KANDIEL M M M，WATANABE G，TAYA K.Ovarian expression of inhibin-subunits，3β-hydroxysteroid dehydrogenase，and cytochrome P450 aromatase during the estrous cycle and pregnancy of Shiba goats（Capra hircus）［J］.Experimental animals，2010，59（5）：605-614.

［13］ 張明明，馬倩，王俊明，等.低密度脂蛋白受體第12外顯子基因突變與高膽固醇血癥的關系［J］.山東醫藥，2011，51（17）：45-46.

［14］ 張明明，霍麗靜，孫海娟，等.高膽固醇血癥患者LDL-R基因Xsp I位點多態性與血清IL-6的關系及意義［J］.臨床檢驗雜志，2011，29（8）：596-598.

［15］ GUO T，ZHANG L，CHENG D，et al.Low-density lipoprotein receptor affects the fertility of female mice［J］.Reproduction， fertility and development，2015，27（8）：1222-1232.

［16］ WALZEM R L，CHEN S E.Obesity-induced dysfunctions in female reproduction：Lessons from birds and mammals［J］.Advances in nutrition，2014，5（2）：199-206.

［17］ HO K J，LAWRENCE W D，LEWIS L A，et al.Hereditary hyperlipidemia in nonlaying chickens［J］.Archives of pathology，1974，98（3）：161-172.

［18］ YAO J F，CHEN Z X，XU G Y，et al.Low-density lipoprotein receptor-related protein 8 gene association with egg traits in dwarf chickens［J］.Poultry science，2010，89（5）：883-886.

［19］ WILTBANK M C，DISKIN M G，FLORES J A，et al.Regulation of the corpus luteum by protein kinase C.II.Inhibition of lipoprotein-stimulated steroidogenesis by prostaglandin F2 alpha.［J］.Biology of reproduction，1990，42（2）：239-245.

［20］ MILLER W L，AUCHUS R J.The molecular biology，biochemistry，and physiology of human steroidogenesis and its disorders［J］.Endocrine reviews，2011，32（1）：81-151.

［21］ OTSUKA F，SHIMASAKI S.A negative feedback system between oocyte bone morphogenetic protein 15 and granulosa cell kit ligand：Its role in regulating granulosa cell mitosis［J］.Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America，2002，99（12）：8060-8065.

［22］ 何小龍，高連枝，王峰，等.骨形態發生蛋白15基因mRNA在牛不同組織中的表達分析［J］.畜牧與飼料科學，2009，30（2）：129-131.

［23］ OTSUKA F，INAGAKI K.Unique bioactivities of bone morphogenetic proteins in regulation of reproductive endocrine functions［J］.Reproductive medicine and biology，2011，10（3）：131-142.

［24］ MA X P，YI H S.BMP15 regulates FSHR through TGF-β receptor II and SMAD4 signaling in prepubertal ovary of Rongchang pigs［J］.Research in veterinary science，2022，143：66-73.

［25］ CHANG H，BROWN C W，MATZUK M M.Genetic analysis of the mammalian transforming growth factor-beta superfamily［J］.Endocrine reviews，2002，23（6）：787-823.

［26］ 馮濤，趙有璋，儲明星，等.濟寧青山羊多羔性候選基因BMP15的研究［J］.畜牧獸醫學報，2009，40（4）：468-475.